微生物實驗第一次實驗用

1、實驗一 普通光學顯微鏡的使用一實驗目的1. 了解普通光學顯微鏡的結構、基本原理、維護和保養(yǎng)方法。2. 掌握普通光學顯微鏡的正確使用方法。3. 學習微生物個體形態(tài)圖的畫法。二實驗原理1. 普通光學顯微鏡的結構普通光學顯微鏡由機械裝置和光學系統(tǒng)組成。圖3-2 普通光學顯微鏡的結構示意圖（1）機械裝置（圖3-2）鏡座上顯微鏡的基座，起穩(wěn)定和支持整個機身的作用，使顯微鏡能平穩(wěn)放置在平面上，有的顯微鏡在鏡座內(nèi)裝有照明光源等。鏡柱是連接鏡座和鏡臂的短柱。鏡臂用以支持鏡筒，也是移動顯微鏡時用手握住的部分。直筒顯微鏡的鏡座和鏡臂之間有一傾斜關節(jié)，可以使鏡臂傾斜一定的角度，便于觀察。但傾斜度一般不超過45

2、76;，避免顯微鏡失去重心而翻倒。鏡筒傾斜式顯微鏡無此關節(jié)。鏡筒是連接目鏡與物鏡的金屬筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉換器相連。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，光學顯微鏡可以分為單筒式和雙筒式兩類。單筒式又分為直筒式和傾斜式兩種；雙筒式均為傾斜式。鏡臺又被稱為載物臺，在鏡筒下方，是放置標本的地方，為方形或圓形。鏡臺中央有一圓形通光孔，兩側各有一個用于固定被檢標本片的壓片夾。有的顯微鏡則有標本移動器，移動器上裝有彈簧夾，可固定標本片。轉動螺旋可以使標本片前后和左右移動。有的標本移動器上還帶有游標尺，可指明標本所在的位置。物鏡轉換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有35個不同放大倍數(shù)的物鏡，使用時可通過轉動物鏡轉換器選

3、用合適的物鏡。為使用方便，物鏡應按從低倍到高倍的順序安裝。轉換物鏡時，必須用手按住圓盤旋轉，切勿用手指直接推動物鏡，以免使物鏡和轉換器間的螺旋松脫而損壞顯微鏡。調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂基部或鏡柱兩側的粗、細螺旋上，可調(diào)節(jié)物鏡與被檢標本片之間的距離，以便清晰地觀察標本。粗調(diào)螺旋旋轉一周可使鏡筒升降約10 mm，一般用于低倍鏡調(diào)焦；細調(diào)螺旋旋轉一周可使鏡筒升降約0.1 mm的距離，用于高倍鏡、油鏡或分辨物像清晰度的調(diào)焦。（2）光學部分物鏡安裝在物鏡轉換器上，是顯微鏡中很重要的光學部件，是由多塊透鏡組成的一個鏡頭組。根據(jù)物鏡的放大倍數(shù)和使用方法的不同，物鏡可以被分為低倍鏡、高倍鏡和油鏡三類。低倍鏡的放大倍數(shù)

4、常為4´、10´、20´；高倍鏡的放大倍數(shù)常為40´、45´；油鏡的放大倍數(shù)常為90´、95´、100´，油鏡鏡筒上刻有OI或HI或oil字樣，也有刻一圈紅線或黑線為標記的，借以區(qū)別于其他物鏡。物鏡上標出了物鏡的重要參數(shù)，包括放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑（NA）、鏡筒高度（物鏡底面到目鏡頂面的距離，單位是mm）及要求蓋玻片的厚度等。現(xiàn)舉例說明其含義如下（圖3-3）： 圖3-3顯微鏡物鏡上的重要參數(shù)及大致的工作距離目鏡呈短圓筒狀，裝在顯微鏡上端。目鏡的功能是把物鏡放大的物像再次放大。目鏡由兩片透鏡組成，上面一塊為接目透鏡，下面

5、一塊為聚透鏡，在兩塊透鏡之間或聚透鏡的下方有一視野光闌。在進行顯微鏡測量時目鏡測微尺要放在視野光闌上。目鏡上刻有放大倍數(shù)，如5´、10´、15´、20´等，可以根據(jù)需要選擇合適的目鏡。聚光鏡又稱聚光器，安裝在鏡臺下，由多塊透鏡組成，其作用是把平行的光線聚焦到標本上，增強亮度。一般在鏡柱一側有一旋紐，可使聚光鏡升降。聚光鏡與物鏡配合使用，通常用低倍鏡時聚光鏡應下降，而當使用油鏡時聚光鏡應升到最高位置。在聚光鏡的上方是虹彩光闌，俗稱光圈。光圈由十幾張金屬游片組成，通過調(diào)節(jié)光闌孔徑的大小，可以調(diào)節(jié)進入物鏡的光線的強弱。在觀察較透明的標本時，光圈宜小一些，這時分

6、辨率雖然降低，但反差增強，從而使透明的標本看得更清楚；但不宜將光圈關得太小，以免由于光干涉現(xiàn)象而導致成像模糊。當使用油鏡時，把光圈完全打開，增強射入光線的強度。在光圈下常裝有濾光片架，可以放置不同顏色的濾光片。在聚光鏡下方的鏡座上，安裝有反光鏡。反光鏡是一個有平、凹兩個面的雙面鏡，可以在水平與垂直兩個方向上任意旋轉，其作用是采集光線并將光線射向聚光鏡。凹面鏡還能起到聚光的作用。因此，未安裝聚光鏡的顯微鏡及光源較弱時可應用凹面鏡，而在光源較強及用聚光鏡時一般可用平面鏡。有的顯微鏡安裝有電光源，使用時不用通過反光鏡就可以進行觀察。2. 普通光學顯微鏡的光學原理由單透鏡構成的放大鏡和由幾塊透鏡組成的

7、實體顯微鏡稱單式顯微鏡。現(xiàn)代普通光學顯微鏡是利用兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又被稱為復式顯微鏡。其光學原理是：由外界入射的光線經(jīng)反光鏡反射向上，或由內(nèi)光源發(fā)射的光線經(jīng)聚光鏡向上匯聚在被檢標本上，由標本反射或折射出的光線經(jīng)物鏡進入，使光軸與水平面傾斜45°角的棱鏡在目鏡的視場光闌處，成放大的側光實像，該實像再經(jīng)目鏡的接目透鏡放大成虛像。（1）顯微鏡的放大倍數(shù)被檢標本經(jīng)顯微鏡的物鏡和目鏡放大后的總放大倍數(shù)是：標本放大倍數(shù)物鏡的放大倍數(shù)´目鏡的放大倍數(shù)。如：用40´的物鏡和10´的目鏡，總放大倍數(shù)是400´。（2）分辨率評價一臺顯微鏡的精密程度，不僅要

8、看其放大倍數(shù)，更重要的是看其分辨率。分辨率是指顯微鏡能夠辨別發(fā)光的兩個點的最小距離的能力，該最小的距離被稱為鑒別距離或分辨距離（R）。R的計算公式如下：R l（2NA）；其中，l代表入射光的波長，NA代表物鏡的數(shù)值孔徑。 圖3-4 物鏡的進口角1. 物鏡；2. 進口角；3. 標本面。NA的計算公式如下：NA= n´ sinq。其中，n代表光線進入物鏡前所在介質(zhì)的折射率，q代表進口角a（圖3-4）的半數(shù)。q的最大值不可能達到90°，故sinq<1。當介質(zhì)為空氣時，n 1。所以干燥系下物鏡的數(shù)值孔徑都小于1。使用油鏡時，物鏡與標本片之間的介質(zhì)是香柏油（n= 1.515）或

9、液體石蠟（n= 1.52），故而數(shù)值孔徑增大。因而油鏡的分辨率要優(yōu)于其他物鏡。（3）工作距離工作距離是指觀察標本最清晰時，物鏡透鏡的下表面與標本之間（無蓋玻片時）或與蓋玻片之間的距離。物鏡的放大倍數(shù)越大，工作距離越短。油鏡的工作距離最短，約為0.2 mm。不同放大倍數(shù)的物鏡的工作距離不同，但在同一臺顯微鏡中，不同放大倍數(shù)的物鏡切換時，只須進行細調(diào)焦便可清晰地觀察到標本。三實驗器材普通光學顯微鏡、擦鏡紙、無水乙醇、香柏油、微生物標本片（包括枯草芽孢桿菌Bacillus substilis、大腸桿菌Escherichia coli、四聯(lián)球菌Tetraggenococcus sp.、釀酒酵母Sacc

10、haromyces cerevisiae）四實驗內(nèi)容（一）觀察前的準備1顯微鏡的放置置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊緣約34 cm。2調(diào)節(jié)光源接通電源后，取下目鏡，直接向鏡筒內(nèi)觀察，調(diào)節(jié)聚光鏡上的孔徑光闌，使光闌孔徑與視野恰好一樣大或略小于視野。該步驟的目的是使入射光展開的角度與物鏡的數(shù)值孔徑相一致，既可充分發(fā)揮該物鏡的分辨率，又能把超過該物鏡可能接受的多余光擋住，避免產(chǎn)生干擾。放回目鏡后，通過調(diào)節(jié)聚光鏡上的視野光闌或調(diào)節(jié)照明度控制鈕，選擇最佳的照明效果。（二）觀察一般情況下，特別是初學者，進行顯微鏡觀察時應遵循從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的順序，因為物鏡的放大倍數(shù)越小，視野相對也越大，越

11、易發(fā)現(xiàn)目標及確定檢查的位置。1低倍鏡下觀察標本（1）放置標本：下降鏡臺或升高鏡筒，將標本片放置在鏡臺上，用壓片夾夾緊，調(diào)節(jié)標本移動器使標本片上有染色劑的部分處于物鏡正下方。（2）調(diào)焦：轉動粗調(diào)節(jié)螺旋，升高鏡臺或下降鏡筒，使低倍鏡頭的前端接近載玻片。用雙眼在目鏡上觀察，并轉動粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡臺下降或鏡筒上升直到可看到物像。然后轉動細調(diào)節(jié)螺旋，使物像清晰。（3）觀察：尋找合適的目的菌，仔細觀察。2高倍鏡下觀察（1）尋找合適的視野：在低倍鏡下找到合適的目的菌，通過調(diào)節(jié)標本移動器使其移至視野中心。（2）轉換高倍鏡：用手按住物鏡轉換器慢慢旋轉，當聽到“咔嚓”一聲即表明物鏡已轉到正確的工作位置上。（3）調(diào)

12、焦：一般情況下，同一臺顯微鏡上的物鏡是同焦物鏡。也就是說，從低倍鏡切換到高倍鏡后，只要稍微調(diào)節(jié)一下細調(diào)螺旋就可以看清物像。（4）觀察：仔細觀察標本，比較與低倍鏡下的異同。3油鏡下觀察（1）尋找合適的視野：在高倍鏡下找到合適的目的菌，通過調(diào)節(jié)標本移動器使其移至視野中心。（2）加香柏油：從小瓶內(nèi)取香柏油12滴，加到欲觀察的涂片上。（3）轉換油鏡：將油鏡轉到工作位置，下降鏡筒，使油鏡浸入香柏油中，并從側面觀察，使鏡頭降至既非常接近標本片，又不能與標本片相接觸的合適位置。（4）調(diào)節(jié)亮度：調(diào)節(jié)聚光器到最高位置，打開光圈到最大位置，使進入油鏡的光線最多。（5）調(diào)焦：從目鏡中觀察，同時轉動粗螺旋，緩慢拉開油

13、鏡和標本片的距離，至出現(xiàn)模糊的物像時再用細調(diào)螺旋調(diào)節(jié)至物像清晰為止。若按上述操作找不到物像，有可能使開始時油鏡頭下降未到位，也有可能是油鏡上升太快，以至眼睛捕捉不到一閃而過的物像。遇此情況，應重新操作。（6）觀察：仔細觀察標本，比較與低、高倍鏡下的異同，并細心繪制形態(tài)圖。（三）觀察后對顯微鏡和標本片的處理1處理顯微鏡（1）轉動粗調(diào)節(jié)螺旋，使鏡筒和鏡臺的距離拉開，取出標本片。（2）清潔油鏡：先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用蘸少許無水乙醇的擦鏡紙擦掉殘留的香柏油，再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的無水乙醇。若使用液體石蠟作鏡油，可以只用擦鏡紙擦凈，不必使用無水乙醇。（3）清潔目鏡和其它物鏡：用擦鏡紙擦

14、凈其它的物鏡及目鏡。（4）清潔后應將物鏡轉成“八字形”，緩慢上升鏡臺，使物鏡擱置在鏡臺上。將聚光鏡降至最低位置。在顯微鏡上套上鏡罩后放入顯微鏡柜中。2處理標本片：對標本片上的香柏油，要用拉紙法擦試。先把一張小擦鏡紙蓋在油滴上，再滴上23滴無水乙醇，平拉擦鏡紙，使其輕輕在標本片上拖過。重新?lián)Q上干凈擦鏡紙后重復。23次后，肉眼觀察標本片上無香柏油殘留即可。五注意事項1取顯微鏡時應該用右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡身保持直立。切忌單手拎提顯微鏡。2. 所有鏡面切忌用手指、紗布、普通紙張擦試，以免磨損鏡面，需要時只能用擦鏡紙擦試。3. 粗、細調(diào)節(jié)螺旋調(diào)焦時，切忌采用對著目鏡邊觀察邊上升鏡臺的錯誤操作

15、，應從側面注視，以免壓壞標本片和損壞鏡頭。油鏡的工作距離很短，操作時要尤其小心謹慎。4. 觀察標本片時注意標本片的正面，也就是涂布有微生物的一面向上。5. 觀察完畢后注意用正確的方法擦試標本片上的殘余香柏油。動作要輕柔，切勿將標本片上涂有微生物的部分擦去。六實驗記錄描繪微生物個體形態(tài)表3-2 微生物個體形態(tài)圖菌名：菌名：菌名：顯微鏡放大倍數(shù)：顯微鏡放大倍數(shù)：顯微鏡放大倍數(shù)：個體形態(tài)圖個體形態(tài)圖個體形態(tài)圖個體形態(tài)描述個體形態(tài)描述個體形態(tài)描述七預習思考題列出顯微鏡的低倍鏡、高倍鏡和油鏡的觀察對象。八思考題1. 使用油鏡觀察時為何要在標本片和鏡頭之間滴加香柏油？2. 使用油鏡觀察時應如何調(diào)節(jié)顯微鏡的

16、聚光鏡和光圈？3. 油鏡用畢后，為什么必須把油鏡上的香柏油擦凈？用過多的酒精擦拭會有什么危害？實驗七 微生物的形態(tài)觀察一實驗目的1. 通過觀察認識細菌的基本形態(tài)、細菌的特殊結構和群體形態(tài)；2. 通過觀察認識放線菌的基本形態(tài)、孢子絲的形態(tài)和群體形態(tài)；3. 通過觀察認識真菌的基本形態(tài)、特化結構和群體形態(tài)；4. 鞏固光學顯微鏡的使用方法，重點掌握油鏡的使用方法。二實驗原理微生物種類繁多，不同的微生物其個體形態(tài)和群體形態(tài)是不同的。因此微生物的形態(tài)是其分類鑒定的依據(jù)之一。最常見的細菌個體形態(tài)分為三類，分別為球菌、桿菌和螺旋菌，放線菌和霉菌的個體形態(tài)都為絲狀菌，酵母菌的個體形態(tài)為卵圓形。放線菌根據(jù)其孢子絲

17、的不同分為螺旋和直型等，根據(jù)分化的情況分為叢生和輪生等。霉菌的特化型菌絲有青霉菌的青霉穗，曲霉的足細胞和根霉的假根等。一個細胞在固體培養(yǎng)基上繁殖集聚成肉眼可見的集落稱為菌落。各種微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落具有一定的特征，包括菌落的大小、形狀、光澤、顏色、氣味、與培養(yǎng)基結合的牢固度等。一般而言細菌的菌落較小，表面光滑或粗糙，濕潤或干燥，具有臭味，與培養(yǎng)基結合不牢固（易被挑起）。放線菌的菌落大小與細菌菌落大小相似，表面大多呈干燥粉狀，具有土腥味，與培養(yǎng)基結合牢固（不易被挑起）。有些放線菌的基內(nèi)菌絲能產(chǎn)水溶性或脂溶性色素（圖3-14）。 A B圖3-14 放線菌的基內(nèi)菌絲產(chǎn)生的色素（A.水溶性

18、色素，B.脂溶性色素）霉菌的菌落比細菌和放線菌的菌落大幾倍至幾十倍，菌落疏松呈絨毛狀或絮狀，具有霉味，與培養(yǎng)基結合牢固（不易被挑起）。酵母菌的菌落形態(tài)與細菌相似，但比細菌菌落大且厚，表面光滑、濕潤、粘稠，與培養(yǎng)基結合不牢固（易被挑起）。常見酵母菌大多為乳白色，釀酒酵母具有酒香味。三實驗器材1.微生物基本形態(tài)標本片（1）細菌：四聯(lián)球菌（Tetraggenococcus sp.）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、逗號弧菌（Vib

19、rio comma）（2）放線菌：林可鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）（3）霉菌：青霉菌（Penicillium sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、毛霉（Mucor sp.）（4）酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2.微生物特殊結構標本片（1）殺螟桿菌（Bacillus cereus）不同生長階段標本片：用于觀察芽孢的形成（2）圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）：用于觀察莢膜（3）鏈霉菌（Streptomyces sp.）孢子絲：用于觀察不同鏈霉菌孢子絲的形態(tài)（4）青霉、曲霉、根霉、毛霉特化菌絲：用于觀察霉菌菌絲的不同特化形態(tài)3微生物菌落平板：大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌、林可鏈霉菌、青霉菌、曲霉、毛霉、根霉、釀酒酵母、噬菌斑4儀器和其他材料：顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，無水乙醇四實驗步驟1. 微生物個體形態(tài)的觀察（1）將需觀察的標本片置于光學顯微鏡載物臺上，用十字