生物專業(yè)創(chuàng)新實驗指導(dǎo)書

1、生物化工創(chuàng)新實驗指導(dǎo)目 錄實驗室規(guī)范1安全規(guī)范2第一章 實驗室啤酒發(fā)酵概論4第二章 啤酒質(zhì)量檢測6第一節(jié) 酵母計數(shù) 6第二節(jié) 酵母質(zhì)量檢測7第三節(jié) 斐林試劑法測定還原糖8第四節(jié) -氨基氮測定10第五節(jié) 酒精度測定12第六節(jié) 雙乙酰測定13生物實驗室須知一、實驗室規(guī)范1. 實驗室中應(yīng)穿實驗服，以避免受藥品侵蝕或其它污染。2. 在實驗室中不可飲食抽煙，上課時保持安靜。實驗課應(yīng)按組別入座，不可任意變更座位。3. 未經(jīng)允許不得動用實驗室中之儀器與藥品或私自進(jìn)行未經(jīng)教師許可之實驗，須在教師講解后才可操作。4. 凡各種廢棄物應(yīng)按規(guī)定方式丟棄，實驗后之藥品、溶液應(yīng)倒入指定容器，不可任意倒入水槽。5. 實驗完

2、畢后應(yīng)將儀器歸位，器械清洗干凈、熄滅燈火，關(guān)閉自來水，清理桌面后方得離去。每次實驗完畢，值日組應(yīng)負(fù)責(zé)清掃實驗室。6. 實驗室內(nèi)各種實驗的樣品及微生物培養(yǎng)，皆不可任意攜出實驗室。 7. 實驗室內(nèi)禁止用口吸取微生物樣品，禁止擅自帶走實驗室藥品。8. 在操作過程的開始前及終止后，雙手都必須以藥皂與70 % 的酒精水溶液清洗。 9. 微生物實驗內(nèi)，任何微生物的樣品、廢棄物 (對具感染性的廢棄物應(yīng)特別注意) 都必須高溫高壓滅菌后，才能以一般垃圾處理。 二、安全守則1. 許多實驗用藥品會對身體造成傷害，因此應(yīng)避免身體肌膚直接與藥品接觸、盡量避免吸入揮發(fā)性氣體，實驗完畢后徹底洗手。2. 酒精燈在添加酒精時應(yīng)

3、先將火焰熄滅，酒精添加不可過滿。引燃酒精燈時應(yīng)使用打火機，而不可用另一酒精燈引燃。3. 玻璃器皿的破碎常造成割傷，因此打破的玻璃不要以手撿取，清洗玻璃器皿時最好戴上手套。4. 儀器與桌面保持清潔，若有強酸或其它腐蝕性藥品流出應(yīng)立即用水加以清洗。5. 取用藥品時務(wù)必注意藥品名稱、濃度是否符合實驗所需，以避免誤用造成危險。6. 揮發(fā)性溶劑萃取、強酸取樣、有毒物質(zhì)應(yīng)在排氣柜內(nèi)操作，始終保持室內(nèi)通風(fēng)。7. 嚴(yán)禁在實驗室水槽中排放腐蝕及劇毒溶液，傾倒少量廢液必須用大量水沖洗。8. 若發(fā)現(xiàn)一切可能不安全因素，請立即匯報實驗室老師，盡早消除隱患。第一章 實驗室啤酒發(fā)酵概論啤酒是一種以麥芽和水為主要原料，加啤

4、酒花經(jīng)發(fā)酵釀造而成的含有二氧化碳的低酒精度發(fā)酵酒。自從1900年俄羅斯商人在哈爾濱創(chuàng)建我國第一家啤酒廠后，到2003年，我國已發(fā)展成世界第一大啤酒生產(chǎn)國。啤酒的釀造工藝為：麥芽 粉碎 糖化 麥汁過濾 煮沸 冷卻 發(fā)酵 過濾 除菌 貼標(biāo) 裝箱啤酒的釀造必須制備麥芽汁，然后冷卻的麥汁中接種酵母，進(jìn)行啤酒主發(fā)酵，發(fā)酵周期大約為1星期，發(fā)酵液糖度由1012°下降到4°，然后在02°的密閉罐中進(jìn)行后發(fā)酵，啤酒才可成熟。一、麥汁準(zhǔn)備（協(xié)定法糖化） 1）100 g 麥芽經(jīng)粉碎機粉碎，并加入準(zhǔn)確稱量的糖化杯中， 加入50 g 麥芽粉與4647水 400 ml，充分?jǐn)嚢瑁?5保溫3

5、0 min;2) 將醪液升溫加熱，以每分鐘提高1的速度在25 min內(nèi)使醪液溫度上升至70，并加入100 ml 70 水； 3）醪液于70保溫大約1小時（至糖化完全），1015 min內(nèi)急速冷卻到室溫（測定糖化時間）； 4）擦干糖化杯，準(zhǔn)確稱量其內(nèi)容物并補水至900 g； 5）過濾收集100 ml濾液，復(fù)濾； 6）測定濾液的糖度（糖度計）；發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)糖度到10°P 7）將濾液分裝滅菌：將50 ml濾液裝入100 ml三角瓶中滅菌，其余濾液裝入1000 ml三角瓶中，并加入1 g 啤酒花，煮沸2、將斜面酵母菌種全部接入50 ml 麥汁三角瓶中，25培養(yǎng)，并不時搖動； 3、培養(yǎng)15-

6、16小時，將50 ml 酵母種子接入到100 ml麥汁三角瓶中，充分搖動，并于室溫靜止培養(yǎng)（大約10）；二、啤酒發(fā)酵擴大培養(yǎng) 按照協(xié)定法糖化方法，稱取麥芽1000 g，糖化定容至9 L，并收集濾液（使用紗布過濾），降溫至室溫并接種酵母菌，充分搖勻，靜止培養(yǎng)；于培養(yǎng)第三天開始測定與啤酒發(fā)酵相關(guān)的參數(shù)，參數(shù)如下：1) 酵母質(zhì)量檢查（出芽率，死亡率，血球計數(shù)板計數(shù)）2) 還原糖氨基氮測定3) 酒精度；4) 雙乙酰含量；5) 苦味質(zhì)與CO2含量第二章 啤酒質(zhì)量檢測第一節(jié) 酵母計數(shù) 酵母計數(shù)采用血球板計數(shù)法一、 實驗器材顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片二、 實驗步驟（1） 取潔凈計數(shù)板一塊，平放于桌面上，在計

7、數(shù)室上方加蓋玻片（2） 取除氣發(fā)酵液一小滴，滴至蓋玻片的邊緣，使菌液自然滲入計數(shù)室內(nèi)（計數(shù)室內(nèi)不能留有氣泡）（3） 靜置4-5 min，使酵母細(xì)胞穩(wěn)定附著于計數(shù)室內(nèi)（4） 在顯微鏡下觀察酵母菌數(shù)（5） 酵母菌數(shù)的計算第二節(jié) 酵母質(zhì)量檢測一、 實驗原理酵母的質(zhì)量直接決定到啤酒的好壞，酵母活力強，發(fā)酵就旺盛，否則啤酒即會變質(zhì)，因此必須檢測酵母的狀態(tài)。二、實驗器材1. 器材：顯微鏡、恒溫水浴、溫箱、滅菌鍋、三角瓶2. 試劑：0.025美藍(lán)水溶液：0.025 g美藍(lán)溶于100 ml水中pH4.5醋酸緩沖液：0.51 g硫酸鈣，0.68 g硫酸鈉，0.405 g冰醋酸溶解于100 ml水中三、 實驗步驟

8、1. 顯微鏡檢測菌體形態(tài)：挑取少量菌液，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察，優(yōu)良酵母形態(tài)均勻、表面光滑，細(xì)胞質(zhì)透明均勻；老熟的細(xì)胞出現(xiàn)液泡，顆粒性儲藏物多，折光率強。2. 死亡率檢測：酵母用美藍(lán)水溶液染色后，由于活細(xì)胞具有脫氫酶活性，可將藍(lán)色的美藍(lán)還原成無色的美藍(lán)，因此染不上顏色，而死細(xì)胞則被染上藍(lán)色3. 出芽率檢測：出芽率是指出芽的酵母細(xì)胞占總酵母細(xì)胞數(shù)的比例，選擇5個視野，觀察出芽酵母細(xì)胞所占的比例并求取平均值（一般對數(shù)生長期的酵母出芽率>60%）第三節(jié) 斐林試劑法測定還原糖一、實驗原理CuSO4與NaOH反應(yīng)生成藍(lán)色Cu(OH)2沉淀，Cu(OH)2與酒石酸鉀生成可溶性的藍(lán)色絡(luò)合物，此絡(luò)合物

9、中的Cu為2價，為氧化態(tài)形式，還原糖能夠?qū)u2還原成CuO紅色沉淀，但是CuO沉淀的終點顏色變化較難確定，將氧化性較低的1的美藍(lán)作為指示劑更容易判斷反應(yīng)的終點，因此加入美藍(lán)后，Cu2被完全還原后，美藍(lán)就會被還原糖還原為無色的美藍(lán)，因此，可通過此方法測定還原糖的濃度。二、實驗器材與試劑1、 器材： 電爐、堿式滴定管2、 實驗試劑：（1） 斐林試劑甲液：稱取3.4639 g結(jié)晶硫酸銅，溶于50 ml水中，如有沉淀須過濾乙液：稱取17.3 g酒石酸鉀，5 g NaOH，溶于50 ml水中（甲、乙溶液分別保存）（2）0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱量105烘干至恒重的分析純葡萄糖0.500 g，水溶解后

10、加入2.5 ml濃鹽酸，定容至250 ml；（3）1亞甲基藍(lán)指示劑：0.5 g美藍(lán)溶于50 ml蒸餾水中三、實驗步驟1、 斐林試劑的標(biāo)定：由于試劑純度差異、稱量定容時的誤差，所配置的斐林試劑氧化能力有差異，因此需要對斐林試劑進(jìn)行校準(zhǔn)，配置準(zhǔn)確時，甲、乙液各5 ml可氧化25 ml 0.2的葡萄糖溶液1) 預(yù)滴定：準(zhǔn)確吸取甲、乙溶液各5 ml，放入250 ml三角瓶中，加入水約20 ml，并從滴定管中加入約24 ml 0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，將三角瓶在電爐上加熱煮沸，維持2 min，加入1亞甲基藍(lán)指示劑2滴，在沸騰狀態(tài)下以每秒1滴的速度滴入0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，至溶液藍(lán)色變?yōu)轷r紅色為止（滴定操作在

11、1 min內(nèi)完成）記錄總耗糖量V；2) 正式滴定：步驟如上，用(V1) ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖代替24 ml葡萄糖溶液，最后在1 min 內(nèi)完成滴定，記錄消耗總葡萄糖量V1；3) 斐林試劑校正系數(shù)F=CV1/F0 （F0可查）2. 樣品滴定：1) 稀釋：樣品除氣過濾后，稀釋（麥汁稀釋20 倍，啤酒主發(fā)酵期稀釋10倍）2) 滴定：以樣品代替標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（需預(yù)滴定與滴定）3) 計算：G：麥汁中浸出物含量百分?jǐn)?shù)D：麥汁20度時的相對密度第四節(jié) -氨基氮測定一、實驗原理：啤酒中的-氨基占氨基酸總量的絕大部分，-氨基可被茚三酮氧化脫羧成為減少一個碳的醛，并釋放出氨氣和二氧化碳，而水合茚三酮本身被還原成還原型水

12、合茚三酮，還原型水合茚三酮與未還原的茚三酮及氨反應(yīng)生成藍(lán)紫色羧合物，顏色與游離氨基成正比，在570 nm下比色檢測。二、實驗器材與試劑：（1） 器材：分光光度計，電爐，比色管，帶玻璃球試管（2） 試劑：A: 顯色劑：稱取10 g磷酸氫二鈉，6 g磷酸二氫鉀，0.5 g水合茚三酮，0.3 g果糖，用水溶解后定容至100 ml（pH6.66.8），棕色試劑瓶低溫保存B：碘酸鉀稀釋液：0.2 g碘酸鉀溶于60 ml水中，加入40 ml 96乙醇C：標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸貯備溶液：準(zhǔn)確稱取0.1072 g甘氨酸，溶解并定容到100 ml，4保存，使用時稀釋100倍。三、實驗步驟：（1） 樣品稀釋：稀釋樣品至含有1

13、3 ug氨基氮/ml（麥汁稀釋約100倍，啤酒稀釋50倍，樣品需除氣過濾）（2） 滴定：取九支試管，3支吸入2 ml甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，3支吸入2 ml試樣稀釋液，3支吸入2 ml水對對照；各加入顯色劑1 ml，搖勻，在沸水浴中加熱16 min，然后迅速取出在20水浴中冷卻至20 min，分別加入5 ml碘酸鉀稀釋液，搖勻，在30 min內(nèi)570 nm波長下檢測。第五節(jié) 酒精度測定一、實驗原理 蒸餾能夠?qū)l(fā)酵液中的酒精蒸餾出，收集餾出液并測定其密度，根據(jù)密度酒精度對照表可查的酒精含量。 （酒精度指在20時酒精水溶液與同體積純水的質(zhì)量比，求出相對密度，然后查表得出樣品中酒精的體積分?jǐn)?shù)）二、實驗器材電

14、爐、變壓器、鐵架臺、500 ml蒸餾瓶、蛇形冷凝管、100 ml容量瓶三、實驗步驟 1、在精確稱量的500 ml蒸餾瓶中，用容量瓶稱取100 ml除氣并經(jīng)過濾的發(fā)酵液，用50 ml蒸餾水分三次沖洗容量瓶，洗液加入蒸餾瓶中；2、連接好蒸餾裝置，冷凝器下端接100 ml容量瓶接受餾出液；打開冷凝水，加熱至沸騰蒸餾，餾出液接近100 ml時停止（時間控制在3060 min）；餾出液在20平衡后定容至100 ml，混勻；3、使用密度計測定餾出液密度。 第六節(jié) 雙乙酰測定一、 實驗?zāi)康模毫私怆p乙酰含量，監(jiān)測啤酒質(zhì)量二、 實驗原理雙乙酰（丁二酮）是賦予啤酒風(fēng)味的重要物質(zhì)，但含量過大會引起啤酒的餿味，其風(fēng)味

15、閾值較低（0.1 mg/L），因此，對清爽型啤酒而言，雙乙酰含量控制在0.1 mg/L，對高檔啤酒，雙乙酰含量應(yīng)控制在0.05 mg/L以下。葡萄糖經(jīng)過EMP途徑生成丙酮酸和活性乙醛在乙酰乳酸合成酶的催化下形成乙酰乳酸，其中一部分被排出酵母體外，通過非酶氧化脫羧而形成雙乙酰。雙乙酰的測定方法有氣相色譜法，比色法等。鄰苯二胺比色法是連二酮類都能發(fā)生顯色反應(yīng)的方法。因此，此法測定所的之值為連二酮的總量，結(jié)果偏高。但是啤酒中2，3戊二酮的量比雙乙酰低很多，其風(fēng)味閾值（1 mg/L）比雙乙酰較高，對啤酒風(fēng)味不起多大作用。用蒸汽將雙乙酰從樣品中蒸餾出來，加鄰苯二胺形成2，3二甲基喹喔啉，其鹽酸鹽在335

16、 nm波長下有一個最大吸收峰，可進(jìn)行定量測定。三、 實驗器材與試劑1、 器材：分光光度計，石英比色杯，雙乙酰蒸餾裝置2、 試劑：a) 4 mol/L鹽酸b) 10 g/L鄰苯二胺：精密稱取分析純鄰苯二胺100 mg/L，溶于4 mol/L鹽酸中，并定容到10 ml，搖勻，儲于棕色試劑瓶中，暗處保存，限當(dāng)日使用c) 消泡劑：有機硅消泡劑或甘油聚醚d) 雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.5000 g雙乙酰，溶解于100 ml蒸餾水中，棕色試劑瓶儲于冰箱中。臨用前吸取5.00 ml儲備液，稀釋成1000 ml，此溶液的濃度為0.25 mg/ml。四、 實驗步驟1. 將雙乙酰蒸餾裝置安裝好，把夾套蒸餾器下端的排氣夾打開2. 將內(nèi)裝2.5 ml重蒸水的容量瓶放于冷凝器下，使出口尖端浸沒在水下面，外加冷凝水冷卻3. 加熱蒸汽發(fā)生器至沸騰，通氣加熱夾套，備用4. 于100 ml 容量瓶中加入24滴消泡劑，再注入5未除氣的啤酒100 ml5. 待夾套蒸餾器下端冒大大氣時，打開進(jìn)氣口瓶塞，將啤酒迅速注入蒸餾器內(nèi)，再用約10 ml蒸餾水沖洗量筒，同時倒入，迅速