關(guān)聯(lián)分析及其在玉米中的研究進(jìn)展

1、1 關(guān)聯(lián)分析現(xiàn)狀關(guān)聯(lián)分析主要研究群體中分子變異與表型變異之間的相關(guān)關(guān)系,是發(fā)現(xiàn)基因、定位基因以及對(duì)基因進(jìn)行功能性分析的基本工具。關(guān)聯(lián)分析最初普遍應(yīng)用于人類疾病,尤其是在Alzheimer病和膀胱纖維癥的研究中。目前,在鑒定1型和2型糖尿病、精神分裂癥、哮喘、心肌梗塞、回腸炎、高血壓、腫瘤等疾病的致病基因方面已有許多成功的報(bào)道 。在模式動(dòng)物果蠅中也有與抗菌免疫變異、壽命、體色、翅形等相關(guān)的報(bào)道。在植物研究中關(guān)聯(lián)分析則剛剛起步,其主要原因之一是人們對(duì)許多植物物種基因組中的LD 結(jié)構(gòu)缺乏了解。植物關(guān)聯(lián)分析最初以玉米為研究對(duì)象。自1983年Riven等分別應(yīng)用限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)玉米進(jìn)行遺傳分析以

2、來(lái),加之各種分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用促進(jìn)了玉米遺傳學(xué)的快速發(fā)展。近年來(lái),隨著高效便捷的分子標(biāo)記SNPs的出現(xiàn),以及基因組測(cè)序技術(shù)日臻成熟和完善,玉米遺傳學(xué)研究將進(jìn)入基因組研究時(shí)代。Thornsberry等突破植物群體結(jié)構(gòu)的障礙將其成功引入玉米開(kāi)花期變異,至今已有大量在植物中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的成功報(bào)道。人們也逐漸意識(shí)到基于LD的關(guān)聯(lián)分析可能是基因功能驗(yàn)證和基因挖掘的一種有效手段。玉米關(guān)聯(lián)分析中最典型的是玉米代謝途徑關(guān)鍵酶基因與代謝產(chǎn)物的相關(guān)分析,在研究淀粉代謝途徑的6個(gè)關(guān)鍵酶基因核苷酸多態(tài)性及LD程度的基礎(chǔ)上,Wilson等選擇各基因的幾個(gè)重要區(qū)段進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因中有4個(gè)與籽粒各成分和

3、淀粉糊化特性的一些指標(biāo)呈顯著相關(guān)。Szaima等通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)ael啟動(dòng)子區(qū)域的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)和whpl啟動(dòng)子區(qū)域的1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與玉米可凝性球蛋白的積累有關(guān)。2004年國(guó)際農(nóng)業(yè)研究磋商小組啟動(dòng)了“遺傳多樣性挑戰(zhàn)計(jì)劃”、美國(guó)科學(xué)基金會(huì)開(kāi)始資助“玉米基因組的結(jié)構(gòu)和功能多樣性研究專項(xiàng)”,這充分顯示了關(guān)聯(lián)分析在玉米研究中得到足夠的重視。目前,基因組學(xué)在玉米種質(zhì)資源優(yōu)異基因的發(fā)掘中應(yīng)用十分廣泛。其中,基于LD關(guān)聯(lián)分析和SNPs以其諸多優(yōu)勢(shì)已逐漸引起人們的關(guān)注,并且關(guān)聯(lián)分析為優(yōu)異基因和等位基因的發(fā)掘提供了新的思路和途徑。2 關(guān)聯(lián)分析概念及特點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析,又稱關(guān)聯(lián)研究、LD作圖或關(guān)聯(lián)作圖,是一種以LD為基

4、礎(chǔ),鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因的遺傳變異(等位基因變異)關(guān)系的分析方法,是研究群體中的分子變異與表型變異之間的相關(guān)關(guān)系,也是發(fā)現(xiàn)基因、定位基因及對(duì)基因進(jìn)行功能性分析的基本工具。關(guān)聯(lián)分析的優(yōu)點(diǎn)在于不需要構(gòu)建作圖群體,因而對(duì)于不能進(jìn)行控制試驗(yàn)的人類群體非常有效,而且獲得結(jié)果快,當(dāng)存在高度LD的情況下也有很高的分辨率。與傳統(tǒng)連鎖分析相比,關(guān)聯(lián)分析具有以下特點(diǎn): 研究周期短,關(guān)聯(lián)分析一般以自然群體為材料,無(wú)需構(gòu)建專門(mén)的作圖群體,只要某種標(biāo)記。廣度大,可以同時(shí)檢測(cè)同一座位的多個(gè)等位基因。材料廣度大,不只局限在2個(gè)親本的后代作圖群體中。精度高,可達(dá)到單基因的水平。3 關(guān)聯(lián)分析方法3. 1

5、基本方法及步驟 根據(jù)掃描的范圍不同,關(guān)聯(lián)分析法可分為候選基因關(guān)聯(lián)分析法和全基因組關(guān)聯(lián)分析法。全基因組關(guān)聯(lián)分析法通常采用一定數(shù)量分布于基因組染色體上的標(biāo)記對(duì)所選材料進(jìn)行基因型鑒定;而候選基因關(guān)聯(lián)分析法僅涉及對(duì)目標(biāo)候選基因所進(jìn)行的序列分析。了解所研究目標(biāo)群體的基因組LD模式有利于選擇適宜的關(guān)聯(lián)分析法,對(duì)于具有高度LD水平的群體而言,全基因組關(guān)聯(lián)分析法是最好的關(guān)聯(lián)分析法,因?yàn)檫@種方法可以減少所需標(biāo)記的數(shù)量;而較低LD水平的群體宜選用候選基因關(guān)聯(lián)分析法檢測(cè)高分辨率的作圖方法。具體步驟如圖1、2（略）所示。3. 2 候選基因關(guān)聯(lián)分析法 候選基因關(guān)聯(lián)分析法最初是用于動(dòng)物和人類遺傳學(xué)的研究。在植物中的首次運(yùn)

6、用是Thornsberry等2001年對(duì)玉米中Dwarf8基因的9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與玉米開(kāi)花時(shí)間相關(guān)聯(lián)的研究,該研究揭示了Dwarf8基因與玉米開(kāi)花時(shí)間之間的關(guān)系。這一研究將關(guān)聯(lián)分析法成功地引入植物,也使人們意識(shí)到基于LD的關(guān)聯(lián)分析可能是基因功能驗(yàn)證和基因挖掘的一種有效手段。Wilson等2004年對(duì)玉米子粒淀粉合成的6個(gè)候選基因ae1、bt2、sh1、sh2、su1、wx1與玉米子粒組分進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,研究表明,bt2、sh1和sh2均與子粒組分性狀存在顯著相關(guān), ae1和sh2與淀粉糊化特性顯著關(guān)聯(lián), ae1和sh1均與直鏈淀粉水平存在關(guān)聯(lián)。Szalma等2005年對(duì)玉米的可凝性球蛋白和綠原酸

7、含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn), al啟動(dòng)子區(qū)域的2個(gè)序列多態(tài)性與可凝性球蛋白的合成存在顯著關(guān)聯(lián),且發(fā)現(xiàn)在al多態(tài)性關(guān)聯(lián)顯著的情況下,可以檢測(cè)到whpl啟動(dòng)子中的一個(gè)顯著多態(tài)性位點(diǎn),該研究還發(fā)現(xiàn)考慮上位性效應(yīng)能增強(qiáng)關(guān)聯(lián)測(cè)驗(yàn)的能力。同年,Andersen等對(duì)Dwarf8基因的序列多樣性與71份歐洲玉米自交系構(gòu)成關(guān)聯(lián)分析群體; Camus2Kulandaive2lu等2006年選用375份代表歐洲和美國(guó)玉米自交系和275份地方品種構(gòu)成另一個(gè)關(guān)聯(lián)分析群體,他們分別進(jìn)行了Dwarf8基因多態(tài)性與開(kāi)花時(shí)間及株高在4個(gè)不同環(huán)境條件下關(guān)聯(lián)性的驗(yàn)證。我國(guó)于永濤2006年運(yùn)用這種關(guān)聯(lián)分析法,首次從我國(guó)玉米核心種質(zhì)中的自交

8、系及一些骨干自交系中選出了能夠最大限度代表其遺傳多樣性的94份核心研究材料,進(jìn)行耐旱相關(guān)候選基因rab17的序列多樣性與耐旱表型之間的關(guān)聯(lián)分析,研究中共檢測(cè)到6個(gè)序列多態(tài)性與表型性狀間的顯著關(guān)聯(lián)。Andersen等2007年對(duì)32份歐洲飼用玉米自交系的飼用品質(zhì)與編碼催化植物中木質(zhì)素生物合成第一步的酶(PAL)的基因多態(tài)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,在考慮和不考慮群體結(jié)構(gòu)時(shí)均發(fā)現(xiàn)了基因中與這些自交系的飼用品質(zhì)存在顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)性。候選基因關(guān)聯(lián)分析法也正是通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析在基因水平上將那些對(duì)目標(biāo)性狀有正向貢獻(xiàn)的等位基因從種質(zhì)資源中挖掘出來(lái)。目前,作物多基因控制的抗病及抗逆等性狀基因的研究并沒(méi)有取得與單基因控

9、制性狀那樣快的進(jìn)展,但這方面的研究因?yàn)楹蜻x基因關(guān)聯(lián)分析法的提出而出現(xiàn)了新的曙光。3. 3 全基因組關(guān)聯(lián)分析法 Hansen等2001年首次運(yùn)用基于全基因組掃描方法在植物中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的研究,對(duì)seabeet生長(zhǎng)習(xí)性的研究發(fā)現(xiàn), 440個(gè)全基因組范圍內(nèi)的AFLP標(biāo)記中,有2個(gè)與控制抽薹前是否需要春化的B基因顯著關(guān)聯(lián)。Parisseaux等通過(guò)全基因組掃描途徑對(duì)玉米中與株高、黑穗病抗性和子粒含水量相關(guān)的數(shù)量性狀基因座( quan2titative trait loci,QTL)進(jìn)行圖譜定位查詢,用簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat, SSR)標(biāo)記對(duì)9個(gè)不同雜交群體的1 26

10、6個(gè)歐洲玉米自交系進(jìn)行7年多地點(diǎn)試驗(yàn),每個(gè)地點(diǎn)設(shè)2次重復(fù),分別發(fā)現(xiàn)了37個(gè)對(duì)株高, 24個(gè)對(duì)黑穗病抗性,44個(gè)對(duì)子粒含水量相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。同年,Laurie等在全基因組范圍內(nèi)鑒定與玉米油分含量相關(guān)的QTL ,研究的488個(gè)SNPs標(biāo)記中,有50個(gè)標(biāo)記與油分相關(guān)聯(lián)。嚴(yán)格地說(shuō),全基因組關(guān)聯(lián)分析需要成千上萬(wàn)個(gè)SNPs或SSR標(biāo)記以及盡可能多的無(wú)親緣關(guān)系的個(gè)體。但是由于進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析耗資巨大,目前仍無(wú)法完成。隨著各個(gè)主要物種全基因組測(cè)序的完成, SNPs標(biāo)記的大量開(kāi)發(fā),全基因組關(guān)聯(lián)分析將成為研究植物數(shù)量性狀的強(qiáng)有力工具。4 關(guān)聯(lián)分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理所有LD統(tǒng)計(jì)的是實(shí)際觀測(cè)到的位點(diǎn)間的單倍型頻率與

11、期望單倍型頻率之間的差異(D)。LD的度量依據(jù)研究位點(diǎn)的性質(zhì)和數(shù)目而異。在實(shí)際應(yīng)用中,經(jīng)常計(jì)算的是2個(gè)等位基因的2個(gè)座位(如SNPs和AFLP)間的LD水平。對(duì)于只有2個(gè)等位基因的位點(diǎn),可用多種統(tǒng)計(jì)方法來(lái)衡量?jī)晌稽c(diǎn)間的LD水平,通常用r2 和D來(lái)估計(jì)2位點(diǎn)間的LD水平。假設(shè)有2個(gè)連鎖的座位A (其等位基因分別為A、a) 和B (其等位基因分別為B、b) , 4個(gè)等位基因的頻率分別為A 、a、B 、b , 4種單倍型AB、aB、Ab、ab的頻率分別為aB AB 、Ab 和ab 則Dab = (AB - AB ) ; r2 的計(jì)算公式為:2 = (Dab ) 2 / (AaBb ) ; D的計(jì)算公

12、式為| D| =(Dab ) 2 / min (ABab ) forDab > 0; | D | =(Dab ) 2 / min (AbaB ) forDab < 0; r2 和D反映了LD的不同方面。r2 包括重組史和突變史, D僅包括樣本的重組史,敏感度較高,即使對(duì)在實(shí)際應(yīng)用中的稀有等位基因的D值可能會(huì)很大,意味著其具有較高的LD水平。另一方面, D雖然能更準(zhǔn)確地估測(cè)重組差異,但當(dāng)樣本較小時(shí),低頻率的4種等位基因組合的可能性將大大減小, 因此D不適宜小樣本研究的應(yīng)用。r2 可以提供標(biāo)記是否能與QTL相關(guān)的信息,因此LD作圖中通常采用r2 來(lái)表示群體的LD水平。r2 和D是2個(gè)座

13、位間LD的度量。對(duì)于具有大量標(biāo)記的基因組某區(qū)域內(nèi)LD的分布狀況,通常用LD衰退圖和LD矩陣2種形象化的方式來(lái)表示。LD衰退圖以座位間的LD對(duì)遺傳距離作圖來(lái)表示一個(gè)區(qū)域內(nèi)的LD分布情況,這種表示方法也便于對(duì)不同物種中的LD水平進(jìn)行比較。LD矩陣是某基因內(nèi)或某染色體上多態(tài)性座位間LD的線性排列。另外,也可以通過(guò)對(duì)該區(qū)域內(nèi)反映兩兩位點(diǎn)間LD水平的r2 或D的均值來(lái)表示該區(qū)域內(nèi)的LD水平。如果有多個(gè)等位基因的位點(diǎn),一種轉(zhuǎn)化形式的D是應(yīng)用最廣泛的衡量2個(gè)多等位基因位點(diǎn)間LD水平的值。在實(shí)際應(yīng)用中,經(jīng)常需要計(jì)算的是2個(gè)或多個(gè)等位基因的2位點(diǎn)間的LD水平,但當(dāng)構(gòu)建全基因組的LD圖譜時(shí)就需要考慮多個(gè)位點(diǎn)間的L

14、D水平。另外,多個(gè)位點(diǎn)間LD水平的計(jì)算還有bottom-up和top-down 2種方法。5 第3代分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)5. 1 單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記 玉米基因組中存在著廣泛的遺傳多樣性,其中最簡(jiǎn)單的多態(tài)形式是單堿基引起的DNA多態(tài)性SNPs,它和LD是應(yīng)用第3代分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)。這種繼RFLP和SSR后發(fā)展起來(lái)的第3代分子標(biāo)記是由基因組單個(gè)核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性,包括單堿基的轉(zhuǎn)化、顛換以及單堿基的插入和缺失等。關(guān)聯(lián)分析需要檢測(cè)候選基因的等位基因與表型的關(guān)聯(lián)性或全基因組掃描來(lái)確定與表型相關(guān)的區(qū)域。而基于這種LD的相關(guān)分析需要一套高密度的多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)的基因組掃

15、描, SNPs由于其分布廣且信息量大、具有代表性、能夠穩(wěn)定遺傳、可實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化減少研究時(shí)間而成為首選。玉米屬于異花授粉作物,其基因組之間的差異巨大,數(shù)據(jù)表明玉米基因組中每100 bp就存在1個(gè)SNPs。Laurie等在鑒定與玉米油分含量相關(guān)的QTL中發(fā)現(xiàn)488個(gè)SNPs標(biāo)記中有50個(gè)標(biāo)記與油分含量相關(guān)聯(lián)。5. 2 連鎖不平衡 LD又稱配子相不平衡、配子不平衡或等位基因關(guān)聯(lián),是指一個(gè)群體內(nèi)不同座位等位基因之間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián),包括2個(gè)標(biāo)記間或2個(gè)基因/QTL 間或1個(gè)基因/QTL與1個(gè)標(biāo)記座位間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)。由于有限的群體大小和復(fù)雜的群體歷史,這種非隨機(jī)關(guān)聯(lián)在基因組中普遍存在。根據(jù)群體遺傳學(xué)的Ha

16、rdy2Weinberg平衡定律可知,如果有2個(gè)位點(diǎn),每個(gè)位點(diǎn)上均有2個(gè)等位基因(A、B) ,它們?cè)谌后w中的頻率分別為f (A )和f (B ) ,那么經(jīng)過(guò)1個(gè)世代的隨機(jī)交配,單倍型AB的頻率應(yīng)為A頻率和B頻率的乘積,即f (AB ) = f (A) f (B ) 。如果上述條件不能滿足,那么等位基因A和B就處于LD 。一般來(lái)說(shuō),LD可以從突變、隨機(jī)漂變、瓶頸效應(yīng)和群體混合過(guò)程中產(chǎn)生,而LD隨衰減時(shí)間和遺傳位點(diǎn)間的遺傳距離的增長(zhǎng)而減弱。在一些特殊群體中,LD可以在很大距離上存在。這些群體是潛在的可以被用于進(jìn)行高效率的關(guān)聯(lián)分析和基因定位的理想群體。LD具有很多度量方法,這些方法可以用來(lái)度量2個(gè)二

17、態(tài)的遺傳位點(diǎn)間的相關(guān)關(guān)系,其中部分度量可以擴(kuò)展到多個(gè)位點(diǎn)及多種狀態(tài)的情況。Hedrick總結(jié)了多種LD的度量方法,并且指出其中大部分度量方法的結(jié)果具有高度一致性,最簡(jiǎn)單的LD度量公式是D = f11 - f1 + ×f+ 1 = f11 f22 -f12 f21 ,這個(gè)公式也被稱為L(zhǎng)D的定義式。簡(jiǎn)言之, LD就是不同位點(diǎn)的等位基因間存在連鎖關(guān)系而不是自由組合關(guān)系。由于位點(diǎn)間的這種連鎖關(guān)系,就可以利用LD技術(shù)通過(guò)標(biāo)記位點(diǎn)的變化來(lái)預(yù)期其他位點(diǎn)的變異。LD與連鎖是相關(guān)但完全不同的2個(gè)概念。LD是指群體內(nèi)等位基因之間的相關(guān),而連鎖是指位于同一條染色體上的基因聯(lián)合傳遞的現(xiàn)象。緊密連鎖可導(dǎo)致較高

18、的LD水平,但這種LD純粹是由突變產(chǎn)生的等位基因出現(xiàn)后緊密連鎖座位間所有重組事件的結(jié)果。從分子標(biāo)記角度看,LD與關(guān)聯(lián)分析有著密切聯(lián)系,關(guān)聯(lián)分析的成效如何在很大程度上取決于群體中LD的強(qiáng)弱和式樣。關(guān)聯(lián)分析方法只是LD應(yīng)用的一種,其檢測(cè)的是某群體內(nèi)處于LD狀態(tài)的一些標(biāo)記或候選基因的遺傳變異即等位基因變異與特定表型顯著關(guān)聯(lián)的頻率是否比期望的要更高。6 展望關(guān)聯(lián)分析在玉米中的應(yīng)用亦然處于快速發(fā)展過(guò)程中。近年來(lái),隨著生物技術(shù)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展,新的統(tǒng)計(jì)方法的建立和運(yùn)用、復(fù)雜數(shù)量性狀剖析上位互作效應(yīng)在關(guān)聯(lián)分析中的整合以及玉米中巢式關(guān)聯(lián)作圖群體的構(gòu)建,將進(jìn)一步豐富關(guān)聯(lián)分析的內(nèi)容,并加快其在玉米遺傳學(xué)中的應(yīng)用,同時(shí)也將促進(jìn)其在玉米遺傳育種和改良及種質(zhì)創(chuàng)新中發(fā)揮重要作用。玉米關(guān)聯(lián)分析今后將向以下幾方面發(fā)展: QTL作圖與關(guān)聯(lián)分析的整合。連鎖作圖更適用