蟲(chóng)草菌絲藥物血清對(duì)白細(xì)胞介素-1β損傷胰島細(xì)胞的保護(hù)作用的實(shí)講解

1、蟲(chóng)草菌絲藥物血清對(duì)白細(xì)胞介素-1 p損傷胰島細(xì)胞 的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)作者：鄭倩 劉紅 曹弟勇 劉華 藍(lán)海濤 敬華娥【摘要】目的通過(guò)白細(xì)胞介素1 p (Interleukin-1p ,IL-1 B)損傷離體胰島細(xì)胞，研究蟲(chóng)草菌絲(Cordyceps sinensis, CS)含藥血清對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)作用以及其機(jī)制與抗氧化酶和一氧化氮(Nitric oxide ,NO )的關(guān)系。方法 離體培養(yǎng)乳鼠胰島細(xì)胞，用IL-1 p損傷胰島細(xì)胞，與不同濃度 CS含藥血清共 同孵育，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，放免法檢測(cè)基礎(chǔ)和高糖胰島素分泌量，比 色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮(NO的含量，誘生型一氧化

2、氮合酶(Nitric oxide synthase ,iNOS)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase ,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione perioxidase,GSH-Px)的活性。結(jié)果CS含藥血清顯著提高IL-1 p損傷的胰島細(xì)胞活性，并且胰島細(xì) 胞基礎(chǔ)和高糖刺激胰島素分泌量明顯提高。IL-1 p作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 NOS舌性升高，NO含量增加，而SOD GSH-Px的活性水平降低，經(jīng)與不同濃度 CS含藥血清共同孵育后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量減少、iNOS活性降低，SOD GSH-Px的水平明顯升高，呈劑量依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pv 0.05

3、, PV 0.01 )。結(jié)論CS含藥血清對(duì)IL-1 p損傷的胰島細(xì)胞分泌功能和細(xì)胞活性有保 護(hù)作用，其機(jī)制與降低iNOS的活性，從而減少NO生成以及提高SOD GSH-PX 的活性水平有關(guān)。【關(guān)鍵詞】 蟲(chóng)草菌絲血清藥理學(xué)胰島細(xì)胞損傷細(xì)胞保護(hù)Abstract : ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of medicated sera of cs on the islet cell damage in duced by IL- 1 p .MethodsThe pan creases of the rats were removed t

4、o collect islet cells ,and the n the cells were divided into no rmal con trol group, IL- 1 p damadaged group, IL-1 p +medicated sera of cs groups.The cellular activity was detected with methyl-thiazol-tetrazolium(MTT) assay,basic amount of in suli n secreti on and stimulated by high glucose was dete

5、cted by radioim muno assay,the content of n itric oxide and activities of n itric oxide syn thase superoxide dismutase and glutathi one perioxidase were determued accord ing to the kit directio n.ResultsMedicated sera of cs obviously improved the islet cellular activity damaged by IL-1p ,and basic a

6、mount of insulinsecreti on and stimulated by high glucose were improved(Pv 0.01 )content of n itric oxide and activity of n itric oxide syn thase in the supernatant were obviously higher in IL-1p damaged group,and therewere sig ni fica nt differe nces betwee n the medicated sera of cs groups and IL-

7、1 p damaged group. Compared with IL-1 p damage group, medicated sera of cs could sig nifica ntly elevate the activities ofsuperoxide dismutase and glutathione perioxidase(Pv0.05 ,P v0.01 ) .Con clusi on Medicated sera of cs plays a protective role in the pancreatic islets damaged by IL-1 B .The prot

8、ective mechanism may be correlated with the decrease of iNOS activity and the content of n itric oxide,a nd the in crease of the activities of superoxide dismutase and glutathi one perioxidase.Key wordsCordyceps sinensis; Seropharmacology ; Islets ofIangerhans ; Cytoprotction； Cell trauma1型糖尿病是一種胰島B

9、細(xì)胞選擇性破壞的自身免疫性疾病，其病理表現(xiàn) 為大量免疫炎性細(xì)胞浸潤(rùn)胰島，并分泌白細(xì)胞介素-1 B （IL-1 B）、腫瘤壞死因子（TNF）和干擾素-丫 （IFN- 丫）等細(xì)胞因子，其中IL-1 B可能是其重要的內(nèi)源 性損傷因子1。近年來(lái)中草藥對(duì)糖尿病的防治作用受到了廣泛關(guān)注。冬蟲(chóng)夏 草是一種名貴強(qiáng)壯滋補(bǔ)中藥，為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)上 的子座及其幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體。其味甘、性溫，歸肺、腎經(jīng)，有補(bǔ)虛填精、保 肺益腎、止血化痰等作用，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、 抑菌、抗病毒的作用。但由于天然蟲(chóng)草有嚴(yán)格的寄生性和特殊的生長(zhǎng)地理環(huán) 境，藥缺價(jià)高，限制天然蟲(chóng)草的使用。人工

10、蟲(chóng)草是人工發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲， 其成分和藥理作用與天然蟲(chóng)草基本一致，因此對(duì)蟲(chóng)草菌絲的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng) 用逐步深入，有報(bào)道認(rèn)為蟲(chóng)草菌絲可以降低血糖的濃度2，以及提高肝纖維 化大鼠的胰島細(xì)胞基礎(chǔ)胰島分泌量3，但其具體機(jī)制并不清楚，缺乏相關(guān)的 基礎(chǔ)研究。目前有報(bào)道認(rèn)為胰島抗氧化系統(tǒng)活性降低與一氧化氮（NO水平提高是糖尿病早期病變之一，NO和氧自由基可破壞胰島細(xì)胞，引起 1型糖尿病。 本實(shí)驗(yàn)室用IL-1 B損傷乳鼠胰島細(xì)胞，觀察IL-1 B對(duì)胰島抗氧化系統(tǒng)活性與 NO水平的影響，采用血清藥理的方法探討蟲(chóng)草菌絲對(duì)IL-1 B損傷的離體胰島細(xì)胞的活性和分泌功能是否具有保護(hù)作用以及其機(jī)制與抗氧化作用和NO的

11、關(guān)系。1器材1.1材料出生13 d的Wistar大鼠和體重200220 g的健康Wistar大 鼠均由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；RPMI-1640培養(yǎng)液為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn) 品；IL-1 B、胎牛血清為天津?yàn)笊锟萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品；蟲(chóng)草菌絲購(gòu)自 中美華東醫(yī)藥制藥公司（批號(hào)061140）;胰島素放免檢測(cè)試劑盒為華西生物制劑 公司產(chǎn)品；膠原酶 V型、STZ均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；SOD GSH-Px NO NOS測(cè)定盒由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2儀器CO2孵育箱（Forma scientific,美國(guó)），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD,蘇州安泰），倒置相差

12、顯微鏡（olympus，日本）,全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIORAD 2550型，美國(guó)），紫外分光儀（RF-540,日本島津），臺(tái)式冷凍高速離 心機(jī)（日立himac CF-15型，日本），高壓蒸氣滅菌器（YXQ-SG46上海博訊 有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。2方法2.1藥物血清的制備 選用Wistar大鼠40只，體重200220 g，雌雄 各半。灌胃前禁食12 h，設(shè)立正常對(duì)照組和用藥組，用藥組給予蟲(chóng)草菌絲灌 胃，每次10 ml/ kg，分低、中、高3個(gè)劑量組（1，10, 20 g/kg ），分別相 當(dāng)于70 kg成人用量的5，10, 20倍，正常對(duì)照組給予等容量生理鹽水灌胃， 所取血清為生理鹽水對(duì)照血清，作

13、對(duì)照用。使用二次加強(qiáng)給藥法給藥（首次 給藥2 h后，再次予相同的劑量灌胃），在第 2次給藥后第1, 2, 3 h，于無(wú) 菌條件下自心臟采血，靜置 4 h以上，離心30 min（3 000 r/min ，4°C），分離 血清，56C，滅活30 min，置-70C低溫冰箱冷藏備用，1個(gè)月內(nèi)使用。2.2胰島細(xì)胞分離與培養(yǎng)出生13 d的Wistar大鼠20只，無(wú)菌取出胰 腺，清洗，剪碎，V型膠原酶消化，Han kS液終止消化，消化離心。加入10%S臺(tái) 牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，37C，5%CO孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，去除成纖維細(xì)胞，收集胰島細(xì)胞，制成新的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)

14、細(xì)胞濃度至 1X 106 ml，置96孔板培養(yǎng)，每孔內(nèi)加入細(xì)胞懸液 200卩l(xiāng)。隨機(jī)分組。分為 正常對(duì)照組、IL-1 B損傷組、IL-1 B +不同濃度CS含藥血清保護(hù)組（IL- I B +CS1為低劑量含藥血清組，IL-1 B +CS2為中劑量含藥血清組，IL-1 B +CS3 為高劑量含藥血清組），每組平行孔 6孔，損傷組和保護(hù)組每孔細(xì)胞加100 u/ml IL-1 B 20卩l(xiāng)作用20 h后，正常對(duì)照組加入大鼠生理鹽水對(duì)照組血清 20卩l(xiāng)，于不同保護(hù)組分別加入20卩l(xiāng)低、中和高劑量含藥血清 CS繼續(xù)培養(yǎng) 30 h，進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。2.3四唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞活性檢測(cè)方法如下：將各

15、組細(xì)胞離 心（500 r/min x 5 min ），吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于細(xì)胞中加200卩l(xiāng)的培養(yǎng)液（不含胎牛血清）和5mg/ml的MTT 20卩l(xiāng)，放入CO2孵育箱培養(yǎng)4 h后， 再離心（1 000 r/min x 10 min），棄上清，加入二甲亞楓 200卩l(xiāng)，振蕩5 min,在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上比色，測(cè)出每孔光密度值（ODfi）進(jìn)行比較，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm, OD值越高表明細(xì)胞活性就越強(qiáng)。2.4胰島細(xì)胞上清液胰島素分泌量測(cè)定提取正常對(duì)照組、IL-1 B損傷組和IL-1 B +CS組各待測(cè)標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用放免法檢測(cè)胰島素的基礎(chǔ)分泌 量；在抽取上清液的各組細(xì)胞中加入含20 mmol

16、/L的葡萄糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2h,離心提取上清液，按上述方法進(jìn)行高糖刺激胰島素分泌量檢測(cè)。2.5細(xì)胞培養(yǎng)液NO水平，iNOS, SOD GSH-PX舌性的檢測(cè)提取正常對(duì)照 組、IL-1 B損傷組和IL-1 B +CSS各待測(cè)標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別用試劑盒 進(jìn)行檢測(cè)，步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以土 s表示，a =0.05，采用方差分析。整個(gè)統(tǒng)計(jì) 資料采用SAS軟件處理完成。3結(jié)果3.1 CS藥物血清對(duì)IL-1 B損傷胰島細(xì)胞活性影響表1結(jié)果表明IL-1 B損 傷組與正常對(duì)照組比較光密度值 OD值降低，表明細(xì)胞活性明顯下降（PV0.01 ）;損傷后加入不同濃度CS藥物血清共

17、同孵育可使OD值較損傷組均有不 同程度的提高，具有顯著意義，且具有劑量依賴性。表1不同濃度CS藥物血清對(duì)IL-1 B損傷細(xì)胞活性的影響（略）與空白組比較,“ Pv0.01 ;與IL-1 B損傷組比較， Pv0.05 , Pv 0.01 ; n=63.2細(xì)胞培養(yǎng)液胰島素分泌量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 2。加入IL-1 B作用后胰島細(xì) 胞基礎(chǔ)分泌胰島素量和葡萄糖刺激分泌量顯著下降（Pv 0.01 ），在損傷的基礎(chǔ) 上與不同濃度CS藥物血清共同培養(yǎng)30 h后，測(cè)試培養(yǎng)液中分泌量和葡萄糖刺 激胰島素分泌量較損傷組有明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2細(xì)胞培養(yǎng)液基礎(chǔ)胰島素分泌量和葡萄糖刺激胰島素分泌量（略）與正常對(duì)照組比

18、較，* Pv 0.01;與IL-1 B損傷組比較， Pv 0.05， Pv 0.01 ； n=63.3細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD, GSH-Px水平的測(cè)定與IL-1 B作用后胰島細(xì)胞培 養(yǎng)液中SOD舌性顯著降低（Pv0.01 ），GSH-PX舌性減弱（Pv 0.01 ），在損傷 的基礎(chǔ)上與不同濃度CS藥物血清共同培養(yǎng)30 h后，測(cè)試培養(yǎng)液中SOD以及 GSH-PX勺活性升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表 3。3.4細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量和iNOS活性的檢測(cè)加入IL-1 B后，與正常對(duì)照 組比較可見(jiàn)胰島細(xì)胞培養(yǎng)液中iNOS的活性與NO含量顯著增加（Pv0.01 ），經(jīng) 與不同濃度CS藥物血清共同培養(yǎng)30 h后，測(cè)

19、試培養(yǎng)液中iNOS的活性降低，NO 的含量減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表 4。表3細(xì)胞培養(yǎng)液SOD和 GSH-PX舌性（略）與正常對(duì)照組比較，* Pv0.01 ；與IL-1 B損傷組比較， Pv0.05, Pv 0.01;n=6表4細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量和iNOS活性（略）與正常對(duì)照組比較，* Pv0.01 ；與IL-1 B損傷組比較， Pv0.05， Pv 0.01 ； n=64討論血清藥理學(xué)研究是指給動(dòng)物灌胃或人服用一定量的中藥或復(fù)方制劑，在一 定時(shí)間后采集血液，分離血清，以此進(jìn)行體外試驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)方法。此方法由 20世紀(jì)中期日本學(xué)者Iwama H等提出。與傳統(tǒng)的將中藥粗提物直接加入反應(yīng)體 系中的

20、方法相比，它具有明顯的優(yōu)勢(shì)：在某種程度上克服了中藥本身的雜質(zhì)對(duì) 試驗(yàn)結(jié)果的影響，而且相對(duì)接近于藥物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的真實(shí)過(guò)程，能客觀地闡明中藥藥效和作用機(jī)理，且使中藥藥理的研究易于深入到細(xì)胞分子水平。近 20年來(lái)，其已成為中藥藥理研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在體外實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng) 用，是目前研究中藥藥理學(xué)的一種較為理想的方法4。本研究采用血清藥理 方法探討CS對(duì)IL-1 B損傷胰島細(xì)胞的保護(hù)作用和機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中多次給藥可使 血清藥物濃度出現(xiàn)累加效應(yīng)，二次重復(fù)給藥提高了血清藥物濃度，所采集的血 清經(jīng)56C，滅活30 min處理后，避免了未滅活血清中某些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒 性和不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)表明IL-1 B對(duì)

21、胰島細(xì)胞具有損傷作用，表現(xiàn)在 100 u/ml的IL-1 B 使胰島細(xì)胞活性減弱，并且可抑制胰島分泌功能，使胰島素基礎(chǔ)分泌量和葡萄 糖刺激胰島素的分泌量均減少，這與 Ohara-lmaizumi M 5報(bào)道IL-1 B可抑 制胰島B細(xì)胞活性以及胰島素釋放等生物作用相似。經(jīng)與含CS含藥血清作用后，能反轉(zhuǎn)IL-1 B損傷的離體胰島細(xì)胞的活性，細(xì)胞活性與未加保護(hù)劑的損 傷組比較均有顯著提高；并且能減輕IL-1 B損傷的胰島素分泌和葡萄糖刺激 的胰島素分泌，使胰島分泌功能增強(qiáng)。有報(bào)道認(rèn)為，細(xì)胞因子對(duì)胰島細(xì)胞的損傷與NO生成增多和SOD GSH-Px表達(dá)異常有關(guān)6。本實(shí)驗(yàn)亦證明IL-1 B作用后胰島細(xì)胞SOD GSH-PX舌力明 顯降低，SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，對(duì)機(jī)體的氧化與抗 氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O-2 ）保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱 甘肽（GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作 用。自由基增多可對(duì)細(xì)胞、組織造成廣泛損害，自由基可通過(guò)丙二醛等醛類的