藥學中的生物技術(shù)和方法ADMET方法課件

1、藥學中的生物技術(shù)和方法ADMET方法什么是ADMET Absorption 吸收 Distribution 分布 Metabolism 代謝 Excretion 排出 Toxicity 毒性 ADME是藥物動力學(Pharmacokinetics, PK)的內(nèi)容藥物研發(fā)的并行策略合成化合物或分離天然產(chǎn)物 生物活性 生物選擇性 物理化學性質(zhì) 藥物吸收 藥物代謝 大分子結(jié)合 細胞毒性 優(yōu)化的優(yōu)化的先導化合物先導化合物候選藥物現(xiàn)代ADMET研究方法的特點 基于細胞或生物大分子的分析方法 人源材料的應(yīng)用 小樣品、高內(nèi)涵和高通量分析能力 能夠闡明藥物性質(zhì)的分子機理、建立結(jié)構(gòu)-藥物性質(zhì)定量構(gòu)效關(guān)系合理藥物

2、運輸/制劑系統(tǒng) 以往的研究表明：藥物運輸系統(tǒng)只能輔助而不能根本性的改變藥物的口服吸收能力 合理的藥物運輸/制劑系統(tǒng)(rational drug delivery)必須依據(jù)藥物本身的穿越消化腸道屏障的滲透能力BCS系統(tǒng)FDA制定了BCS的評價指南。BCS的評價主要包括下列三個方面： 藥物的生物滲透能力（藥物的生物滲透能力（permeability） 藥物的溶解能力（藥物的溶解能力（Solubility） 制劑的快速溶出能力（制劑的快速溶出能力（Immediate Release）上述性質(zhì)符合要求的藥物/制劑可以在藥審時得到生物豁免。藥物吸收吸收屏障結(jié)構(gòu)底側(cè)（Basolateral）頂側(cè)（Apic

3、al） 經(jīng)細胞連接的被動擴散Paracellular diffusion穿細胞穿細胞被動擴散被動擴散Transcellular diffusion代謝轉(zhuǎn)化A B外流外流Efflux藥物轉(zhuǎn)運藥物轉(zhuǎn)運transportACD藥物消化道吸收的基本機制體外單層腸上皮細胞藥物吸收模型腸上皮細胞/細胞系組織/細胞培養(yǎng)多空膜基底吸收細胞單層Transwell細胞培養(yǎng)板已被認證的用于藥物吸收的細胞系 Caco-2 人結(jié)腸腺癌細胞 具有分化的腸上皮細胞特征和重要的藥物轉(zhuǎn)運與代謝酶 MDCK 狗腎上皮細胞系Caco-2藥物吸收模型的創(chuàng)建人Dr. R.T. Borchardt和他的部分研究團隊Caco-2模型的制備

4、過程細胞培養(yǎng)Transwell接種細胞匯合細胞分化完備細胞收集2-3天2-3天23星期藥物吸收測試試驗結(jié)果-滲透能力 吸收較好的藥物： Papp 210-6 Testosterone：1.010-5 cm/s Propranolol: 2.8610-5cm/s 吸收差藥物： Papp 10-6 Mannitol：1.010-7 cm/s Atenolol: Papp= 4.5510-7 cm/sBrain Blood Barrier（BBB）BBB結(jié)構(gòu)內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的相互作用 星形膠質(zhì)細胞毛細血管內(nèi)皮細胞促進細胞緊密連接誘導一些酶和分子轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生長毛細血管內(nèi)皮細胞星形膠質(zhì)細

5、胞趨化現(xiàn)象表型的調(diào)節(jié)BBB滲透機理influxefflux緊密連接（tight junction）的結(jié)構(gòu)AP端：血液BL端：腦實質(zhì)毛細血管內(nèi)皮細胞膠質(zhì)細胞神經(jīng)膠質(zhì)細胞毛細血管內(nèi)皮細胞基底膜多孔聚碳酯膜藥物排出藥物清除藥物清除 = 代謝代謝 + 排出排出腎排出：超濾機制游離小分子藥物及其代謝物腎小球腎小管藥物重吸收大分子化合物大分子結(jié)合藥物腎排出因素：PPB 和 Papp0.30.40.50.60.70.80.91.01.10.00.20.40.60.81.0atenololethosuximideguanethidinemeprobamateparaceutamolpromidoneUrine

6、 excrection factorAbsorption fraction(Absorption fraction 0.9)(PPB0.05)0204060801000.00.20.40.60.81.0warfarinrifampincinminocyclinedapsonechloramphenicolpyrrocloxycyclinesulfadiazineamoxicilincefaloglycincindamycincolfibrateprocainamideUrine excreation ratePPB膽汁分泌和腸肝循環(huán)MetabolismEnterohepatic circula

7、tionpravastatinADPATPSmall IntestineAbsorptionHepatic uptakeBiliary excretioncMOAToatpLiverBinding to HMG-CoA reductaseDrugBinding to cytoplasmic proteins肝臟處置藥物的基本途徑膽汁NTCPOATPsOAT2OATP2MRPsMDR1BCRPBSEP/SPGP腸道藥物藥物代謝物Basal（blood）Apical（bile）OATP2MDCKII(Sasaki, M., Sugiyama, Y. et al. J.Biol. Chem. 277

8、(8), 6497-6593 (2002) 藥物經(jīng)膽汁排出的細胞模型- OATP2/MRP2 雙轉(zhuǎn)染 MDCK細胞單層MRP2/cMOAT藥物的肝臟代謝藥物代謝的基本過程藥物R氧化產(chǎn)物R-OH結(jié)合產(chǎn)物R-O-X排出物I相代謝II相代謝II+相代謝：藥物外流II相代謝水解產(chǎn)物X = glucose sulfate methionine cysteine glutathione I相代謝關(guān)鍵酶-細胞色素P450 細胞色素P450 (CYP)家族 CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 NADPH依賴的氧化酶 CYP3A4

9、 是藥物的主要代謝酶 50%已知藥物通過CYP3A4代謝II 相代謝關(guān)鍵酶 UDP-依賴葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT) 苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶 (PST) 雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶 (EST) 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 一些細胞抗氧化酶 三種肝細胞制品及代謝分析全肝細胞代謝分析全肝細胞代謝分析肝微粒體代謝分析肝微粒體代謝分析S-9肝勻漿液肝勻漿液代謝分析代謝分析藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析過程藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析結(jié)果% 原藥消失率 = （1 - ）100%原始藥物濃度c0代謝反應(yīng)后藥物濃度ct全肝細胞全肝細胞()肝微粒體肝微粒體() 僅包括I相代謝酶 易于保存 分析操作容易、費用低 包括所有代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白

10、費用高，細胞保存不易S9肝勻漿液肝勻漿液() 包括主要I、II相代謝酶 分析操作容易、費用低 勻漿液保存不穩(wěn)定藥物毒性藥物毒性評價的基本方式-細胞活力分析 細胞生長 細胞能荷 線粒體活性線粒體活性-MTT分析分析 細胞氧化還原狀態(tài)細胞氧化還原狀態(tài)-谷胱甘肽含量分析谷胱甘肽含量分析 細胞特征性功能 蛋白質(zhì)合成 核酸合成 吞噬、排除外來分子能力等 細胞膜完整性細胞膜完整性-胞漿酶活性分析胞漿酶活性分析MTT細胞活力分析 原理： 線粒體酶將探針分子MTT*還原成為一種藍色脂溶性染料formazan（吸收波長550nm） 線粒體活性越高，轉(zhuǎn)化能力越強 實驗方法：將MTT加入到細胞培養(yǎng)液中，反應(yīng)一段時間

11、后，用有機溶劑溶解產(chǎn)生的formazan，然后用酶標儀測定 550 nm吸光度. 特點：方法簡單可靠，費用低，高通量* MTT：3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide藥物毒性分析過程LD50，IC50，EC50線粒體毒性模型 Early Prediction of Hepatotoxicity Through Technological Development World Pharmaceutical Congress, June, 2010 ROSATP synthesisCyt cDjm關(guān)于藥物毒性分析數(shù)據(jù)

12、 毒性分析的結(jié)果是LD50或IC50或EC50，表示藥物導致細胞活力降低一半時需要的濃度 LD50或IC50或EC50越小，藥物毒性越大 每種細胞活力分析方法都具有片面性，多種方法測定一種化合物毒性是有益的 進行藥物毒性分析時，推薦使用人源的原代完整肝細胞，數(shù)據(jù)可靠性高 當使用永生化細胞和腫瘤細胞時，由于這些細胞(特別是腫瘤細胞)的藥物代謝能力較差，因此得到的細胞毒性數(shù)據(jù)是一種“本征毒性(intrinsic toxicity)”。將實驗數(shù)據(jù)推廣應(yīng)用時，注意補償不同組織細胞的代謝能力。藥物毒性和藥物-藥物相互作用 排出抑制型相互作用： 藥物1抑制藥物2的排出，導致藥物2濃度過高產(chǎn)生毒性 代謝抑制

13、型相互作用 藥物1抑制藥物2的代謝，導致藥物2濃度過高產(chǎn)生毒性 代謝誘導型相互作用 藥物2誘導藥物2的代謝，導致 藥物2被過度活化，使代謝毒性產(chǎn)物濃度增加 藥物2因代謝失效小結(jié)：ADMET研究諸方面ADME：生物利用率藥物間相互作用藥物分布血漿蛋白結(jié)合力血腦屏障滲透能力藥物清除藥物吸收消化道穩(wěn)定性腎排出肝臟清除代謝穩(wěn)定性膽汁排出溶解性滲透能力代謝誘導代謝抑制藥物毒性T細胞活力抑制分析排出抑制擴散能力藥物外流載體藥物吸收載體代謝酶亞型一個例子- 食物中的黃酮類化合物食物成分黃酮類化合物及其作用 雌激素樣作用 弱類雌激素活性 防治一些和激素水平下降有關(guān)的疾病，如衰老、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、血脂升

14、高等 抗雌激素活性 預(yù)防激素依賴型腫瘤及心血管疾病的發(fā)生。 抗氧化作用 抑制腫瘤作用 降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂，預(yù)防心血管疾病和老年性癡呆癥 OOR5R7A (1-25)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7B (26-29)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7C (30-34)R8R6R2R4R3R5OOR5R7A (1-25)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7B (26-29)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7C (30-34)R8R6R2R4R3R5黃酮通式異黃酮通式黃酮苷和黃酮苷元大豆異黃酮苷元大豆異黃酮葡萄糖甙水解b-葡萄糖苷酶（腸道微生物）腸道乳糖-根皮素水解酶O黃酮類化合物的吸收代謝機制黃酮苷黃酮苷元水解CYPs 代謝分解MRP2BCRPUGTSulT緊密連接MRP3酶水解酶水解肝、腎排出肝、腎排出黃酮類化合物吸收的關(guān)鍵因素 黃酮苷的水解-利于吸收因素 腸道正常細菌群 黃酮苷元的代謝穩(wěn)定性-不利于吸收因素 II相代謝和II+向外排出 I相氧化分解 解決方法： 混合黃酮制劑 苷元羥基甲基化思考題 什么是ADMET研究，在藥物發(fā)現(xiàn)中的作用是什么？ 現(xiàn)代ADMET方法有什么特點？ 什么是BCS？ 藥物消化道吸收的分子