大鼠腹部開放傷海水浸泡后胃黏膜氨基己糖和磷脂的變化(一)

1、大鼠腹部開放傷海水浸泡后胃黏膜氨基己糖和磷脂的變化(一)作者：朱雄偉 施文興 湛先保 王強(qiáng) 仇明 胡志前 李兆申【摘要】目的：探討大鼠腹部開放傷后海水浸泡的胃黏膜中氨基己糖和磷脂的改變。方法：32只SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和腹腔浸泡傷1h、2h、3h 4組，分別取相應(yīng)大鼠的胃黏膜，采用化學(xué)比色法和改良抗壞血酸法測(cè)定胃黏膜中氨基己糖和磷脂含量。結(jié)果：與正常組大鼠相比，腹腔浸泡傷組大鼠胃黏膜氨基己糖和磷脂隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)行性減低（P0.05）,并在3h時(shí)達(dá)最低。結(jié)論：海水浸泡傷是一損傷性因素，通過減低胃黏膜中氨基己糖和磷脂含量而損害腹腔浸泡傷的大鼠胃黏膜屏障?！娟P(guān)鍵詞】海水?腹部損傷?胃粘

2、膜?氨基己糖?磷脂類?大鼠，SpragedawleyThe changes of hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats with seawater immersion after open abdominal trauma【ABSTRACT】Objective:To explore the changes of hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats with open abdominal trauma after seawater immersion.

3、Methods:Thirtytwo rats were randomly divided into four groups(normal control group,celiac seawaterimmersing trauma stress 1,2,3h groups).The amount of hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats were detected by both chemochromometric and modified chemical methods.Results:Compared with no

4、rmal rats,both hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats under celiac seawaterimmersing trauma are progressively decreased(P0.05),especially in stress 3h group.Conclusion:Seawater immersing trauma is a harmful factor,it deteriorates gastric mucosal barrier in rats with open abdominal tr

5、auma after seawater immersion through lowering the content of hexosamine and phospholipids.【KEY WORDS】Seawater?Abdominal injuries?Gastric mucosa?Phospholipid?Rats,Spraguedawley 急性胃黏膜病變（acute gastric mucosal lesion,AGML）是創(chuàng)傷后最為常見的內(nèi)臟并發(fā)癥之一，一旦合并大量出血，處理非常困難，死亡率高，嚴(yán)重威脅病人的生命。在現(xiàn)代海戰(zhàn)和渡海登陸戰(zhàn)爭(zhēng)中，由于特殊的戰(zhàn)爭(zhēng)環(huán)境，海水進(jìn)入受傷開放性

6、腹腔內(nèi)的情況會(huì)時(shí)有發(fā)生。我們以前的實(shí)驗(yàn)1證實(shí)，海水浸泡傷后胃黏膜可發(fā)生AGML。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了AGML磷脂和氨基己糖的改變，為海水浸泡傷的早期綜合救治提供新的思路。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物分組和模型制作 SD大鼠（第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供）32只，體重200300g，清潔級(jí)，雌雄各半，隨機(jī)分為4組：0h組（正常組），腹腔開放傷浸泡人工海水組分為1h、2h、3h3組。模型制作參照文獻(xiàn)1進(jìn)行。為消除生物節(jié)律對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，均于上午8時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。造模前禁食24h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前1h禁水。1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)、DHG9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、水浴鍋、82

7、2型恒溫磁力攪拌器、UV754型紫外可見光光度計(jì)、煮沸鍋、XHF1型高速組織勻漿器、震蕩器。1.2 主要試劑1.2.1 人工海水配置 根據(jù)國(guó)家海洋局第三研究所提供的配方配置，主要指標(biāo)：滲透濃度（125011.52）mmol/L,pH8.2,Na+濃度（6305.33）mmol/L,K+濃度（10.880.68）mmol/L，Cl1濃度為（658.85.25）mmol/L,溫度（212）。1.2.2 試劑 1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液，蛋白染色液，2mol/L的Na2CO3,40ml/L乙酰丙酮溶液，0.1mg/ml的鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑。8.0ml/L鹽酸溶液，8.

8、3mol/L的NaOH溶液，抽提液，消化劑，顯色劑，1mg/ml磷貯存液，0.04mg/ml磷應(yīng)用液。1.3 胃黏膜中氨基己糖和磷脂的測(cè)定1.3.1 胃黏膜標(biāo)本的制備 用玻片將新鮮腺胃部胃黏膜組織輕輕刮下，低溫冷凍后稱重，取1/2置于2ml生理鹽水中，研碎成勻漿，離心取上清液，分別用于測(cè)定蛋白和磷脂、氨基己糖。1.3.2 考馬斯亮藍(lán)G250染色法制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。按表1操作，室溫放置15min后于595nm處比色測(cè)定，每組重復(fù)3次測(cè)定標(biāo)本中蛋白含量。表1 考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定蛋白含量1.3.3 大鼠胃黏膜中氨基己糖含量測(cè)定 參照馮敬池等2報(bào)道的方法進(jìn)行。氨基己糖（g/mg蛋白）=勻漿上

9、清液氨基己糖（g/L）/蛋白質(zhì)濃度（mg/L）。精密稱取105干燥恒重的鹽酸氨基葡萄糖50mg溶解于500ml去離子水中配置成0.1mg/ml的鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：在試管中分別加入0.1mg/ml的鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.25,0.5,0.75,1.0,1.25ml，分別加水至2.5ml，加乙酰丙酮0.5ml，置沸水浴25min，冷水中迅速冷卻，各加無醛乙醇1.5ml及對(duì)二甲氮基苯醛0.5ml，震蕩，置60水浴保溫1h，空白用2.5ml去離子水代替標(biāo)準(zhǔn)樣品液，530nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。1.3.4 海水浸泡傷大鼠胃黏膜中磷脂含量測(cè)定 取0.1ml黏液勻漿液加入磨砂口刻度試管中，

10、加無水乙醇乙醚提取液2.4ml，取1ml上清液加入15mm150mm試管中，在沸水浴上將溶劑蒸發(fā)至干，加消化液0.2ml。另外取兩管作為空白管和標(biāo)準(zhǔn)管，空白管加去離子水，標(biāo)準(zhǔn)管加磷應(yīng)用液0.1ml，分別加入消化液0.2ml。震蕩器劇烈快速振搖3min，室溫下放置10min后離心2000r/min15min，將3管都放在鐵絲架上，直接在1000W電爐上加熱58min，見測(cè)定管內(nèi)顏色先變棕黑色后變澄清時(shí)即可從電爐上取下，冷卻后各管內(nèi)加入顯色劑2ml，6070水浴10min（37需要2h顯色完全），冷卻后在700nm閉塞測(cè)定OD值。磷脂含量（mmol/L）=（測(cè)定管光吸收度/標(biāo)準(zhǔn)管光吸收度）磷標(biāo)準(zhǔn)濃

11、度（0.04mg/ml）1000磷標(biāo)準(zhǔn)液體積（l）/磷分子量（30.97）提取液（l）勻漿液（ml）。1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xs表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖1。圖1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2 鹽酸葡萄糖胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖2。 圖2 鹽酸葡萄糖胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3 海水浸泡傷大鼠胃黏膜中氨基己糖和磷脂的變化 見表2。與對(duì)照相比，海水浸泡傷1h、2h及3h組大鼠胃黏膜氨基己糖的含量顯著降低（P0.01），以海水浸泡傷3h組降低最明顯（P0.01）。與對(duì)照組相比，海水浸泡傷1h、2h及3h組大鼠胃黏膜磷脂的含量顯著降低（P0.01），以海水浸泡傷

12、3h組降低最明顯（P0.01）。表2 海水浸泡傷大鼠胃黏膜中氨基己糖和磷脂的變化3 討 論AGML系指機(jī)體在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克等應(yīng)激狀態(tài)下，發(fā)生以胃黏膜損害為主的病理改變和上消化道出血為特征的臨床病癥，從病理學(xué)的角度，將各種應(yīng)激因素引起的急性胃黏膜損害和淺表性潰瘍統(tǒng)稱為AGML更為合適。在海上戰(zhàn)事中，腹部開放傷是一種較為常見的傷型，其發(fā)生率約為4%3。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔海水浸泡可直接導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷，引起機(jī)體發(fā)生多器官功能障礙綜合征4。胃黏膜細(xì)胞保護(hù)機(jī)制與強(qiáng)固胃黏液碳酸氫鹽屏障、增強(qiáng)胃黏液屏障、增加胃黏膜血流量、促進(jìn)胃黏膜更新、穩(wěn)定溶酶體及維持黏膜巰基化合物含量、增加胃黏膜表面活性磷脂的分泌、

13、減慢胃動(dòng)力、清除氧自由基、抑制白三烯形成、維持迷走神經(jīng)功能完整性等有關(guān)。胃壁屏障在解剖上分為胃黏液屏障與胃黏膜屏障兩部分。胃黏膜表面約0.250.5mm厚的非水溶性凝膠樣黏液層構(gòu)成胃黏液屏障，具有潤(rùn)滑作用，在消化運(yùn)動(dòng)過程中保護(hù)胃黏膜免受機(jī)械性損傷；更重要的是與HCO3-一同構(gòu)成黏液HCO3-屏障，以中和胃酸，使黏液層表面與深層保持巨大的pH反差。黏液成分95%為水，其它是多聚糖蛋白、電解質(zhì)、肽、脂質(zhì)等。糖蛋白的組成成分有N乙酰氨基己糖、半乳糖、N乙酰氨基半乳糖和巖藻糖，而N乙酰氨基己糖含量占23.6%，氨基己糖可間接反映黏液糖蛋白的含量，故氨基己糖水平被認(rèn)為是衡量胃黏膜重要防御因子糖蛋白含量的

14、重要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物的胃黏膜表面有疏水性，可阻止H+向黏膜內(nèi)逆向彌散。磷脂是構(gòu)成黏膜疏水性的主要特征，測(cè)定其含量變化可反映胃黏膜表面疏水性的變化。胃黏膜表面磷脂的主要成分為卵磷脂和磷脂乙醇胺，由黏液細(xì)胞分泌，當(dāng)被分泌到胃黏膜表面則與糖蛋白復(fù)合物一起構(gòu)成胃黏膜和黏液屏障，使上皮具有疏水性，有效地抑制H+向黏膜內(nèi)彌散?？笻+通透性效率以磷脂最強(qiáng)5。黏液的黏滯性和凝聚性與糖蛋白和磷脂有關(guān)。胃黏液屏障要維持其功能，必須確保正常的氨基己糖和磷脂含量。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定氨基己糖與磷脂來了解海水浸泡傷對(duì)胃黏膜黏膜黏液屏障的破壞。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，海水浸泡傷1h、2h及3h組大鼠胃黏膜中氨基己糖與磷脂的含量均

15、明顯降低（P0.01），胃黏膜損傷程度隨著應(yīng)激時(shí)間的明顯延長(zhǎng)而呈明顯加重趨勢(shì)，以海水浸泡傷3h組最為明顯。氨基己糖與磷脂的降低均伴有胃黏膜病變程度的加重，且兩者有明顯的負(fù)相關(guān)，提示胃黏膜疏水性的降低可能參與了AGML的發(fā)生。它可能是通過機(jī)體體液或者神經(jīng)途徑作用于上皮細(xì)胞影響磷脂的合成或分泌，也可能為促使其降解所致。綜上所述，海水浸泡傷作為一種嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)，可使胃黏液凝膠內(nèi)磷脂含量的降低，使胃黏膜的疏水性進(jìn)行性降低，H+通透性升高，導(dǎo)致AGML的發(fā)生，氨基己糖與磷脂的測(cè)定值表明，黏液屏障的損傷與黏膜病變的加重及改善相互影響、互為因果，因此可以通過提高胃黏液氨基己糖與磷脂含量加強(qiáng)黏液屏障，從而修復(fù)胃黏膜損傷。參 考 文 獻(xiàn)1朱雄偉，王強(qiáng)，湛先保，等.開放性腹腔海水浸泡傷后大鼠急性胃黏膜病變模型的建立J.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（21）：4547.2馮敬池，馮麗英，宮心鵬.胃黏膜氨基己糖測(cè)定方法的研究及臨床應(yīng)用J.陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2001，16（4）：2224.3賴西南，王麗麗.海上及登陸作戰(zhàn)的戰(zhàn)傷救治J.人民軍醫(yī)，2000,43（9）：498499.4王育紅，鹿?fàn)栺Z，虞積耀，等.腹部開放性損傷犬經(jīng)海水浸泡后血液動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)的變化J.中華外科雜志，2000，38（9）：700702.5Slom