發(fā)酵工程-第十章-氨基酸

1、發(fā)酵工程-第十章-氨基酸 L-型型NH42.2.谷氨酸的生物合成谷氨酸的生物合成HMP: Hexosemonophosphate pathway1 1EMP:EMP:丙酮酸，丙酮酸，ATP,NADH2ATP,NADH22 2HMP:6HMP:6磷酸果糖磷酸果糖 3 3磷酸甘油酸磷酸甘油酸 NADPH2: NADPH2:酮戊二酸復(fù)原氨基化必需的供氫體。酮戊二酸復(fù)原氨基化必需的供氫體。3 3TCATCA循環(huán)循環(huán): :生成谷氨酸前體物質(zhì)生成谷氨酸前體物質(zhì)酮戊二酸。酮戊二酸。4 4CO2CO2固定反響固定反響: :補(bǔ)充草酰乙酸。補(bǔ)充草酰乙酸。5 5乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán): :使琥鉑酸、延胡索酸和蘋果酸的

2、量得使琥鉑酸、延胡索酸和蘋果酸的量得 到補(bǔ)充，維持到補(bǔ)充，維持TCATCA循環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。循環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。 谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶6 6復(fù)原氨基化反響復(fù)原氨基化反響: :酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸丙酮酸丙酮酸回補(bǔ)反響回補(bǔ)反響globiformis Arthrobacterglobiformis Arthrobacter 共同點(diǎn)：共同點(diǎn)： 1 1革蘭氏陽(yáng)性。革蘭氏陽(yáng)性。 2 2不形成芽孢。不形成芽孢。 3 3沒有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。沒有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。 4 4需要生物素作為生長(zhǎng)因子。需要生物素作為生長(zhǎng)因子。 5 5在通氣條件下產(chǎn)谷氨酸需氧微生物。在通氣條件下產(chǎn)谷氨酸需氧微生物。三、谷氨酸發(fā)酵的

3、工藝控制三、谷氨酸發(fā)酵的工藝控制一培養(yǎng)基一培養(yǎng)基 1. 1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烴乙醇、烷烴 1 1淀粉水解糖的制備淀粉水解糖的制備 2 2糖蜜原料糖蜜原料 a. a.- -少。少。 b. b.轉(zhuǎn)氨酶活力增強(qiáng)，谷氨酸轉(zhuǎn)變成其它氨基轉(zhuǎn)氨酶活力增強(qiáng)，谷氨酸轉(zhuǎn)變成其它氨基酸。酸。 生物素：生物素：B B族維生素的一種，又稱維生素族維生素的一種，又稱維生素H H或或輔酶輔酶R R。是合成脂肪酸所必需的。是合成脂肪酸所必需的。 脂肪酸的生物合成：脂肪酸的生物合成： 利用乙酰利用乙酰CoACoA直接原料是丙二酸單酰直接原料是丙二酸單酰CoACoA在乙酰在乙酰CoACo

4、A羧化酶輔基為生物素催化下合羧化酶輔基為生物素催化下合成。成。 脂肪酸甘油磷酸脂肪酸甘油磷酸 磷脂蛋白質(zhì)磷脂蛋白質(zhì) 生物膜生物膜 因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。 生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外。氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外。 使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法 1. 用生理學(xué)手段用生理學(xué)手段 直接抑制膜合成或使膜受缺損直接抑制膜合成或使膜受缺損 如如: Glu發(fā)酵中，控制生物素亞適量可大量分泌發(fā)酵中，控制生物素亞適量可大量分泌Glu；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量

5、較高時(shí)采用適量添加青霉素當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉素的方法；的方法； 2. 利用膜缺損突變株利用膜缺損突變株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨添加油酸，合成有缺損的膜，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。酸產(chǎn)量。甘油缺陷型菌株的細(xì)胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易甘油缺陷型菌株的細(xì)胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物造成谷氨酸大量滲漏。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸

6、過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。 控制細(xì)胞膜的滲透性控制細(xì)胞膜的滲透性(1) (1) 通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性(2) (2) 通過細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性通過細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性生物素生物素谷氨酸谷氨酸細(xì)胞膜滲透性細(xì)胞膜滲透性青霉素青霉素谷氨酸谷氨酸油酸缺陷型油酸缺陷型油酸油酸n工業(yè)上利用谷氨酸棒狀桿菌大量積累谷氨酸，應(yīng)工業(yè)上利用谷氨酸棒狀桿菌大量積累谷氨酸，應(yīng)采用的最好方法是采用的最好方法是 nA A加大菌種密度加大菌種密度nB B改變碳源和氮源比例改變碳源和氮源比例nC C改變菌體細(xì)胞膜通透

7、性改變菌體細(xì)胞膜通透性nD D加大葡萄糖釋放量加大葡萄糖釋放量 為什么添加適量生物素或青霉素可提高谷氨酸產(chǎn)量？為什么添加適量生物素或青霉素可提高谷氨酸產(chǎn)量？ 生物素：乙酰生物素：乙酰-CoA-CoA羧化酶的輔酶，與脂肪酸及磷脂合成有關(guān)?？刂粕然傅妮o酶，與脂肪酸及磷脂合成有關(guān)?？刂粕锼睾浚筛淖兗?xì)胞膜的成分，改變膜的透性、谷氨酸的分泌和反響物素含量，可改變細(xì)胞膜的成分，改變膜的透性、谷氨酸的分泌和反響調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。 生物素含量高時(shí)，細(xì)胞膜致密，阻礙生物素含量高時(shí)，細(xì)胞膜致密，阻礙GluGlu分泌，并引起反響抑制，加適分泌，并引起反響抑制，加適量青霉素可提高量青霉素可提高GluGlu產(chǎn)量。產(chǎn)

8、量。 青霉素：抑制肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽酶活性，引起肽聚糖結(jié)構(gòu)中肽青霉素：抑制肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽酶活性，引起肽聚糖結(jié)構(gòu)中肽橋無法交聯(lián)，造成細(xì)胞壁缺損，在膨脹壓的作用下代謝物外滲，降橋無法交聯(lián)，造成細(xì)胞壁缺損，在膨脹壓的作用下代謝物外滲，降低了谷氨酸的反響抑制，提高了產(chǎn)量。低了谷氨酸的反響抑制，提高了產(chǎn)量。 環(huán)境條件引起谷氨酸合成的代謝轉(zhuǎn)換環(huán)境條件引起谷氨酸合成的代謝轉(zhuǎn)換2. 2. 不溶性鹽沉淀法不溶性鹽沉淀法1 1鋅鹽法鋅鹽法谷氨酸鋅離子谷氨酸鋅離子 谷氨酸鋅沉淀谷氨酸鋅沉淀 溶液溶液 谷氨酸結(jié)晶谷氨酸結(jié)晶pH6.3加酸加酸pH2.42鹽酸鹽法：鹽酸鹽法： Glu在濃鹽酸中生成并析出谷氨酸鹽酸鹽。

9、在濃鹽酸中生成并析出谷氨酸鹽酸鹽。 這是用鹽酸水解面筋生產(chǎn)谷氨酸的原理。這是用鹽酸水解面筋生產(chǎn)谷氨酸的原理。3鈣鹽法：鈣鹽法： 高溫谷氨酸鈣溶解度大，與菌體等不溶性雜質(zhì)高溫谷氨酸鈣溶解度大，與菌體等不溶性雜質(zhì) 分開，降溫，析出谷氨酸鈣沉淀，加分開，降溫，析出谷氨酸鈣沉淀，加NaHCO3 直接得直接得 到味精。到味精。 3. 3.離子交換法離子交換法 用陽(yáng)離子交換樹脂吸附谷氨酸形成的陽(yáng)離用陽(yáng)離子交換樹脂吸附谷氨酸形成的陽(yáng)離子，再用熱堿子，再用熱堿 60 4% NaOH 60 4% NaOH 洗脫，收集洗脫，收集相應(yīng)流分，加鹽酸結(jié)晶。相應(yīng)流分，加鹽酸結(jié)晶。 GA+ GA GA+ GA GA- GA

10、- GA=GA= 2 3.22 7.0 1212 pI pI 谷氨酸是酸性氨基酸，含谷氨酸是酸性氨基酸，含2 2個(gè)羧基個(gè)羧基1 1個(gè)氨基，個(gè)氨基，與陰離子交換樹脂要比與陽(yáng)離子交換樹脂強(qiáng)，與陰離子交換樹脂要比與陽(yáng)離子交換樹脂強(qiáng)，但陰離子機(jī)械強(qiáng)度差，價(jià)格貴，因而用陽(yáng)離子但陰離子機(jī)械強(qiáng)度差，價(jià)格貴，因而用陽(yáng)離子交換樹脂。交換樹脂。 理論上講發(fā)酵液上柱的理論上講發(fā)酵液上柱的pH值應(yīng)低于值應(yīng)低于3.22，但實(shí)，但實(shí)際上控制在際上控制在5.0 6.0之間，因之間，因Na+、NH4+交換能交換能力力谷氨酸，優(yōu)先交換，置換出谷氨酸，優(yōu)先交換，置換出H+使使pH值低于值低于3.2，使谷氨酸成為陽(yáng)離子，但不能，使谷氨酸成為陽(yáng)離子，但不能6.0。4.4.電滲析法電滲析法 膜別離過程，利用的是電位差。膜別離過程，利用的是電位差。 二次電滲析法：二次電滲析法：pH3.2pH3.2：除去各種鹽類。：除去各種鹽類。pHpH3.2:3.2:除去蛋白質(zhì)、殘?zhí)呛蜕氐确请娊獬サ鞍踪|(zhì)、殘?zhí)呛蜕氐确请娊赓|(zhì)。質(zhì)。我國(guó)味精技術(shù)進(jìn)展情況我國(guó)味精技術(shù)進(jìn)展情況制糖工藝進(jìn)展：酸法水解制糖工藝進(jìn)展：酸法水解酶酸法水解酶酸法水解雙酶法水雙酶法水解。解。發(fā)酵工藝進(jìn)展：亞適量生物素水平產(chǎn)酸發(fā)酵工藝進(jìn)展：亞適量