細胞培養(yǎng)技術(shù)原理與應(yīng)用

1、 細胞培養(yǎng)技術(shù)原理與應(yīng)用研究進展：鵬 學(xué)號：158033038 專業(yè)：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)摘要：細胞培養(yǎng)是指將采集體組織的細胞模擬體生長環(huán)境，放置在無菌、一定營養(yǎng)條件、適宜的溫度與酸堿度下，使其生長、繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)，已成為生物、醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法。文章對細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用作一綜述。關(guān)鍵詞：細胞培養(yǎng)；應(yīng)用；研究進展細胞是構(gòu)成機體的基本單位，是生命活動的基本單位。一切有機體（除病毒）都是由細胞組成的。細胞具有獨立的、有序的自控代體系。因此，對細胞的深入研究是揭開生命奧秘、征服疾病的關(guān)鍵。細胞培養(yǎng)是指將采集體組織的細胞模擬體生長環(huán)境，放置在無菌、一定營養(yǎng)條件、適宜的溫

2、度與酸堿度下，使其生長、繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)。細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是可以直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生命活動與其變化；提供大量生物性狀相似的試驗對象，特別是研究大型動物（奶牛）時具有耗資少的優(yōu)點。但模擬體環(huán)境仍與實際有很大的差異，因此利用細胞培養(yǎng)技術(shù)的試驗結(jié)果不可以輕易做出與體等同的結(jié)論。動物組織（細胞）培養(yǎng)開始于20世紀初，現(xiàn)已成為生物、醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法1 。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)研究。20 世紀 60 年代，該技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動物的病毒分離和純化，對于魚類疾病的防治具有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)單一種子細胞難以完成構(gòu)建復(fù)雜組織的需要，因此

3、產(chǎn)生了聯(lián)合培養(yǎng)細胞技術(shù)。聯(lián)合培養(yǎng)下的細胞之間存在著精細的相互調(diào)控關(guān)系，因而更符合仿生學(xué)的原理且更有利于種子細胞的增殖與分化，為復(fù)雜的細胞誘導(dǎo)分化以與體外組織構(gòu)建提供了新思路、新方法2 。1 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是將活體組織或細胞從試驗動物體取出，放在模擬體生存環(huán)境的體外環(huán)境（無菌、適溫、營養(yǎng)豐富）中，使高體細胞生長、發(fā)育的一種方法。按照培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分不同，將其分為組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)與器官培養(yǎng)等。根據(jù)細胞是否在支持物上生長，將其分為貼壁型和懸浮型。一般來說，圓形細胞如淋巴細胞屬于懸浮型，而胞體梭型（成纖維型細胞）、扁平不規(guī)則（上皮型細胞）等屬于貼壁型，貼壁型細胞必需貼附在支持物表面生長。細胞培養(yǎng)開始

4、于 1906 年，Harrison 用蛙新鮮淋巴液培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織 4 周，首次成功地利用體外培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)元，標志著組織細胞的體外培養(yǎng)模式的基本建立。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，20 世紀 50 年代進入繁盛階段，細胞培養(yǎng)逐漸被基礎(chǔ)研究與應(yīng)用領(lǐng)域所應(yīng)用，特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到迅速的發(fā)展。目前，細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)涉與到生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護等領(lǐng)域 3 。目前，在細胞培養(yǎng)過程中，只能根據(jù)離體細胞的特點和培養(yǎng)條件，提供滿足其生長和發(fā)育的一些基本生理條件。必須在無菌條件下進行，細胞感染微生物后，會因被奪營養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致細胞生長緩慢或停滯，甚至死亡。需要提供適宜的溫度和pH，一般哺乳動物細胞培養(yǎng)的溫度

5、控制在37 ，魚類的溫度要低一些。溫度過高或過低時，均不利于細胞生長甚至?xí)?dǎo)致細胞死亡。動物細胞最適宜pH一般控制在 7.27.4，在此圍細胞生長活躍，增殖速度快，如果過低或過高性，細胞會因為細胞膜受損而死亡。細胞離體培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是細胞培養(yǎng)液的設(shè)計，理想的細胞培養(yǎng)液可以同時解決細胞離體培養(yǎng)所需要的pH、滲透壓、營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)物質(zhì)的全部需要。細胞培養(yǎng)液中需含有細胞增殖、生長所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)。如提供能量的物質(zhì)（N源、C源）、代調(diào)節(jié)控制的物質(zhì)（無機鹽、維生素、激素）。另外，在細胞培養(yǎng)過程中需要提供一定量的氣體（O2和CO2）。CO2具有調(diào)節(jié)pH和緩沖的作用，一般提供 5% CO2。2 細胞培養(yǎng)

6、技術(shù)的應(yīng)用研究2.1 在病毒學(xué)中的應(yīng)用培養(yǎng)細胞為病毒的增殖提供了場所，細胞是分離病毒的基質(zhì)，體外培養(yǎng)細胞無抗體與非特異頡頏物質(zhì)的影響，而且對病毒的敏感性較體細胞高，可采用離心感染法或提取病毒核酸進行感染，并以細胞打孔器協(xié)助感染擴大病毒感染的宿主圍，使病毒感染指標容易觀察，光學(xué)顯微鏡下就可見到包涵體、細胞融合等現(xiàn)象，同時也便于用分子病毒學(xué)技術(shù)進行檢測。乙肝病毒（BV）的感染可引發(fā)急、慢性病毒性肝炎，還與肝硬化、肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。肝源細胞模型對研究BV生物學(xué)特性、BV的致病機制、BV基因組的復(fù)制、表達和調(diào)控、體外抗病毒藥物的篩選發(fā)揮了重要作用，大大促進了對 BV的研究4。通過細胞培養(yǎng)

7、技術(shù)，可了解豬輪狀病毒的培養(yǎng)特性，建立其分離方法以與FQ-PCR檢測方法，為研發(fā)診斷試劑盒和疫苗奠定基礎(chǔ)。使用細胞培養(yǎng)研究魚類病毒可以減少隱性感染機率和個體差異引起的誤差，使試驗結(jié)果更加準確迅速，可建立細胞株（系）分離和鑒定魚類病毒，進行生物學(xué)、病理學(xué)和流行病學(xué)研究，具有非常重要的意義5-6。2.2 在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用腫瘤是機體在致癌因子的作用下，組織中的細胞失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物。目前對于各種癌癥還沒有有效的藥物來治療，腫瘤研究的首要任務(wù)是明確致癌機制。細胞培養(yǎng)技術(shù)使研究人員能夠清楚地認識正常細胞、癌前病變細胞、生命有限的腫瘤細胞以與完全轉(zhuǎn)化或永生化的腫瘤細

8、胞的生物學(xué)特征，這些逐級進化的細胞是體外研究多階段致癌機制的基礎(chǔ)。體外血管模型主要研究血管的生理和病理以與藥物的作用，根據(jù)培養(yǎng)方式不同可以分為二維和三維血管7-8。徐燕等利用人卵巢癌（ODMCs）微血管皮細胞的培養(yǎng)用抗CD31 的免疫磁珠與皮細胞特異性結(jié)合的原理，分離獲得了高純度可傳代并具有體外二維管腔樣結(jié)構(gòu)形成特性的 ODMCs，建立起簡便快速的卵巢癌微血管皮細胞體外培養(yǎng)體系，為后續(xù)研究卵巢癌抗血管生成提供了良好的試驗材料9。馬曉雯等建立一種有效培養(yǎng)人肺腺癌A549Sphere細胞的方法，并在A549 Sphere 細胞中初步證明了人肺腺癌中可能存在腫瘤干細胞，這些Sphere細胞可富集干細

9、胞樣細胞，抗化療藥物的能力也增強。不僅為分離A549細胞中的腫瘤干細胞提供一種可能的有效途徑，也為理解臨床肺腺癌治療的耐藥性提供了新思路10。2.3 在藥理學(xué)中的應(yīng)用細胞培養(yǎng)在藥理學(xué)中的應(yīng)用比較廣泛。通過培養(yǎng)細胞的生長曲線可計數(shù)細胞增長的絕對指數(shù)，從而可以直觀地了解細胞生長與死亡的動態(tài)變化，一般用于檢測各種藥物對細胞生長的影響。利用培養(yǎng)細胞的放射自顯技術(shù)，研究細胞的物質(zhì)代、動態(tài)變化和細胞周期等，對于藥物作用機制的研究有重要作用。細胞培養(yǎng)可用于抗動脈粥樣硬化、血糖等藥物的研究等應(yīng)用。目前，體外培養(yǎng)活的心肌細胞已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)方面的研究。此方法通過對心肌細胞的培養(yǎng)，可以觀察各種藥物對其直接作用

10、和對活細胞影響的動態(tài)過程，深入研究藥物對心肌細胞的離子轉(zhuǎn)運的影響，建立各種心肌細胞損傷模型，利于探討藥物的作用機制。此外，還具有簡便、準確、快捷、節(jié)約動物和藥品等特點，可大幅提高研究效率。陽海鷹等利用試驗建立的新生小鼠心肌細胞體外培養(yǎng)方法，結(jié)果表明，單細胞收獲率和心肌細胞純度高，心肌細胞搏動時間長；并應(yīng)用此細胞模型觀察了鐮刀菌毒素丁烯酸酯（BUT）對心肌的毒性作用，證明具有結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好等優(yōu)點11。這不僅為毒理學(xué)，還為藥理學(xué)研究提供了一個較好的實驗?zāi)Ｐ汀?.4 在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用細胞培養(yǎng)作為細胞生物學(xué)乃至生物學(xué)研究的重要技術(shù)，在生物領(lǐng)域中占有重要地位。動物組織（細胞）培養(yǎng)開始于20世紀初，

11、發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法，目前這項技術(shù)也廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)的研究。球蟲是一類寄生于雞等動物腸道上皮細胞引起的一種原蟲，廣泛分布于世界各地，是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。而細胞培養(yǎng)為球蟲研究提供潔凈無污染的環(huán)境，為研究抗球蟲藥物的作用機制、活性以與球蟲的發(fā)育、行為、結(jié)構(gòu)、免疫、遺傳、細胞化學(xué)和生物化學(xué)等方面提供更有效的研究工具12。在魚類方面，利用細胞克隆技術(shù)可以培育出新品種，還可以通過細胞培養(yǎng)技術(shù)對于魚類病毒的分離、鑒定和增殖，病毒抑制和復(fù)制途徑的阻斷等方面具有重要作用。Nicolajsen 等證明，虹彩病毒在BF-2、EPC、CHSE-214、RTG-2、FHM

12、等5種細胞系均有較好的繁殖，這為研究宿主和病原之間的機理提供了幫助13。凱等研究通過獲得較高純度的牦牛子宮肉阜上皮細胞并進行培養(yǎng)，可為牦牛胎兒與母體之間的相互調(diào)控與物質(zhì)運輸提供簡捷的研究平臺14。2.5 在其他方面的應(yīng)用細胞培養(yǎng)技術(shù)可用于有毒物質(zhì)的毒性機理的研究?？衫皿w外培養(yǎng)動物細胞來研究氟化物的毒性機制15。木脂素類、黃酮等活性物質(zhì)是植物的次生代產(chǎn)物，其具有抗腫瘤、抗氧化等多種功能，現(xiàn)在可以利用細胞培養(yǎng)技術(shù)從植物細胞獲取。利用連翹葉子的懸浮細胞可進行培養(yǎng)提取木脂素；可利用銀杏液體懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮、藥材金鐵鎖細胞培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷等16-21。除此之外，細胞培養(yǎng)在生產(chǎn)疫苗方面也做出了貢獻。法國

13、巴斯德研究所和美國西奈山醫(yī)學(xué)中心就在哺乳動物細胞中成功表達了乙肝表面抗原。我國也成功研制了由中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞系表達的基因工程乙肝疫苗。3 小結(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過不斷的研究和完善，已經(jīng)成為實驗室常用的研究方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域。目前，動物細胞培養(yǎng)可以降低試驗成本、避免浪費等優(yōu)點也逐漸應(yīng)用于在動物生產(chǎn)中。但細胞培養(yǎng)只是在模擬機體的生理環(huán)境，使細胞維持生長、繁殖的技術(shù)，相對于機體這個系統(tǒng)來講，存在很大的差異，會導(dǎo)致細胞或組織的形態(tài)或功能發(fā)生不同程度的改變，因此試驗的結(jié)果不能等同于在體研究的結(jié)果。參考文獻1勇.細胞培養(yǎng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用J.才", 2011 (18)：

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