RACE技術(shù)的原理和操作

1、RACE技術(shù)的原理和操作近年來隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)二基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術(shù)步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優(yōu)勢而受到越來越多的重視。經(jīng)典的RACE技術(shù)是由Frohman等（1988）發(fā)明的一項技術(shù)，主要通過RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列

2、來得到完整的cDNA5'和3'端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術(shù)提出以來經(jīng)過不斷發(fā)展和完善，克服了早期技術(shù)步驟多、時間長、特異性差的缺點（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。對傳統(tǒng)RACE技術(shù)的改進主要是引物設(shè)計及RT-PCR技術(shù)的改進：改進之一是利用鎖定引物（lock docking primer）合成第一鏈cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入兩個簡并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/

3、C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始點，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo（dT）與poly（A）尾的任何部位的結(jié)合所帶來的影響；改進之二是在5' 端加尾時，采用poly（C），而不是poly（A）；改進之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫（60 -70）有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA，從而消除了5'端由于高CC含量導(dǎo)致的mRNA 二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的影響；改進之四是采用熱啟動PCR （hot start PCR）技術(shù)和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反應(yīng)的特異性。隨著RACE技術(shù)日益完善，

4、目前己有商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術(shù)和SMARTTM RACE技術(shù)。邢桂春等（2001）先后使用上述兩種試劑盒進行RACE反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于MarathonTM技術(shù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)往往不能真正達到mRNA的5' 末端。所以認為，進行RACE反應(yīng)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內(nèi)目前應(yīng)用最廣的SMARTTM RACE試劑盒為例，簡要概述RACE技術(shù)的原理和操作過程。SMARTTM 3'-RACE的原理利用mRNA的3'末端

5、的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準第一鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。（見Figure 1）Figure 1.SMARTTM 5'-RACE的原理先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以O(shè)li

6、go（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準第一鏈cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達到第一鏈的5'末端時自動加上3-5個（dC）殘基，退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭（見Figure 2 ）。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，

7、把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。最終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產(chǎn)物的3'和5'端序列，合成相應(yīng)引物擴增出全長cDNA。Figure 2.實驗中發(fā)現(xiàn)，做RACE反應(yīng)實驗實際操作中仍存在不少困難。因此，對RACE反應(yīng)條件進行反復(fù)摸索是十分必要的。這是因為：第一，在5'-RACE包含了有3個連續(xù)的酶反應(yīng)步驟（反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾和PCR擴增），每一步都可能導(dǎo)致失?。坏诙?，擴增DNA末端的特異性完全依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現(xiàn)不清晰的成片條帶或截短的產(chǎn)物背景。因此，使用RACE技術(shù)擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆最好能夠全部測序，以排除RACE實驗結(jié)果中擴增產(chǎn)物假陽性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。隨著RACE的不斷改進和完善，優(yōu)化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR產(chǎn)物克隆技術(shù)的迅速發(fā)展，RACE必將在基因克隆及基因表達研究中發(fā)揮越來越大的作用。RACE的另一種代表方法-Self-L