酶循環(huán)法及其在酶法分析中的應(yīng)

1、酶循環(huán)法及其在酶法分析中的應(yīng)用楊昌國，許葉(寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江寧波315010)關(guān)鍵詞：酶法分析；酶循環(huán)法中圖分類號(hào)： R461.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 由于酶法測(cè)定的特異性好，檢測(cè)簡便，反應(yīng)溫和，無污染，且靈敏度較高(10 100umol/L) ，已能滿足體液中大部分物質(zhì)的測(cè)定，因此在臨床化學(xué)測(cè)定中已廣為應(yīng)用。隨著臨床化學(xué)的發(fā)展，體液中某些微量物質(zhì) 的準(zhǔn)確測(cè)定逐漸顯得重要。酶循環(huán)法是利用酶的底物特異性來放大靶物質(zhì)(被測(cè)物)的測(cè)定方法。此法僅 循環(huán)靶物質(zhì)，減少了樣品中存在的其它物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，因此不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或隊(duì)靶物質(zhì)的提 取，而且該法不需要專門的設(shè)備，是一種前景廣闊的測(cè)定技

2、術(shù)。日本旭化成( Asahi Chemical )公司發(fā)展 了這一技術(shù)，筆者參考旭化成公司的有關(guān)資料，將這一技術(shù)介紹給國內(nèi)的同行。1 酶循環(huán)法的原理物質(zhì)A在酶a和底物 a(Sa)的存在下轉(zhuǎn)化為物質(zhì) B，同時(shí)生成產(chǎn)物 a(Pa) ；這物質(zhì) B又在酶 b(Eb)和底物 b(Sb) 的存在下轉(zhuǎn)化為物質(zhì) A，同時(shí)生成產(chǎn)物 b(Pb) 。上述反應(yīng)每循環(huán)一次，將消耗與物質(zhì)A等量的 Sa和 Sb，同時(shí)生成等當(dāng)量的 Pa和 Pb。因此在一定時(shí)間內(nèi)，循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)亦就是Sa和 Sb消耗或 Pa和 Pb生成相當(dāng)于物質(zhì) A(或物質(zhì) B)的倍數(shù)，通過檢測(cè) Sa或 Sb 的減少或 Pa或 Pb的生成就可以提供檢測(cè)物質(zhì)

3、A(或物質(zhì) B) 的 n 倍靈敏度。見圖 1 。底物 a(Sa) 產(chǎn)物 a(Pa)產(chǎn)物 b(Pb) 底物 b(Sb)圖1 酶循環(huán)法原理1.1 條件Sa1.1.1 物質(zhì) A和B的濃度與酶 a和酶 b對(duì)底物 Sa和Sb的Km值相比較，應(yīng)相當(dāng)小，即 A或B KmSa(或 KmSa) 。1.1.2 酶 a和酶 b對(duì)底物 Sa和 Sb的 Km值應(yīng)相當(dāng)小，對(duì)底物應(yīng)有高親和力。1.2 原理 米氏方程 v V?S/( S+Km) ，vK?S ，(KV/Km)。當(dāng) t 0、A=A 0 、B=0 時(shí)，A B A0 ；當(dāng)t 0并假設(shè)反應(yīng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，那么， Ea的速度是 VbKbA 。Eb的速度是 VbKbB 。

4、 在平衡狀態(tài)時(shí)， vavb 因此，A:B=Kb:Ka 。循環(huán)反應(yīng)速度 vc va vb( 固定的 )，假設(shè) vc KcA 0(Kc= 循環(huán)速率常數(shù) )，那么從 KcKa?Kb/(Ka+Kb) 推導(dǎo)，如果 Ka+Kb常數(shù)，當(dāng) KaKb時(shí)， Kc 是最大的。t1.3 測(cè)定靈敏度 Pa Pb Vcdt Kc A0 t0 。02 酶循環(huán)反應(yīng)的靈敏度 可通過產(chǎn)物的循環(huán)常數(shù) (Kc) 和反應(yīng)時(shí)間 (t) 來確定； Kc 又可通過兩種酶的量來確定；酶量又取決于酶 的特異活性和 Km值，循環(huán)反應(yīng)是在相同的條件 (如溫度、離子強(qiáng)度等 )下進(jìn)行， 兩種酶的反應(yīng)常數(shù)亦相 同( 由于 Va/Kma=Vb/Kmb，因此

5、 Kc Ka Kb)。既然循環(huán)反應(yīng)的靈敏度可通過Kc× t(min) 來確定，故可用調(diào)整加入酶量或反應(yīng)時(shí)間來隨意控制。選擇Km小的酶，用較小的酶就能得到較高的靈敏度。3 循環(huán)反應(yīng)的類型按反應(yīng)中使用的酶可分四種類型：3.1 方法 A 底物循環(huán)，氧化酶和脫氫酶系統(tǒng)。氧化酶對(duì)靶物質(zhì)氧化，脫氫酶又把氧化態(tài)的靶物質(zhì)轉(zhuǎn)化成 還原態(tài)。靶物質(zhì)和它的氧化產(chǎn)物作為底物被循環(huán)，速率可達(dá)50 300 次/ 分。舉例：溶血卵磷脂（lysolrcithin）（ 又稱溶血磷脂酰膽堿， lysophosphatidyl choline） ，是磷脂的一種， 它隨氧化型 LDL 和 VLDL 水平增高而增高，后兩者已確

6、認(rèn)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。測(cè)定原理見圖2。預(yù)處理反應(yīng)：甘油 O2 GO H 2O2甘油醛測(cè)定反應(yīng)：(1) 溶血卵磷脂 LYPL(2) GPC H 2O GP(3)O2 H2O2GPC脂肪酸G3P膽堿DAOS4-AAPDAOS（比色測(cè)定）G3PD循HA環(huán)PGO：甘油氧化酶LYPLGPC：甘油磷脂酰膽堿GPCPG3P： 3磷酸甘油GPODHAP：磷酸二羥丙酮G3PDH12-HSD：12- 羥類固醇脫氫酶DAOS胺圖 2 溶血卵磷脂酶循環(huán)法原理：溶血磷脂酶：磷酸二酯酶：甘油磷酸氧化酶：3磷酸甘油脫氫酶：N-乙基-N-（2- 羥基-3- 磺丙基 ）-3,5- 二甲氧苯NAD NADH12 -H

7、SD膽堿酮類膽酸3.2 方法 B 底物循環(huán)，脫氫酶和輔酶系統(tǒng)。靶物質(zhì)和它的氧化產(chǎn)物作為底物被循環(huán)，僅用一種酶和兩種輔 酶（巰基 NAD和 NADH。） 在 410nm測(cè)定巰基 NADH的增高速率，循環(huán)速率約 100 次/分。舉例：膽汁酸測(cè) 定，原理見圖 3。巰基 -NAD巰基 -NADH（415nm測(cè)定 ）膽汁酸 循環(huán) 酮類膽汁酸-HSDNAD NADH3-HSD：3- 羥類固醇脫氫酶圖3 膽汁酸酶循環(huán)法測(cè)定原理3.3 方法 C 輔酶循環(huán)，雙脫氫酶系統(tǒng)。靶物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為輔酶 本系統(tǒng)靈敏度很高，循環(huán)速率至少可達(dá)NH3（NAD），使用兩種脫氫酶使 NAD-NADH間循環(huán)。1000次/ 分。舉例： N

8、H3測(cè)定，原理見圖 4。D-葡萄糖 脫氫酶D- 葡萄糖酸 - - 內(nèi)酯 圖 4 NH3三磷酸腺苷脫氨 -NAD葡萄糖NAD黃遞酶循環(huán)四唑鹽單磷酸腺苷 PPi 甲月簪染料 （ 比色測(cè)定 ）酶循環(huán)法測(cè)定原理 利用這一反應(yīng)原理，增加前反應(yīng)亦可測(cè)定尿素和肌酐。 尿素前反應(yīng)：Urea H 2O2NH 3 CO2肌酐前反應(yīng)：肌酐 H 2O 肌酐脫氨基酶 N 甲基乙丙酰脲 NH3.4 方法 D 氨循環(huán)， NAD合成酶 - 脫氫酶系統(tǒng)。靶物質(zhì) NH3被轉(zhuǎn)化成 NAD，再通過亮氨酸脫氫酶使 L-亮氨 酸轉(zhuǎn)變成氧化異己酸和 NH4+， NH4+又重復(fù)反應(yīng)，原理見圖 5。NH4 酶循環(huán)法的特征和應(yīng)用前景 傳統(tǒng)的酶反

9、應(yīng)只能按靶物質(zhì)的量生成相應(yīng)的產(chǎn)物量，而酶循環(huán)法則可在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)通過靶物 質(zhì)的重復(fù)反應(yīng)來增加產(chǎn)物的量。 因此， 可通過延長反應(yīng)時(shí)間和 / 或增加酶的用量來加速循環(huán)以增加循環(huán) 次數(shù) （循環(huán)速率 ） 來提高靈敏度。 選擇用高循環(huán)速率的酶和合適的循環(huán)方法可使循環(huán)速率達(dá)到501000次/ 分。另外通過使用酶的特殊底物 （ 如巰基 -NAD）可簡化反應(yīng)體系，亦可偶聯(lián)呈色反應(yīng) （ 如四氮唑染料 或 Trinder 反應(yīng) ） 使其成為可見光譜測(cè)定。 本法還可與熒光和發(fā)光分析結(jié)合使靈敏度更高。 由于本法是 一個(gè)比色測(cè)定，它可能被用作 EIA 檢測(cè)方法，消除測(cè)定污染的存在。5 酶循環(huán)法推廣應(yīng)用尚需克服的難題由于酶循環(huán)法具有諸多優(yōu)越性，是一種有前途的測(cè)定方法，但目前要推廣使用尚有一些問題需要解 決：因此法工具酶的用量是普通酶法的