campetris利用HOCl自由基介導(dǎo)提高黃原膠量

1、通過Xanthomonas campetris利用HOCl自由基介導(dǎo)提高黃原膠量及其機(jī)制研究Y. Manjula Rao, G. K. SureshkumarBiochemical Engineering Group, Department of Chemical Engineering.Indian Institute of Technology, Bombay, Powai, Mumbai 400 076, India;telephone: 91-22-576-7208; fax: 91-22-572-3480; E-mail:gksureshche.iitb.ernet.inReceiv

2、ed 6 September 1999; accepted 29 June 2000（周鑫翻譯）摘 要：自由基介導(dǎo)已經(jīng)被利用在生物反應(yīng)生產(chǎn)中，特別是在Xanthomonas campestris生產(chǎn)黃原膠的產(chǎn)量和品質(zhì)提高中體現(xiàn)的尤為突出。HOCl（氧化劑）處理帶來了產(chǎn)量增長210%，產(chǎn)物黏度（品質(zhì)）提高20%。另外，醋酸在產(chǎn)物中的質(zhì)量比下降了42%，丙酮酸的質(zhì)量比增加了63%。生長率幾乎未受HOCl處理的影響。解釋自由基介導(dǎo)的高產(chǎn)黃原膠的機(jī)制的假設(shè)也已提出。SoxS蛋白與gum基因的啟動子結(jié)合提高mRNA的轉(zhuǎn)錄水平是這個假說的重要內(nèi)容，并且得到了實驗證實。© 2001 John Wi

3、ley & Sons, Inc. Biotechnol Bioeng 72: 6268, 2001關(guān)鍵詞：自由基；適應(yīng)反應(yīng)；Xanthomonas campestris；SoxS-DNA結(jié)合；黃原膠1. 簡介自由基可以用來調(diào)節(jié)一些重要的細(xì)胞周期，如細(xì)胞凋亡和癌變（Feig and Loeb, 1994; Feig et al., 1994; Okuno et al., 1998; Reid and Loeb,1993）。并且，自由基也通常被認(rèn)為在溫度、滲透壓和營養(yǎng)水平起到了調(diào)節(jié)子的作用（Nagarathnamma et al., 1997; Osbourn et al., 1990），

4、這些也是生物反應(yīng)器中的重要環(huán)境參數(shù)。因此，自由基可以被認(rèn)為在決定生物反應(yīng)產(chǎn)量中有重要的角色。氧自由基和氧分壓是植物抵抗如Xanthomonas campestris這種植物病原微生物入侵的重要因子。黃原膠是由Xanthomonas campestris在入侵時分泌的，并且這種粘液（黃原膠液）的分泌程度與致病性直接相關(guān)（Thorene et al., 1987; Weiss et al., 1994）。從工業(yè)角度看，Xanthomonas campestris用來生產(chǎn)有商業(yè)價值的黃原膠，可以廣泛利用于食品、醫(yī)藥、石油等其他行業(yè)（Lee, 1996）。如果自由基介導(dǎo)和黃原膠產(chǎn)量的關(guān)系可以闡明，就可

5、以用來大大促進(jìn)黃原膠的產(chǎn)量。并且，更深入的研究有利于改進(jìn)通過培養(yǎng)過氧化氫酶分解過氧化氫實現(xiàn)原位供氧的培養(yǎng)方法（Sriram et al., 1998）。我們通過加入自由基和研究菌體生長和黃原膠生產(chǎn)的反應(yīng)，來調(diào)查自由基對生物反應(yīng)器的反應(yīng)影響。目的在于促進(jìn)黃原膠產(chǎn)量。自由基促進(jìn)生物反應(yīng)產(chǎn)量沒有在文獻(xiàn)中報道過。此外，這種方法可以很簡單的應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，只不過就是在接種到種子培養(yǎng)瓶之前處理若干小時。在這次研究中，我們通過一種自由基形成劑（活性氧類，ROS）次氯酸（HOCl）進(jìn)行胞外處理來實現(xiàn)氧化條件。就生長和黃原膠生產(chǎn)反面而言，對這種自由基產(chǎn)生劑的適應(yīng)性反應(yīng)（如隨之產(chǎn)生的應(yīng)答）已經(jīng)被研究。同時，也提

6、出了關(guān)于自由基刺激黃原膠過量生產(chǎn)的一種遺傳學(xué)假說。假說中關(guān)于SoxS蛋白（一種自由基介導(dǎo)的調(diào)節(jié)蛋白）同DNA結(jié)合和高mRNA轉(zhuǎn)錄已經(jīng)由實驗證明。特異性的甲基化研究表明，SoxS同gumB基因啟動子區(qū)域特定的GCAY序列結(jié)合。SoxS蛋白引起的由于gum基因的轉(zhuǎn)錄活性增加了的mRNA也被證明。2. 材料與方法2.1 培養(yǎng)物和其它特殊菌株實驗用微生物為生產(chǎn)黃原膠的Xanthomonas campestris（MTCC 2286，IMTECH，Chandigarh，India）。菌種保存在4，含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母浸出物、10g/L CaCO3和20g/L瓊脂的斜面上。生長培養(yǎng)基含有4

7、0g/L葡萄糖，3g/L酵母浸出物，5g/L K2HPO4，0.6g/L MgSO4·7H2O和0.4g/L尿素，用自來水溶解（提供痕量元素；培養(yǎng)基接種前不加入葡萄糖進(jìn)行高壓蒸汽滅菌）。Escherichia coli XA 90（K-12），用來表達(dá)SoxS蛋白（Li and Demple，1994）和SoxS的抗體，由Prof. Demple（Harvard School of Public Health，USA）惠贈。SoxS缺失突變（Dukan and Touati, 1996）的E.coli由法國Jacques Monod Institute的Prof. Touati提供。

8、攜帶有完整的Xanthomonas campestris的gum基因片段的質(zhì)粒pIZD15-261（Katzen et al., 1996）由University of Argentina的Prof. Ielpi惠贈。2.2 分析方法、試劑和儀器細(xì)胞濃度可以通過分光光度計測量（Jasco, Japan）650nm處吸光值，利用細(xì)胞濃度對光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定。利用放大鏡計數(shù)平板上的菌落數(shù)目。黃原膠濃度的測量可以通過10000g離心45min，然后乙醇沉淀分離，測量其干重（Garcia-Ochoa et al., 1993）。提取出的黃原膠溶解在去離子水中，利用數(shù)字黏度計（Contraves low

9、 shear 30）在37和8s-1的剪切力下測量0.2g/L黃原膠溶液黏度（不是培養(yǎng)液黏度）。乙酸和丙酮酸的測定依照Blumerkrantz和Hansen（1973）以及Kennedy和Sutherland（1987）的方法。mRNA表達(dá)量可以在乙醇沉淀和純化除去不反應(yīng)的核糖后用分光光度計計量（Sadasivam and Manickam,1996; Wu et al., 1995）。核糖核苷酸和其他的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)從SRL, India購買。次氯酸從次氯酸鈉定量合成（SRL, India）并僅僅使用新配制的次氯酸。自旋標(biāo)記物前體，2,6-二甲基-4-哌啶酮從德國Fluka Chemicals

10、公司購買。寡核苷酸由印度Genetix購買。使用的生物反應(yīng)器是2L攪拌罐（1L工作體積）帶有兩個Rushton渦輪機(jī)葉輪和轉(zhuǎn)速、溫度控制裝置。在空氣流速為3L/min和葉輪300rpm轉(zhuǎn)速下，利用動態(tài)響應(yīng)（dynamic response）測定的容積氧傳遞系數(shù)（KLa）為32.5h-1。溶氧和pH的數(shù)據(jù)由一臺電腦上的數(shù)據(jù)獲得控制系統(tǒng)（SCR Elektroniks, India）通過探頭（Bela Instruments, India）實時獲得。一個電子旋轉(zhuǎn)共振（ESR）分光光度計用來獲得ESR光譜。2.3 處理過程簡要的說，HOCl對E.coli處理在利用。然而，HOCl濃度和菌體生長階段難

11、以界定。在必需的生長階段時，細(xì)胞濃度達(dá)到2g/L，懸浮于0.05M的磷酸緩沖液分裝到幾個25mL搖菌瓶中。瓶在使用前，用硫磺酸等徹底清洗。新配置的次氯酸，濃度用碘滴定法標(biāo)定，在三個階段方法加入到培養(yǎng)基中。每個階段包括60s的HOCl處理細(xì)胞，離心分離細(xì)胞，再用普通生長培養(yǎng)基30暗處溫和震蕩培養(yǎng)40分鐘。三個階段最初用HOCl處理步驟的使用濃度分別為：0.66mmol/g cell（階段I），4.65mmol/g cell（階段II），20mmol/g cell（階段III）。在第三次培養(yǎng)后，留在瓶中的自由氯可用無菌硫代硫酸鈉除盡。培養(yǎng)的菌種用LB瓊脂平板分析，在培養(yǎng)十小時后計數(shù)。2.4 培養(yǎng)研

12、究活菌分離后用前面提到的生長培養(yǎng)基，在30搖床中震蕩培養(yǎng)。生長實驗用1L生物反應(yīng)器30下進(jìn)行。2.5 DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究2.5.1 蛋白分離從細(xì)胞培養(yǎng)物中來進(jìn)行SoxS蛋白分離的方法是Li和Demple提出的（1994）。2.5.2 自旋標(biāo)記的SoxS蛋白合成順磁性標(biāo)簽2,2,6,6-四乙基哌啶酮-1-氧基，由2,6-二甲基-4-哌啶酮通過H2O2催化氧化，并標(biāo)記SoxS蛋白。過程由Wagner和Hsu（1969）提供的自旋標(biāo)簽準(zhǔn)備和蛋白標(biāo)記，不同的是，pH保持在6，防止SoxS不反應(yīng)并且正確形成希夫堿。2.5.3 寡聚核苷酸合成同包含有SoxS交感序列和對應(yīng)的甲基化序列（見結(jié)果與討論

13、）的gumB基因啟動子區(qū)域類似的寡聚核苷酸，由前面提到的供方獲得合成。2.5.4 電子自旋共振（ESR）檢測光譜測定SoxS-寡聚核苷酸結(jié)合通過ESR檢測SoxS蛋白同核苷酸序列結(jié)合，其原理是，當(dāng)標(biāo)記的底物被結(jié)合時，與之固定的自旋標(biāo)簽顏色變化，導(dǎo)致ESR譜線增寬（Morisett, 1976; Smith et al., 1976）。光譜線的高度減小和吸收曲線高斯分布的標(biāo)準(zhǔn)差增加可以量化光譜增寬的程度。高斯分布十分接近生物系統(tǒng)中的ESR吸收曲線，并且這種光譜曲線寬度和分布的標(biāo)準(zhǔn)差在數(shù)量上的一致性通過它們的數(shù)學(xué)表達(dá)是非常明顯的（Bolton et al., 1972; Borg, 1976）。石

14、英測量杯用來盛放樣品，在所有ESR分析中，每個不同的樣品體積相同（250L）。同時注意保持每個測量杯中的樣品濃度在要求的范圍內(nèi)。2.5.5 轉(zhuǎn)錄活性試驗含有全部gum基因的質(zhì)粒和分離純化的SoxS蛋白用作轉(zhuǎn)錄活性試驗。程序由Wu等提供（1995），是進(jìn)行mRNA分析。所有以不同方式描述的試驗至少重復(fù)了三次并且是不同時間。（張瓊林翻譯）3. 結(jié)果和討論3.1 致死濃度，菌落形態(tài)和黏性次氯酸（HOCl）的處理濃度的確定，是在添加了HOCl的普通生長瓊脂平板上，處理組達(dá)到同野生細(xì)胞相比只有50%存活的劑量（致死濃度LC50）。結(jié)果表明野生型Xanthomonas campestris細(xì)胞能夠耐受非常

15、低濃度的HOCl（LC50=9mM或4.5mmol/gcell）。野生型和HOCl處理過的菌體，在普通的生長平板上的菌落形態(tài)和黏度（黃原膠生產(chǎn)能力）在表一中示出。處理是來自野生型細(xì)胞的四個生長時期，名為對數(shù)期早期（1h），對數(shù)期中期（2.5h），穩(wěn)定期早期（10h），和穩(wěn)定期晚期（50h）。四個時期的野生型細(xì)胞都是圓形菌落并表現(xiàn)出黏液樣。HOCl處理組，早期的細(xì)胞體現(xiàn)出圓形菌落和黏性，然而生長晚期的細(xì)胞形成的菌落呈圓鋸齒形。電鏡檢查顯示，鋸齒形菌落的微結(jié)構(gòu)類似于經(jīng)溶菌酶處理的野生型細(xì)胞（結(jié)果未顯示）。溶菌酶除掉細(xì)胞壁，而圓鋸齒形菌落的形成也是由于細(xì)胞壁的破壞（Whitfield et al.,

16、 1981）。不過，同野生型相比，細(xì)胞的黏度更大，更多。表一 野生型和HOCl處理的Xanthomonas campestris細(xì)胞的菌落形態(tài)和黏度處理方法對數(shù)期早期對數(shù)期中期穩(wěn)定期早期穩(wěn)定期晚期無（野生型）圓形、黏圓形、黏圓形、黏圓形、黏HOCl圓形、黏圓鋸齒形、黏圓鋸齒形、黏圓鋸齒形、黏3.2 培養(yǎng)生長圖一表示了HOCl處理的細(xì)胞的生長情況。初濃度保持在0.63±0.02g/L。HOCl處理組的最大細(xì)胞濃度達(dá)到5.94±0.03g/L，這個可以和野生型相當(dāng)。生長可以通過Riccati公式模擬，這個方法用來模擬細(xì)胞生長由來已久（Bailey and Ollis, 1986

17、）： （1）這種模擬也在圖一中體現(xiàn)。對應(yīng)的最大濃度作為公式中的Xs。野生型和HOCl處理組的細(xì)胞生長速率相當(dāng)（通過最小二乘法分析），分別為0.6和0.65h-1。圖一 野生型和HOCl處理組的Xanthomonas campestris細(xì)胞生長曲線。點表明實驗數(shù)據(jù)，線表示模擬的生長趨勢。（）野生型細(xì)胞；（）HOCl處理細(xì)胞。（李盛兵翻譯）3.3 黃原膠性質(zhì)圖二示出野生型和HOCl處理組的黃原膠生產(chǎn)概括。50h時，野生型產(chǎn)黃原膠濃度達(dá)到3.1g/L，HOCl處理組產(chǎn)物濃度有6.5g/L，這個是相同培養(yǎng)基條件下野生型產(chǎn)量的210%。因此，HOCl處理顯著地提高了Xanthomonas campes

18、tris產(chǎn)黃原膠的最大能力。黃原膠在一定濃度和溫度下的水溶液的黏度，是表明其品質(zhì)的一個重要參數(shù)。黃原膠是由1-4葡萄糖苷鍵形成骨架，甘露糖、葡糖醛酸、醋酸、丙酮酸構(gòu)成側(cè)鏈的高聚物；它的品質(zhì)依賴于丙酮酸和醋酸在黃原膠中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)（Hassler and Doherty, 1990）。因此，我們分析了醋酸和丙酮酸分別在野生型和HOCl處理組的黃原膠產(chǎn)物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黏度。表二中的結(jié)果（到50h時的黃原膠生產(chǎn)）顯示出HOCl處理組的丙酮酸質(zhì)量含量是3.1%，比野生型的多63%。醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在野生型細(xì)胞產(chǎn)物中為5.7%，比HOCl處理組的3.3%高出72.7%。HOCl處理組細(xì)胞產(chǎn)的黃原膠黏度為4.

19、2cP，比野生型的3.5cP多了20%。據(jù)稱，黏度增加意味著丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加同時醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少（Hassler and Doherty, 1990），實驗結(jié)果也證明了這一點。不同程度的丙酮酸化（丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)）應(yīng)該是由兩個培養(yǎng)中不同的糖類含量引起的。膠中的糖類分析從氣象色譜分析儀（GCMS）獲得，在表三中顯示，表明，鼠李糖在HOCl處理組的產(chǎn)物中完全沒有，然而在野生型細(xì)胞產(chǎn)物中達(dá)到24%。同時，甘露糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)是37.5%，這個比野生型產(chǎn)物明顯高很多。有趣的是，葡萄糖和葡糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在HOCl處理組的黃原膠產(chǎn)物中與野生型產(chǎn)物基本一致。高含量的甘露糖必然引起高水平的丙酮酸化，因為丙酮酸化發(fā)生

20、在甘露糖末端（Melton et al., 1976）而且高的丙酮酸化程度會引起HOCl處理組產(chǎn)物比野生型產(chǎn)物黏度更高。圖二 野生型和HOCl處理組的黃原膠產(chǎn)量對比。（）野生型細(xì)胞；（）HOCl處理細(xì)胞。表二 野生型和HOCl處理組的黃原膠獲得的終濃度和性質(zhì)細(xì)胞類型50h時膠濃度（g/L）丙酮酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）醋酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）黏度（cP）野生型3.11.865.73.5HOCl處理組6.53.103.34.2表三 野生型和HOCl處理組的膠產(chǎn)品中的糖類分析細(xì)胞類型糖類野生型（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）HOCl處理組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）葡萄糖46.045.0甘露糖13.037.5鼠李糖24.00.00葡糖醛酸18.017.

21、53.4 自由基介導(dǎo)的黃原膠高產(chǎn)量的機(jī)理HOCl通過Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生自由基（Dukan and Touati, 1996），也就能了解到HOCl處理給Xanthomonas campestris帶來了自由基（Manjula Rao and Sureshkumar, 2000）。我們發(fā)現(xiàn)了通過自由基介導(dǎo)的黃原膠過量生產(chǎn)的機(jī)理。已經(jīng)研究出，黃原膠基因表達(dá)，在一般情況下，是由一個gumB基因上游的強(qiáng)啟動子所調(diào)節(jié)（Katzen et al., 1996）。因此，可以設(shè)想自由基可以激活前面提到的啟動子并增加膠產(chǎn)量。在這個研究中，因為我們已經(jīng)由HOCl獲得了自由基，可以證明

22、HOCl直接產(chǎn)生前面提到的效應(yīng)，而不是通過自由基。因此，如果是這樣的話，當(dāng)HOCl處理組細(xì)胞生長在痕量HOCl條件下，會有更高濃度的膠產(chǎn)量。但是，當(dāng)HOCl處理組細(xì)胞在4.6mol/g cell濃度的HOCl（痕量，初始濃度）下，在50h時，僅僅獲得了4.7g/L的黃原膠，與普通培養(yǎng)基中的6.5g/L產(chǎn)量可以做個對比。然而，生長并沒有受到顯著影響。這就印證了這個看法，HOCl的影響并不是直接的，而是通過自由基產(chǎn)生的。在E.coli中，對氧的衍生物造成的氧化環(huán)境的反應(yīng)，是通過SoxRS調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)的（Nunoshiba et al., 1994; Wu et al., 1995）。對過氧化環(huán)境的反

23、應(yīng)是通過OxyR調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)的；然而，因為用H2O2進(jìn)行了相似的處理沒有帶來黃原膠濃度的顯著增加（結(jié)果未顯示），這就有理由假設(shè)SoxRS調(diào)節(jié)子在研究中有重要作用。通過SoxR（敏感蛋白），一個細(xì)胞內(nèi)的氧化條件信號提高了SoxS水平。SoxS緊接著引起了一連串的幾種由調(diào)節(jié)子控制的基因的表達(dá)，應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)氧化條件。到目前，SoxRS調(diào)節(jié)子并沒有在以往的文獻(xiàn)中報道過。然而，Xanthomonas campestris中的可能用來應(yīng)對環(huán)境壓力如搞滲透壓培養(yǎng)或者是營養(yǎng)限制的雙元件的調(diào)節(jié)系統(tǒng)還是有一定了解的。我們懷疑Xanthomonas campestris中自由基介導(dǎo)的黃原膠過量生產(chǎn)的機(jī)理，涉及到SoxR

24、S調(diào)節(jié)子或者是類似的元件。作為一個適應(yīng)性反應(yīng)，SoxRS調(diào)節(jié)子的蛋白期望在隨后的世代中保持在一個高水平上，這可能會帶來膠的高表達(dá)，甚至是在缺少自由基介導(dǎo)物的條件下。我們觀察到，菌株保持了黃原膠的高表達(dá)持續(xù)了至少50代或者說是14次包括3到4個世代的傳代培養(yǎng)在處理后的。然而，表達(dá)量隨著傳代增加而減少。舉例來說，一次傳代后，黃原膠產(chǎn)量達(dá)到6.5g/L，二次傳代后到了5.4g/L，然而在14次傳代后，僅僅有3.3g/L，與之做對比的是野生型3.1g/L的產(chǎn)量。對SoxRS調(diào)節(jié)子帶來高表達(dá)黃原膠的假設(shè)如下：介導(dǎo)的自由基帶來了SoxRS調(diào)節(jié)子激活；調(diào)節(jié)蛋白SoxS，同gumB基因的強(qiáng)啟動子結(jié)合，引起黃原

25、膠過量生產(chǎn)。后面的文字詳細(xì)介紹了所提出的假設(shè)中關(guān)于蛋白-DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄方面的實驗證明。另外，高濃度的HOCl（對于E.coli：高于57M，轉(zhuǎn)換作2.1mmol/g cell），有可能破壞一些抗氧化酶如谷胱甘肽（Dukan et al., 1999）并且這就引起了大量的自由基形成。這些過量的自由基，緊接著進(jìn)一步激活了SoxRS調(diào)節(jié)子，引起黃原膠高產(chǎn)和更高的超氧化物歧化酶（SOD）活性。超氧化物歧化酶是眾所周知的抗氧化酶（Halliwell and Gutteridge, 1985）并且更高的SOD活性在HOCl處理的Xanthonomas campestris中有發(fā)現(xiàn)（Manjula Rao

26、 and Sureshkumar, 2000）。（陳家瑞翻譯）3.5 SoxS蛋白同Gum B啟動子結(jié)合SoxS的特異性交感序列由Li和Demple（1996）測出：AN2GCAYN7CWA其中，N代表任意堿基，Y是一種嘧啶，W是A或T。同時，相關(guān)的不同基本序列的重要性不同，GCAY是最重要的。根據(jù)SoxS識別片段，幾種由SoxRS潛在調(diào)節(jié)的基因已經(jīng)由E.coli基因組數(shù)據(jù)庫確定（Li and Demple, 1996）。我們檢查Xanthomonas campestris的gumB啟動子域（在gumB基因上游的-35區(qū)）：CCGGCACGCGTCGGGAT并且在其中發(fā)現(xiàn)最重要的SoxS蛋白識

27、別位點（由斜體標(biāo)出）。因此，SoxS蛋白很有可能同gumB基因啟動子域結(jié)合。為了深入研究SoxS蛋白同gumB基因啟動子的結(jié)合，我們合成了一段寡聚核苷酸，同gumB基因啟動子包括SoxS交感序列一樣。分離出的SoxS蛋白真實性由SoxS抗體證明，通過ESR檢測，如“材料與方法”中所述。譜線峰高減少了5.6%并且標(biāo)準(zhǔn)差增加了200%，這就表明了結(jié)合。SoxS蛋白同SoxS抗體結(jié)合也通過免疫電泳法證明了（數(shù)據(jù)未顯示）。寡聚核苷酸-蛋白（DNA-蛋白）相互作用也通過ESR研究。帶有自旋標(biāo)記蛋白的寡聚核苷酸的ESR譜線（圖三）顯示出高度減少了21.3%，標(biāo)準(zhǔn)差增加了20.1%。這個結(jié)果顯示出，蛋白確實

28、同寡聚核苷酸相結(jié)合。相似的結(jié)果通過E.coli SoxS蛋白和寡聚核苷酸獲得，這證明了在Xanthonomas campestris中的SoxS蛋白可能與E.coli中發(fā)現(xiàn)的類似。圖三 （A）自旋標(biāo)記SoxS蛋白的ESR譜線；（B）帶有寡聚核苷酸的自旋標(biāo)記SoxS蛋白的ESR譜線3.6 DNA-蛋白結(jié)合的特征對照組用來排除非特異性蛋白寡聚核苷酸結(jié)合。用作對照組的是自旋標(biāo)記抗血清，一種包括白蛋白和一種SoxS缺失突變的自旋標(biāo)記蛋白提取物。每種對照和寡聚核苷酸結(jié)合也通過ESR檢測?？梢杂^察到，當(dāng)分別同寡聚核苷酸混在一起時，沒有明顯的光譜特征的變化，因此，SoxS同寡聚核苷酸的結(jié)合是高度專一的。蛋白

29、特異性地結(jié)合在gumB啟動子的GCAY序列可以通過特殊的甲基化GCAY其中一個堿基并且檢測SoxS同甲基化寡聚核苷酸的結(jié)合這種實驗來證明。已知，甲基化可以干擾蛋白-DNA結(jié)合（Li and Demple, 1996）。我們研究了自旋標(biāo)記SoxS蛋白和帶有一個甲基化G（表示在如下序列中星號標(biāo)記）的寡聚核苷酸之間的反應(yīng)：CCGG*CACGCGTCGGGAT發(fā)現(xiàn)在存在或者缺少甲基化寡聚核苷酸時，沒有顯著的光譜改變（譜線沒有列出）這表明了SoxS蛋白沒有同甲基化的寡聚核苷酸結(jié)合。因此，可以得出結(jié)論，SoxS蛋白同gumB啟動子域的GCAY序列特異性結(jié)合。3.7 SoxS引起的一連串gum基因轉(zhuǎn)錄激活在

30、SoxS蛋白結(jié)合啟動子域后，下一步就是有關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄。確定是否Sox結(jié)合會引起下一步合成黃原膠生產(chǎn)相關(guān)基因，我們估量了存在和缺少SoxS下的mRNA的獲得水平（和其他必需的寡聚核苷酸）。SoxS存在時的mRNA濃度為比缺少SoxS高很多。SoxS增加mRNA水平的事實證明了SoxS為一連串gum基因的轉(zhuǎn)錄激活子。4. 結(jié)論利用HOCl處理得到自由基提高黃原膠的產(chǎn)量和品質(zhì)，這樣的一個新的方法由此提出。存在和不存在HOCl的Xanthomonas campestris生長速率基本相同。同時，HOCl處理帶來了黃原膠品質(zhì)的顯著提高。醋酸、丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和膠中糖類的波譜，HOCl處理的菌株同野生型

31、菌株分泌的膠不同。一個解釋自由基介導(dǎo)高產(chǎn)黃原膠的機(jī)理也闡述明確，并且得到了實驗證實：SoxS蛋白同gumB基因啟動子特異性結(jié)合位點；高mRNA通過SoxS存在時gum基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。參考文獻(xiàn)Bailey J, Ollis D. 1986. Biochemical engineering fundamentals. New York: McGraw-Hill. Bjerrum OJ, Bog-Hansen TC. 1976. Immunochemical gel precipitation techniques in membrane studies. In: Maddy AH, editor.

32、Biochemicalanalysis of membranes. London: Chapman-Hall.Bolton JR, Borg DC, Swartz HM. 1972. Biological applications of electron spin resonance. New York: Wiley Interscience.Borg DC. 1976. Applications of ESR in biology. In: Pryor WA, editor. Free radicals in biology. New York: Academic Press.Blumerk

33、rantz N, Hansen AG. 1973. Determination of acetate and pyruvate contents in xanthan gum. Anal Biochem 54:483489.Chamnongpol S, Vattanaviboon P, Lopraset S, Mongkolsuk S. 1995. Atypical oxidative stress regulation of a Xanthomonas oryzae pv. oryzaemonofunctional catalase. Can J Microbiol 41:541547.Du

34、kan S, Touati D. 1996. Hypochlorous acid stress in Escherichia coli: resistance, DNA damage and comparison with hydrogen peroxidestress. J Bacteriol 178:61456150.Dukan S, Belkin S, Touati D. 1999. Reactive oxygen species are partially involved in bacteriocidal action of hypochlorous acid. Arch Bioch

35、emBiophys 367:311316.Farr SB, Kogoma T. 1991. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol Rev 55:561585.Feig DI, Loeb LA. 1994. Oxygen radical induced mutagenesis is DNA polymerase specific. J Mol Biol 235:3341.Feig DI, Reid TM, Loeb LA. 1994. Reactive oxygen

36、 species in tumorigenesis. Cancer Res 54(suppl):1890s1894s.Grac´a-Ochoa J, Casas JA, Mohedano AF. 1993. Xanthan precipitation from solutions and fermentation broths. Sep Sci Technol 28: 13031313.Halliwell B, Gutteridge JM. 1985. Free radicals in biology and medicine. Oxford, UK: Clarendon Press

37、.Hassler RA, Doherty DH. 1990. genetic engineering of polysaccharide structure: Production of variants of xanthan gum in Xanthomonascampestris. Biotechnol Progr 6:182187.Hindalgo E, Demple B. 1994. An ironsulfur center essential for transcriptional activation by the redox-sensing soxR protein. Eur M

38、ed Biol Org J 13:138146.Katzen F, Becker A, Zorreguieta A, Puhler A, Ielpi L. 1996. Promoter analysis of the Xanthomonas campestris pv. campestris gum operondirecting biosynthesis of the xanthan polysaccharide. J Bacteriol 178: 43134318.Kennedy AFD, Sutherland IW. 1987. Analysis of bacterial exopoly

39、saccharides. Biotechnol Appl Biochem 9:1219.Lee BH. 1996. Fundamentals of food biotechnology. Weinheim: VCH.Li Z, Demple B. 1994. SoxS as an activator of superoxide stress genes inEscherichia coli. J Biol Chem 269:1837118377.Manjula Rao Y, Sureshkumar GK. 2000. Direct biosynthesis of ascorbic acid f

40、rom glucose by Xanthomonas campestris through induced freeradicals. Biotechnol Lett 22:407411.Melton LD, Mindt L, Rees DA, Sanderson GR. 1976. Covalent structure of the extracellular polysaccharide from Xanthomonas campestris: Evidence from partial hydrolysis studies. Carbohydr Res 46:245257.Morrise

41、tt JD. 1976. The use of spin labels for studying the structure and function of enzymes. In: Berliner LJ, editor. Spin labeling. New York:Academic Press.Nagarathnamma M, Rajan M, Sureshkumar GK. 1997. Apoptosis extent increases in hybridoma cultures with temperature. Biotechnol Lett 19:669673.Nunoshi

42、ba T, deRojas WT, Wishnok JS, Tannenbaum SR, Demple B. 1993. Activation of nitric oxide of an oxidative-stress response thatdefends Escherichia coli against activated macrophages. Proc Natl Acad Sci 90:99939997.Okuno S, Shimizu S, Ito T, Nomura M, Hamada E, Tsujimoto Y, Matsuda H. 1998. Bcl-2 preven

43、ts caspase-independent cell death. J Biol Chem273:3427234277.Osbourn AE, Clarke BR, Stevens BJH, Daniels S. 1990. Use of oligonucleotide probes to identify members of two-component regulatorysystems in Xanthomonas campestris pathovar campestris. Mol Gen Genet 222:145151.Reid TM, Loeb LA. 1993. Effect o