實驗二稻米中蛋白質(zhì)含量的測定

1、實驗二 稻米中蛋白質(zhì)含量的測定 本實驗的目的是學(xué)會各種蛋白質(zhì)含量的測定方法，比較不同方法的測定結(jié)果的差距，知道稻米中蛋白含量的范圍。一、雙縮脲法（Biuret法）（一）實驗原理 雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩 個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。（二）試劑與器材1. 試劑：（1）標

2、準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成5mg/ml的標準蛋白溶液，牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005N KOH配制。（2）雙縮脲試劑：稱以克硫酸銅（CuSO45H2O）和克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O64H2O），用100毫升水溶解，在攪拌下加入60毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到200毫升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。 2. 器材： 可見光分光光度計、試管10支、旋渦混合器等。（三）操作方法1. 標準曲線的測定：取7支試管分兩組，分別加入0，0.1，毫升的標準蛋

3、白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20-25）下放置30分鐘，于550nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。2、樣品的測定：稱取被測樣品（過100目篩），放入干燥的150ml三角瓶中，先加入1ml四氯化碳再加入50ml雙縮脲試劑，蓋上瓶塞，利用振蕩器振蕩5分鐘后， 再于室溫下放置30分鐘，取適量溶液倒入離心管中，在4000r/min下離心10分鐘，將澄清的上清液倒出，取3個試管，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。雙縮脲法實驗表格 管 號 1 2 3

4、 4 5 6 7 8 9 10標準蛋白質(zhì)(5.0mg/ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 未知蛋白質(zhì)(約8.0mg/ml) 0.5 0.5 0.5 蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0.5 0.5 雙縮脲試劑 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值（A550）3.用標準蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標，用吸光度值A(chǔ)550為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A550值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。二、考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一

5、）實驗原理 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。（二）試劑與器材 1. 試劑：（1）標準蛋白質(zhì)溶液，用 牛血清清蛋白(BS

6、A)或酪蛋白，配制成的標準蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮蘭G250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。 2. 器材： （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器 （3）試管10支（三）操作方法1.取10支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用的標準蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、，然后用無離子水補充到。最后各試管中分別加入考馬斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。2

7、. 稱取被測樣品（過100目篩），放入干燥的150ml三角瓶中，先加入1ml四氯化碳再加入50ml考馬斯亮蘭G250試劑，蓋上瓶塞，利用振蕩器振蕩5分鐘后， 再于室溫下放置20分鐘 ，取適量溶液倒入離心管中，在4000r/min下離心10分鐘，將澄清的上清液倒出，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595。注意：可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡?？捡R斯亮蘭法實驗表格： 管 號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標準蛋白質(zhì)(1.0mg/ml) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白質(zhì)(約2.0mg/ml) 0.05 0.05 0.05 蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.05 0.05 0.05 考馬斯亮藍G250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值（A595）3.用標準蛋白