苯酚-硫酸法定量測定桔梗多糖的研究

1、苯酚-硫酸法定量測定桔梗多糖的研究         09-09-02 11:19:00     編輯：studa20                       作者：李妍 魏建和 許旭東 師鳳華 褚慶龍【摘要】  目的建立桔梗多糖含量定量測定方法，

2、為評價桔梗藥材及新選育品種的質(zhì)量提供方法。方法桔梗樣品用水提取，經(jīng)多級處理除去雜質(zhì)制得桔梗精制多糖，精制多糖溶解與苯酚-硫酸試劑顯色；用精制多糖測得桔梗多糖與葡萄糖的換算因子，采用苯酚-硫酸比色法測定桔梗樣品中多糖的含量。結(jié)果建立了一種苯酚-硫酸法測定桔梗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，其平均回收率為97.54% ，RSD=1.44%。對不同來源桔梗中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定，其范圍為8.54%20.28%。結(jié)論此方法簡便可行，桔梗多糖供試液在4 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重復(fù)性較好，可作為桔梗多糖的測定方法。 【關(guān)鍵詞】  桔梗多糖； 苯酚-硫酸法； 定量測定Abstract：ObjectiveAn phe

3、nol-H2SO4 colorimetry method was developed for the determination of polysaccharides in Radix platycodonis samples from different origins, in order to provide a scientific basis for a quality evaluation of breeding good Radix platycodonis.MethodsExtracted with water, removed the interference componen

4、ts during the pretreatment process, and a corrected factor was used in order to minimize the error between glucose and polysaccharides of determination, the contents of the polysaccharides in Radix platycodonis samples were determined by phenol-H2SO4 colorimetry method.ResultsAn phenol-H2SO4 colorim

5、etry method for determination of polysaccharides in Radix platycodonis samples from different origins has been established. The average recovery rate for the polysaccharides was 97.54% with 1.44% of RSD (n=6). The content range of polysaccharides in Radix platycodonis from different origins was from

6、 8.54% to 20.28%.ConclusionThis determination method is simple, practical, good reproducibile and the color of the treated samples can be stabilized within 4h.Key words：Radix platycodonis;   Polysaccharide;   Phenol-sulfuric acid colorimetry method    桔梗為桔梗科Campanu

7、laceae植物桔梗Platycodon grandiflorum A DC.的根1，是一種藥食同源的食品，用途廣泛。桔梗多糖是一種菊糖型多聚糖2，是桔梗食用品質(zhì)的主要評價指標(biāo)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桔梗多糖還具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、祛痰、保肝、消炎、改善胰島素、增強機體免疫功能及抗腫瘤等，具有廣闊的開發(fā)前景3，4。    本實驗室于2001年啟動了對桔梗的優(yōu)良品種選育的系統(tǒng)研究，并于2004年首次發(fā)現(xiàn)了桔梗雄性不育種質(zhì)，現(xiàn)已選育出不育率100%的桔梗細胞質(zhì)雄性不育系、保持系、自交4代純系，以及紫花、粉花、白花等一批純合品系，其品質(zhì)需要依據(jù)藥用或食用育種目標(biāo)進行

8、評價5。以往對桔梗的研究主要側(cè)重于桔梗中的皂苷類化學(xué)成分68，而忽視了桔梗中的多糖類成分及質(zhì)量控制的研究。本文首次建立了應(yīng)用紫外-分光光度法測定桔梗中多糖含量的檢測方法?，F(xiàn)報道如下。1   儀器、試劑與材料1.1   儀器UV-1102紫外分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TB-214電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6，國華電器有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-205，BüCHI有限公司產(chǎn)品；臺式高速離心機141，Thermo ELECTRON CORPORATION產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240，上

9、海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電冰箱BCD-233，伊萊克斯公司產(chǎn)品。1.2   試劑苯酚，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；濃硫酸、無水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，以上試劑均為分析純；蛋白酶，丹麥諾維信(中國)有限公司產(chǎn)品。1.3  材料桔梗樣品共10個：GP1BC1-12和GP1BC2-6為3代不育株系；GSNH3-M3為2代粉花自交株系，種質(zhì)來源于河北；GS902-7-2為3代自交保持株系，種質(zhì)來源于安徽；GS218-1，GS218-2和GS228-1為2代自交系，種質(zhì)來源于山東；GS111-2為2代自交株系，種質(zhì)來源于赤峰；GS173-5為2代自交株系，來源于延慶野生種質(zhì)

10、；CK2為山東生產(chǎn)用種質(zhì)9。以上各樣品于2007-11初地上部分枯萎后，將其根部挖出，每個樣品系內(nèi)隨機取3株，洗凈，趁鮮刮去外皮，烘箱中60 烘干，粉碎，粉末混合均勻后，裝于自封袋中，置于干燥器中保存，備用。樣品均采自藥用植物研究所試驗基地（北京市海淀區(qū)），由魏建和研究員鑒定。2   方法與結(jié)果2.1  桔梗多糖的提取與精制 稱取3種不同桔梗樣品的粉末（已干燥）各l0 g，置索氏提取器中，加入石油醚(沸程6090 )100 ml，90 回流提取至無色，濾渣揮干；加80%的乙醇200 ml于90 水浴回流l h，提取2次，抽濾，揮干乙醇；濾渣加150 ml蒸餾水l0

11、0 水浴回流提取l h，過濾，濾渣重復(fù)提取兩次。合并濾液冷卻至室溫后加入相當(dāng)于桔梗質(zhì)量02%的蛋白酶，55 酶解，約2 h，加熱至95 恒溫30 s滅酶，冷卻至室溫，離心，取上清液濃縮至100 ml，然后用流動的自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，將透析液離心，除去沉淀，加無水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達到70%，冰箱中靜置過夜，離心(4 800 r/min，10min)，回收上清液，沉淀用無水乙醇，丙酮，乙醚各洗滌兩次，于50 烘箱中烘干即得桔梗精制多糖。稱重，計算桔梗精制多糖得率，備用。結(jié)果見表1。表1  桔梗精制多糖得率結(jié)果（略）GP代表桔梗不育系測交材料，GS代表桔梗自交系材料

12、2.2  最大吸收波長的確定 精確稱取50 干燥至恒重的桔梗精制多糖20 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，按照“243”中所述方法與苯酚-硫酸試劑顯色，以等量的蒸餾水作空白，紫外-可見光全波長掃描，測定桔梗精制多糖的最大吸收波長。按此方法，測定3種不同桔梗精制多糖的最大吸收波長平均值為486 nm。2.3  桔梗多糖最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)的確定 以GP1BC1-12為樣品，精確稱取5份桔梗粉末各3 g，按照“261”所述方法，制得桔梗多糖提取液，真空濃縮至30 ml，加入無水乙醇至乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為40%，50%，60%，70%，80%，置于冰箱中靜置

13、過夜，離心(4 800 r/min，10 min)，回收上清液，收集沉淀，將沉淀置于50 烘箱中烘干至恒重，稱量。測定桔梗多糖最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)為70%。2.4   標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.4.1  標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取105 干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1051 g，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水并稀釋至刻度，配成1.051 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別精確移取2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100 ml容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，配成系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.4.2  5%苯酚試液的配制稱取苯酚100

14、g，加鋁片0.1 g，加碳酸氫鈉0.05 g，油浴中常壓蒸餾，收集182的餾分，取餾出液5 g，加蒸餾水100 ml， 置于棕色瓶中備用。2.4.3   標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別準(zhǔn)確移取1 ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，以1 ml蒸餾水作空白。每管加入5%苯酚溶液1 ml，迅速滴加濃硫酸5 ml，立即搖勻，放置5 min，置沸水浴中加熱10 min，迅速冷卻至室溫，放置10 min后，于486 nm處測吸光度。以吸光度(A)對葡萄糖質(zhì)量濃度(C)作回歸處理，得回歸方程A=0.970 7C+0.008 9，r=0.999 3。2.5  換算因子的測定  精確稱取

15、50 干燥至恒重的桔梗（GP1BC2-6, GP1BC1-12,GSNH3-M3）精制多糖20 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得桔梗多糖貯備液，苯酚-硫酸比色法測定其吸光度，由回歸方程求出此精制桔梗多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，按下式計算換算因子：    換算因子f=W/(C×D)          式中：W為稱取多糖的質(zhì)量(mg)，C為精制桔梗多糖貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋因素(ml)。測定桔梗多糖與葡萄糖的換算因

16、子平均值為1.0307（n=6）。2.6  樣品中桔梗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定2.6.1  樣品溶液的制備精確稱取桔梗粉末2 g，加體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇80 ml，90 水浴回流1 h，重復(fù)1次，趁熱抽濾，濾渣用80%熱乙醇洗滌(4 ml×2)。揮干溶劑后，濾渣連同濾紙置于燒瓶中，加30 ml蒸餾水，100 水浴回流1 h，趁熱過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，離心分離(4 800 r/min，10 min)，上清液置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。精確移取1 ml置于100 ml容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。  

17、0;  09-09-02 11:19:00     編輯：studa202.6.2  樣品中桔梗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定精確吸取按照“2.6.1”方法制得的樣品溶液1 mL，置于具塞試管中，按照“2.4.3”所述方法測定吸光度(A)，由回歸方程計算供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度(C)，按下式計算樣品中桔梗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。    多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=C·D·fW×100%          式中：C為供試液中葡萄糖

18、濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋因素(mL)，f為換算因子，W為供試桔梗樣品的質(zhì)量(mg)。2.7  重復(fù)性實驗 精確稱取GP1BC1-12樣品6份桔梗粉末各2 g，按照“261”中方法同時制取6份樣品溶液，按照“243”下的方法測定吸光度(A)，計算桔梗多糖含量，檢驗此測定方法的重復(fù)性，桔梗多糖平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.51%。28   穩(wěn)定性實驗精確吸取按照“261”中方法制取的GP1BC1-12樣品提取液，按照“243”下的方法測定吸光度(A)，每隔1 h測定1次，連續(xù)4 h考察其穩(wěn)定性，吸光度(A)平均值為0.213，相對標(biāo)準(zhǔn)偏

19、差RSD=1.98%。29   加樣回收率測定精確稱取GP1BC1-12樣品6份桔梗粉末各1 g，加入精制桔梗多糖約100 mg，按“261”樣品溶液的制備和“243”的測定方法操作，得桔梗多糖平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.31%，計算回收率。結(jié)果見表2。表2  桔梗多糖加樣回收率測定結(jié)果（略）2.10  不同桔梗樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較 精確稱取所采集的10種不同桔梗選育品系，各3份，按“261”項樣品溶液的制備和“243”項的測定方法操作，測定吸光度(A)，從回歸方程中計算供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度(C)，據(jù)式和式計算出品系中桔梗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表3。表3&

20、#160; 不同桔梗選育品系多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果（略）GP代表桔梗不育系測交材料，GS代表桔梗自交系材料，CK為對照樣品；n=33   討論    目前糖類的定量測定方法主要有,苯酚-硫酸法，地衣酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法等多種方法。苯酚-硫酸法的基本原理是利用糖類在濃硫酸作用下，水解生成糠醛或其衍生物，可與苯酚試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈橙黃色，于480490 nm處有特征吸收，其顏色深淺與糖的濃度成正比。    本文采用精制桔梗多糖測得桔梗多糖對葡萄糖的換算因子以減小測定誤差，避免了用葡萄糖做為標(biāo)準(zhǔn)引起的

21、系統(tǒng)誤差，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線簡便，而且由于組成上與待測樣最接近，結(jié)果較真實。作者比較了蒽酮-硫酸與苯酚-硫酸所掃描的桔梗多糖圖譜，結(jié)果表明，以苯酚-硫酸為顯色劑，較以蒽酮-硫酸為顯色劑穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此最終確定選擇苯酚-硫酸為顯色劑。同時，作者確定桔梗多糖以苯酚-硫酸為顯色劑的測定波長486 nm與經(jīng)典的苯酚-硫酸法最大吸收波長480490 nm一致。    采用苯酚-硫酸法測定桔梗多糖的實驗表明，此方法操作簡單，供試液在4 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重復(fù)性好，平均回收率高，檢測下限與經(jīng)典的苯酚-硫酸法相差不大，且試劑消耗少，價格便宜，一般實驗室都能滿足測定要求10。    不同桔梗品系多糖含量差異實驗結(jié)果表明，桔梗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為8%20.28%。桔梗多糖含量測定結(jié)果表明，CK2多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%以上；GS218-2，GS902-7-2，GS218-1等多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在17%20%之間；GP1BC2-6，GP2BC4-5等多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在14%16%之間；GP1BC1-12，GSNH3-M3等多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%12%之間；GS111-2，GS228-1等多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8%10%之間。由此可見不同桔梗選育品系多糖含量變幅較大，品種選育成效顯著?！緟⒖嘉墨I】  1 國家藥典委員會.中國藥典，第部S