草莓斑駁病毒分子變異及PCR檢測技術(shù)研究

1、草莓斑駁病毒分子變異及PCR檢測技術(shù)研究楊洪一1，李麗麗2，代紅艷2，張志宏2（1東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽110161）摘要：【目的】明確草莓斑駁病毒（Strawberry mottle virus，SMoV）的分子變異特點(diǎn)；探索利用嵌套PCR和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測SMoV的方法?！痉椒ā坷肦T-PCR擴(kuò)增SMoV 3非編碼區(qū)（non-coding region，NCR）和大外殼蛋白（large coat protein，LCP）基因特異片段，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。利用生物信息學(xué)軟件分析不同地區(qū)分離物變異特點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。參考測序結(jié)果，在S

2、MoV基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，利用嵌套PCR和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測SMoV?！窘Y(jié)果】獲得了SMoV中國分離物的NCR區(qū)和部分LCP 基因核酸序列，不同分離物部分LCP基因核酸序列同源性為76.8%99.7%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示不同分離物呈現(xiàn)輕微的地理相關(guān)性。3個波蘭分離物，4個中國分離物中的3個，7個荷蘭分離物中的4個分別聚集成一簇；2個德國分離物與其它分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，形成一個獨(dú)立的分支。建立了利用半嵌套PCR和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測SMoV的技術(shù)體系，靈敏度高于常規(guī)PCR。【結(jié)論】SMoV不同分離物變異復(fù)雜，德國分離物可能是一個代表特殊株系的群體；基于定位基因組保守區(qū)引物，利用嵌套PCR和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)

3、可有效檢測SMoV。關(guān)鍵詞：草莓斑駁病毒；RT-PCR；嵌套PCR；變異；系統(tǒng)進(jìn)化分析Studies on Molecular Variations and PCR Detection of Strawberry Mottle VirusYANG Hong-yi1, LI Li-li2, DAI Hong-yan2, ZHANG Zhi-hong2(1College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040; 2 College of Horticulture, Shenyang Agricultural Un

4、iversity, Shenyang 110161)Abstract: 【Objective】The study was conducted to analyze the characterization of molecular variation of Strawberry mottle virus (SMoV) and develop SMoV detection methods by nested PCR and transcriptional enhancement techniques. 【Method】 The 3 non-coding region (NCR) and larg

5、e coat protein (LCP) gene of SMoV were amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The specific segments were cloned and sequenced. The characterization of molecular variation for some isolates of SMoV and phylogenetic analysis were studied by using some bioinformatics sof

6、twares. The primers were designed in conserved region of genome of SMoV by analyzing the nucleotide acid sequences. SMoV was detected by nested PCR and transcriptional enhancement techniques. 【Result】The nucleotide sequences of NCR and partial LCP gene of Chinese isolates were obtained. Sequence ana

7、lysis of the partial LCP gene of various SMoV isolates showed nucleotide acid identities ranged from 76.8 to 99.7%. There was a slight tendency for isolates to group according to their geographical origin. All of three Polish isolates, four isolates among seven Dutch isolates, three isolates among f

8、our Chinese isolates formed a small separate branch, respectively. Two Germanic isolates had the far relationship with other isolates, formed a separate clade. The detection protocol for SMoV by semi-nested PCR and transcriptional enhancement techniques were developed, respectively. Both semi-nested

9、 PCR and transcriptional enhancement techniques were rather more sensitive than standard RT-PCR. 【Conclusion】 It had the enormous genetic variation for SMoV isolates. The Germanic isolates could be a group for representing of a specific strain. Based on the primers located in the conserved region of

10、 genome of SMoV, SMoV could be steadily detected by semi-nested PCR and transcriptional enhancement techniques.Key words: Strawberry mottle virus; RT-PCR; Semi-nested PCR; Variation; Phylogenetic analysis0 引言【研究意義】草莓斑駁病毒（Strawberry mottle virus，SMoV）是嚴(yán)重危害草莓生產(chǎn)的一種病毒，單獨(dú)侵染可導(dǎo)致植株衰弱、果實(shí)變小、品質(zhì)變劣，減產(chǎn)30%左右1。SMoV

11、在世界各地廣泛分布，株系分化復(fù) 雜2,3，在分子水平上明確其變異特點(diǎn)并建立有效檢測技術(shù)對控制病毒危害具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】SMoV病毒粒子為球形，直徑2830 nm4。病毒基因組包含2條單鏈RNA分子RNA1和RNA2，其基因組大小分別為7 036和5 619 nt1,5。SMoV早期分類地位不明確，基于基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，目前與溫州蜜柑矮縮病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）、草莓潛隱型環(huán)斑病毒（Strawberry latent ringspot virus，SLRSV）組成新的病毒屬溫州蜜柑矮縮病毒屬（Sadwa virus）6。早期主要通過指示植物法來鑒定SMoV

12、7，由于SMoV株系分化復(fù)雜，不同株系在寄主植物上癥狀變化較大。在敏感的指示植物EMC（East Malling clone of F. vesca）上，弱株僅表現(xiàn)輕微褪綠斑駁，而強(qiáng)株則引起EMC長勢明顯下降，葉片變小、畸形、葉柄縮短變細(xì)等癥狀5,8。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是檢測植物病毒的重要方法，目前已有成功檢測SMoV的報道3,9,10。草莓組織中富含多糖、多酚、丹寧等物質(zhì)3，在分離核酸時不易去除，容易影響PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的功效，因而造成檢測結(jié)果的不穩(wěn)定11,12。為了提高病毒檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)（transcri

13、ptional enhancement）、嵌套PCR（nested PCR）等一些基于PCR的新技術(shù)被應(yīng)用到病毒檢測研究中，其靈敏度比常規(guī)PCR高10200倍1315?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于病毒基因組核酸序列的分子變異研究剛剛興起，Thompson等在核酸水平上對SMoV的變異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SMoV不同分離物變異復(fù)雜3，獲得可擴(kuò)增SMoV多個分離物基因組特定區(qū)域的引物較困難。分子變異的基礎(chǔ)在于獲得多個不同地理起源的分離物，目前GenBank中僅Thompson等3公布了幾個SMoV歐美分離物的部分基因組核酸序列，還未見SMoV亞洲分離物的報道。此外，也未見利用基于PCR新技術(shù)檢測SMoV的報道

14、。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過獲得SMoV中國分離物基因組特定區(qū)域核酸序列，分析SMoV分子變異特點(diǎn)，了解SMoV中國分離物的分子變異特征；同時結(jié)合分子變異特點(diǎn)，探索利用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)和嵌套PCR技術(shù)檢測SMoV。1 材料與方法1.1 植物材料病毒分離物CN1取自遼寧大連農(nóng)村草莓田，CN2、CN3和CN4取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)草莓資源圃，CN1、CN2、CN3、CN4分別保存于草莓栽培品種寶交早生（Hokowase）、天5（Tian 5）、高斯克（Governor Simcoe）、SA18上，所有分離物分別進(jìn)行溫室保存及離體保存。1.2 試劑及菌株 大腸桿菌DH5菌株保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹分子生物學(xué)

15、實(shí)驗(yàn)室保存。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV為Invitrogen公司產(chǎn)品，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、dNTPs購于上海生工，NTP購于 Promega公司，T7 RNA聚合酶購于MIT公司，La Taq DNA聚合酶、RNasin、pMD 18-T載體、DNA Marker購自TaKaRa公司，其它藥品為國產(chǎn)分析純。 引物 根據(jù)已發(fā)表的序列和參考文獻(xiàn)1,3設(shè)計(jì)引物。引物序列為D1：5-TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG-3，D2：5-ATTCGGTTCACGTCCTAGTCTCAC-3，D3：5-TCTT GGGCTTGGATCGTCACCTG-3，C1：5-GGACCTACGGA TCTTGG

16、AAGT-3，C2：5-ACCCGCACAACTTGTCGG AGG-3，TD1：5-aattctaatacgactcactatagggag TAAGCG ACCACGACTGTGACAAAG-3（小寫字母為T7 RNA聚合酶啟動子序列），TD3：5-aattctaatacgactcactatag ggagTCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG -3，引物由TaKaRa公司合成。1.4 RNA提取 取0.05 g草莓葉片，利用改進(jìn)CTAB法16提取總RNA，最后溶解于50 µl水中。1.5 RT-PCR在0.2 ml Eppendorf 管中加入隨機(jī)引物（9 mer）（0.2

17、5 µmol×L-1）、dNTPs（1 mmol×L-1）、1 µl總RNA及9 µl超純水，65變性5 min，立即置于冰上；再加入RNasin 0.3 µl、反轉(zhuǎn)錄Buffer 4 µl、2 µl DTT、0.3 µl M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U×µl-1），終體積20 µl，混勻。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 2.5 h，70 15 min，最后4保溫。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后取1 µl進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中含2 µl 10×Buffer，1.5 mmol

18、×L-1 MgCl2，0.2 mmol×L-1 dNTPs，0.2 µmol×L-1引物，0.5 U Taq酶，用水補(bǔ)足至20 µl。引物D1D2反應(yīng)程序?yàn)椋?4 2 min；94 30 s，50 60 s，72 60 s，35個循環(huán)；最后72延伸5 min；引物C1C2退火溫度為55，其它與引物D1D2相同。1.6 嵌套PCR以D1D2為引物進(jìn)行第1次擴(kuò)增，20個循環(huán)，退火溫度為48，其它條件與D1D2單獨(dú)擴(kuò)增時相同。取0.3 µl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第2次擴(kuò)增，引物為D1D3（0.2 µmo×L-1），58退火，35個

19、循環(huán)，其它反應(yīng)條件與第1次相同。用含EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)按上述操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，以引物TD1/D3（或TD3/D1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 2 min；94 30 s，55 60 s，72 60 s，35個循環(huán)；最后72延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，向PCR產(chǎn)物中加入14 µl轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)反應(yīng)溶液（含2.5 mmol×L-1NTP 2 µl、T7 RNA 聚合酶Buffer 7 µl、0.3 µl RNasin和20 U T7 RNA聚合酶）。37反應(yīng)100 min，用含EB的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測

20、擴(kuò)增產(chǎn)物。1.8 靈敏度檢測取1 µl總RNA（約0.6 µg），分別加水稀釋10、50、200、800、3 200、12 800倍（濃度分別為60、12、3、0.75、0.19、0.05 ng×µl-1），再分別利用常規(guī)PCR（引物D1D3）、嵌套PCR和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測SMoV。1.9 克隆、測序及序列分析以PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA片段，與pMD 18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過PCR鑒定陽性克隆。測序工作委托上海生工進(jìn)行，雙向測序。利用軟件CLUSTAL X（1.83）進(jìn)行多序

21、列比對（multiple sequence alignment），利用DNAStar軟件計(jì)算分離物間核酸、氨基酸同源性并生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究中所應(yīng)用國外分離物名稱及GenBank登錄號如下：荷蘭分離物：1134（AJ311876）、1141（AJ496140）、1166（AJ496141）、1265（AJ496143）、1266（AJ496144）、1278（AJ496145）、1280（AJ496146）；波蘭分離物：1509/4（AJ496147）、1248（AJ496142）、167（496148）；捷克分離物：197/3A（AJ496149）、197/3B（AJ496150）；德國分

22、離物：HD（AJ496153）、ST（AJ496154）；智利分離物：3CH（AJ496151）；美國分離物：7（AJ496152）。2 結(jié)果與分析2.1 SMoV特異片段的RT-PCR擴(kuò)增、克隆、測序引物D1D2、C1C2分別擴(kuò)增的是SMoV的3非編碼區(qū)（non-coding region，NCR）和大外殼蛋白（large coat protein，LCP）區(qū)。引物C1、C2的3末端分別定位在保守Motif LGS和PPT。SDV、臍橙侵染性斑駁病毒（Navel orange infectious mottling virus，NIMV）、柑桔花葉病毒（Citrus mosaic virus

23、，CiMV）中也存在這2個保守Motif 3。由于D1D2定位于SMoV RNA1和RNA2 3端NCR中的高度保守區(qū)域，因而理論上可以同時擴(kuò)增RNA1和RNA2。以引物D1D2、C1C2分別在栽培品種寶交早生、天5、高斯克、SA18中擴(kuò)增出了預(yù)期的461 bp的片段引物C1C2擴(kuò)增結(jié)果見圖1，并經(jīng)測序證明其為SMoV的特異片段。1：寶交早生；2：天5；3：高斯克；M：100 bp DNA ladder 1: Hokowase; 2: Tian 5; 3: Governor Simcoe; M: 100 bp DNA ladder圖1 利用引物C1C2擴(kuò)增SMoV LCP基因特異片段Fig.

24、1 LCP gene of SMoV was amplified by primer C1C2 by RT-PCR通過測序，獲得了CN1的部分NCR序列，CN1、CN2、CN3、CN4的部分LCP序列，將CN1的部分NCR和LCP序列提交至GenBank，登錄號分別為AY919307、AY937262。2.2 序列分析對20個SMoV分離物（16個為GenBank中分離物）的部分LCP基因序列（327 nt）、部分NCR序列（413 nt）分別進(jìn)行多序列比對，SMoV的NCR區(qū)比對后存在空位，通過手工比對來對空位區(qū)域進(jìn)行調(diào)整。還分別對不同分離物L(fēng)CP基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果輸入D

25、NAStar軟件，計(jì)算不同分離物的核酸、氨基酸同源性。SMoV不同分離物的部分LCP區(qū)核酸序列差異較大，同源性最高為99.7%（分離物1134與1141），最低為76.8%（分離物ST與3CH）。其中德國分離物ST、HD與其它所有分離物的同源性都較低，為76.8%83.2%。SMoV不同分離物的部分LCP基因推導(dǎo)的氨基酸序列差異相對較小，一些分離物的氨基酸序列完全相同，而分離物ST、HD、7與其它分離物的序列差異較大（89.8%97.2%）。中國分離物的核酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與其它分離物的同源性分別在78.9%96.9%和89.8%100%，中國分離物同分離物ST、HD、1166、1266

26、、7氨基酸序列同源性較低（89.8%92.6%），而同其它分離物的氨基酸序列同源性都在95%以上。利用CLUSAL X軟件，基于SMoV不同分離物部分LCP核酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），不同分離物呈現(xiàn)輕微的地理相關(guān)性，利用氨基酸序列所作的進(jìn)化樹與之相近。在20個分離物中，7個荷蘭分離物中的4個（1134、1141、1265、1280）形成了一個小的獨(dú)立分支。中國分離物CN1與荷蘭分離物1278及另外的3個中國分離物（CN2、CN3、CN4）形成了一個小的分支，此分支與3個波蘭分離物（1509/4、1248、167）組成的分支親緣關(guān)系較近。德國分離物ST和HD與其它分離物的核酸（75.8%8

27、3.2%）、氨基酸（89.8%94.4%）的同源性都較低，二者形成了一個獨(dú)立分支。2個捷克分離物197/3A、197/3B的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能與寄主差異有關(guān)（197/3A、197/3B的寄主分別為F. ananassa和UC4）。 嵌套PCR引物設(shè)計(jì)及檢測由于SMoV的NCR區(qū)較保守，PCR擴(kuò)增時可同時擴(kuò)增2個RNA分子，因而在NCR區(qū)設(shè)計(jì)嵌套引物。多序列比對顯示，SMoV不同分離物部分NCR序列同源性較高，有4個超過20個核苷酸的大的保守區(qū)域，主要分布于前半部分，結(jié)尾部分有空位存在且序列變化較大，但受不同分離物的NCR區(qū)核酸序列變異和引物設(shè)計(jì)原理的限制，在NCR未能找到合適的嵌套引物，只設(shè)計(jì)

28、了半嵌套引物D3，即先利用引物D1D2進(jìn)行第1次擴(kuò)增，再用引物D1D3進(jìn)行第2次擴(kuò)增，半嵌套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為219 bp。利用半嵌套PCR，在草莓栽培品種寶交早生、天5、高斯克、SA18中都檢測出了SMoV，而且結(jié)果穩(wěn)定。半嵌套PCR提高了檢測SMoV的靈敏度，可檢測到的核酸稀釋倍數(shù)最高為3 200倍（總RNA濃度為0.75 ng·µl-1），靈敏度高于常規(guī)PCR（圖3）。CN1、CN2、CN3、CN4為中國分離物；197/3A、197/3B為捷克分離物；1509/4、1248、167為波蘭分離物；HD、ST為德國分離物；1134、1141、1166、1265、1266、1

29、278、1280為荷蘭分離物；7為美國分離物；3CH為智利分離物Chinese isolates: CN1, CN2, CN3 and CN4; Czech isolates: 197/3A and 197/3B; Polish isolates: 1509/4, 1248 and 167; Germanic isolates: HD and ST; Dutch isolates: 1134, 1141,1166, 1265, 1266, 1278 and 1280; American isolate: 7; 3CH came from Chile圖2 基于SMoV LCP核酸序列的進(jìn)化樹Fi

30、g. 2 Phylogenetic tree based on the nucleic acids sequences of LCP of SMoVa：常規(guī)PCR的檢測靈敏度。1：未受SMoV感染的寶交早生；24：寶交早生核酸稀釋倍數(shù)，分別為200、50、10倍；M：100 bp DNA ladder；b：半嵌套PCR的檢測靈敏度。1：未受SMoV感染的寶交早生；27：寶交早生的核酸稀釋倍數(shù)，分別為12 800、3 200、800、200、50、10倍；M：100 bp DNA laddera: Limits of detection of SMoV by RT-PCR. 1: Healthy

31、 Hokowase. 2-4: Dilution was done of Hokowase at 1/200, 1/50, 1/10. M: 100 bp DNA ladder. b: Limits of detection of SMoV by semi-nested PCR. 1: Healthy Hokowase. 2-7: Dilution was done of Hokowase at 1/12800, 1/3200, 1/800, 1/200, 1/50, 1/10. M: 100 bp DNA ladder圖3 常規(guī)PCR（a）和半嵌套PCR（b）的檢測靈敏度Fig. 3 Lim

32、its of detection of SMoV by RT-PCR and semi- nested PCR 利用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測SMoV 以寶交早生為試材，分別以引物TD3/D1、TD1/D3對SMoV的3NCR區(qū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)反應(yīng)，結(jié)果表明引物TD3/D1和TD1/D3都可以得到較好的擴(kuò)增結(jié)果（圖4），這說明T7啟動子序M：DL2000 marker；1：引物TD3/D1；2：引物TD1/D3 M: DL2000 marker; 1: Primer TD3/D1; 2: Primer TD1/D3圖4 利用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)檢測SMoV Fig. 4 Results of

33、transcriptional enhancement techniques for detecting SMoV 列無論是加在正義引物上還是加在反義引物上，都是有效的。同一植株在不同季節(jié)均能擴(kuò)增出該特異片段。以寶交早生為試材，利用引物TD1/D3進(jìn)行轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所能檢測到的總RNA稀釋倍數(shù)約3 200倍（總RNA濃度為0.75 ng·µl-1）（圖5），靈敏度高于常規(guī)PCR。M：100 bp DNA ladder marker；17：總RNA稀釋倍數(shù)，分別為10、50、200、800、3 200、12 800、51 200倍；8：健康寶交早生M: 1

34、00 bp DNA ladder Marker; 1-7: The total RNA from infected Hokowase plants were diluted at 10, 50, 200, 800, 3 200, 12 800, 51 200 times, respectively; 8: Healthy Hokowase plants圖5 利用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)檢測SMoV的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of transcriptional enhancement for detecting SMoV 3 討論本研究中的4個中國分離物皆取自遼寧，采樣地理距離較近，其LCP

35、核酸序列同源性較高（95.4%99.1%）。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，4個中國分離物分為2組，3個沈陽分離物（CN2、CN3、CN4）分為一組，大連分離物（CN1）分為一組，其分組差異可能與地理起源有關(guān)。中國是世界上野生草莓資源最豐富的國家之一，約占世界草莓屬20個常見種的1/2以上17，遼闊的地域、復(fù)雜的地形及多樣的生態(tài)條件為在長期的自然選擇中病毒與寄主協(xié)同進(jìn)化過程中發(fā)生分子變異和株系分化提供了有利條件。中國可能包含著較多SMoV復(fù)雜株系類型，對國內(nèi)其它地區(qū)大量樣本進(jìn)行篩選可能得到更多的株系類型。在所有的20個SMoV分離物中，2個德國分離物（ST、HD）與其它分離物的LCP核酸、氨基酸序列同源性最低

36、，其并未與其鄰國（捷克、波蘭、荷蘭）分離物聚集到一簇，而是形成了一個獨(dú)立分支，并且在氨基酸水平上也與其它分離物差異較大，可能是代表一個特殊株系類型的群體。2個美洲分離物（%）也較低，但其在系統(tǒng)進(jìn)化樹上并未形成獨(dú)立的分支，而是與歐洲分離物聚集在一起，原因可能在于其序列變異未低至德國分離物的變異水平，也可能與研究中所采用的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)算法有關(guān)。本研究的缺陷在于可利用的核酸序列信息較少，有待于國內(nèi)外研究人員補(bǔ)充更多的分離物類型，公布更長的部分基因組序列信息。盡管國外已報道了16個SMoV分離物，但其采樣地點(diǎn)相對較為集中，除來自美洲的2個分離物外，其余的14個歐洲分離物皆來自相互鄰近的4個歐洲國家。在利

37、用PCR檢測植物病毒的研究中，有較多檢測結(jié)果不穩(wěn)定的報道3,12,18，其原因可能主要有兩點(diǎn)：一為核酸中雜質(zhì)影響DNA聚合酶的活性，二為病毒粒子濃度在不同季節(jié)變化較大。嵌套PCR的靈敏度較高，其受病毒粒子季節(jié)變化的影響相對較小，可在一定程度上避免因病毒濃度過低所致的假陰性；此外，通過吸取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)，可使核酸中雜質(zhì)濃度降低，利于PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為嵌套PCR的缺點(diǎn)是容易受到污染19，本試驗(yàn)中未曾發(fā)現(xiàn)因外來核酸污染而明顯影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究的困難在于病毒核酸序列變異影響嵌套PCR引物設(shè)計(jì)，由于SMoV序列變異較嚴(yán)重，本研究在其基因組最保守的NCR區(qū)僅找到一個合適

38、的引物。隨著更多病毒分離物基因組序列的解析，通過尋找保守Motif，在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)簡并引物有可能解決此問題。與嵌套PCR相比，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)不需要設(shè)計(jì)第2對引物，第2輪擴(kuò)增中主要依靠T7啟動子序列，也就是說第2輪擴(kuò)增與所擴(kuò)增的序列沒有直接的關(guān)系，因而其受株系變異的影響相對較小。此外，T7 RNA聚合酶受核酸中雜質(zhì)影響相對較小，利于反應(yīng)的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)的缺點(diǎn)在于產(chǎn)物不穩(wěn)定、易降解、無法進(jìn)行測序等后續(xù)分析，其產(chǎn)物的檢測技術(shù)尚不成熟。試驗(yàn)中利用引物C1C2在栽培品種綠色種子上擴(kuò)增出了預(yù)期大小的片段（約460 bp），但經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其并不是SMoV特異序列，而是引物自身連接而成的序列，即擴(kuò)增產(chǎn)物

39、中兩個引物序列交替出現(xiàn)，中間一般間隔38個堿基，間隔堿基未見明顯規(guī)律性。此種引物自連所致的PCR檢測假陽性還未見報道，難以給出較合理的解釋，這對病毒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性是極為不利的。4 結(jié)論本研究分析了SMoV不同分離物的基因組特定區(qū)域的核酸序列，結(jié)果顯示SMoV不同分離物變異復(fù)雜，不同分離物L(fēng)CP基因核酸序列、氨基酸序列同源性分別為76.8%99.7%、89.8%100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示不同分離物呈現(xiàn)輕微的地理相關(guān)性，中國分離物與荷蘭分離物、波蘭分離物親緣關(guān)系較近；德國分離物可能是一個代表特殊株系的群體。建立了利用嵌套PCR和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)技術(shù)檢測SMoV的技術(shù)體系，可有效檢測SMoV。 Refer

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