基因工程-第二章基因工程工具酶

1、第二章第二章 基因工程工具酶基因工程工具酶工具酶工具酶 -DNA-DNA分子的切割和連接技術(shù)。分子的切割和連接技術(shù)。 SmithSmith發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)型限制性核酸內(nèi)切酶型限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease，RE) 對對DNADNA分子有特異地切分子有特異地切割作用。割作用。（手術(shù)刀剪）（手術(shù)刀剪） KhoranaKhorana又發(fā)現(xiàn)了又發(fā)現(xiàn)了T4DNAT4DNA連接酶（連接酶（LigaseLigase），能將），能將DNADNA片段連接在一起。片段連接在一起。（縫紉機(jī)、漿糊）（縫紉機(jī)、漿糊） DNADNA、RNARNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。聚合酶

2、和反轉(zhuǎn)錄酶等合成酶。（復(fù)印機(jī)）（復(fù)印機(jī)） 構(gòu)成了一個(gè)研究構(gòu)成了一個(gè)研究DNADNA、 RNARNA分子的分子的工具酶箱工具酶箱。第一節(jié)第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 是一類能夠識別雙鏈?zhǔn)且活惸軌蜃R別雙鏈DNA 分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。一、宿主的限制和修飾現(xiàn)象一、宿主的限制和修飾現(xiàn)象-發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) 19521953年在年在T偶數(shù)噬菌體和偶數(shù)噬菌體和 噬菌體對噬菌體對大腸桿菌的感染實(shí)驗(yàn)中研究者發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制大腸桿菌的感染實(shí)驗(yàn)中研究者發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制和修飾現(xiàn)

3、象。正是對限制和修飾現(xiàn)象的深入研究，和修飾現(xiàn)象。正是對限制和修飾現(xiàn)象的深入研究，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)。導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)。 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩種酶活性配合完成的，由兩種酶活性配合完成的，一種叫一種叫修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種叫，另一種叫核酸內(nèi)切限制酶核酸內(nèi)切限制酶。寄主控制的限制與修飾的作用，寄主控制的限制與修飾的作用， 一是一是保護(hù)自身的保護(hù)自身的DNA不受限制不受限制； 二是二是破壞外源破壞外源DNA使之迅速降解使之迅速降解。 根據(jù)限制根據(jù)限制- -修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)在已成為重組在已

4、成為重組DNADNA技術(shù)學(xué)的重要工具酶。純化后的限技術(shù)學(xué)的重要工具酶。純化后的限制性內(nèi)切酶允許分子生物學(xué)家以一種精確的可重復(fù)制性內(nèi)切酶允許分子生物學(xué)家以一種精確的可重復(fù)的方式切割基因克隆所需的的方式切割基因克隆所需的DNADNA分子。分子。 這些酶的發(fā)現(xiàn)是基因工程發(fā)展過程中的一項(xiàng)突這些酶的發(fā)現(xiàn)是基因工程發(fā)展過程中的一項(xiàng)突破性進(jìn)展。破性進(jìn)展。二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型 根據(jù)其識別和切割序列的特性、催化條件及修根據(jù)其識別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為飾活性等，一般將限制酶分為I， 三大類。三大類。 I 類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。類：

5、不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。 類：基因工程的工具酶。類：基因工程的工具酶。 類：切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)，一般離識別位點(diǎn)類：切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)，一般離識別位點(diǎn)24 bp 26 bp，對分子克隆操作亦無實(shí)用意義。，對分子克隆操作亦無實(shí)用意義。 已有超過已有超過12001200種。種。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名 H.D.Smith等于等于1973年提議的命名系統(tǒng)。年提議的命名系統(tǒng)。 u名稱的第個(gè)名稱的第個(gè)1字母取自它來源細(xì)菌字母取自它來源細(xì)菌屬名屬名的第的第1個(gè)字母，個(gè)字母，大寫大寫；u第第2，3二個(gè)字母取自它來源細(xì)菌的二個(gè)字母取自它來源細(xì)菌的種名種名的頭的頭2個(gè)字

6、母，個(gè)字母，小寫小寫；u如果它的來源菌還有株系，則有第如果它的來源菌還有株系，則有第4個(gè)字母；若酶的編碼基因個(gè)字母；若酶的編碼基因位于噬菌體或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外的遺位于噬菌體或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外的遺傳成分；傳成分；u最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號。最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號。u前前三個(gè)字母用斜體三個(gè)字母用斜體表示。表示。 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名屬名，用，用大寫大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名種名，用，用小寫小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表

7、株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶所有的限制酶，除了以上名稱外，前面還冠以系所有的限制酶，除了以上名稱外，前面還冠以系統(tǒng)名稱統(tǒng)名稱內(nèi)切酶系統(tǒng)名稱內(nèi)切酶系統(tǒng)名稱 R；甲基化酶系統(tǒng)名稱；甲基化酶系統(tǒng)名稱 M。例如例如 R. Hind ，表示內(nèi)切酶，表示內(nèi)切酶 M. Hind ，表示甲基化酶，表示甲基化酶但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的 R 省略不寫。省略不寫。 通常情況下，需要對克隆的通常情況下，需要對克隆

8、的DNADNA進(jìn)行切割。進(jìn)行切割。首先首先，如果以克隆單個(gè)基因?yàn)槟康模搯蝹€(gè)基因，如果以克隆單個(gè)基因?yàn)槟康模搯蝹€(gè)基因可能僅僅包含可能僅僅包含2-3kb DNA2-3kb DNA，則這個(gè)基因不得不從大的，則這個(gè)基因不得不從大的( (通常情況下超過通常情況下超過80kb)DNA80kb)DNA分子中切割出來。分子中切割出來。其次其次，大的，大的DNADNA分子不得不被切斷成小的足以被載分子不得不被切斷成小的足以被載體攜帶的片段。體攜帶的片段。絕大多數(shù)克隆載體能夠承載的絕大多數(shù)克隆載體能夠承載的DNADNA片段處于一個(gè)特片段處于一個(gè)特定的大小范圍中。定的大小范圍中。比如，以比如，以M13M13噬菌

9、體為基礎(chǔ)的載體，所克隆的噬菌體為基礎(chǔ)的載體，所克隆的DNADNA分子超過分子超過3kb3kb時(shí)運(yùn)載效率非常低。時(shí)運(yùn)載效率非常低。四、四、 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征 型限制性核酸內(nèi)切酶型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性的基本特性 識別雙鏈識別雙鏈DNA分子中分子中4-8對堿基的特定序列大部對堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列分酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 。 Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGAC

10、CAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口5 5 粘端切口粘端切口GAATTCCTTAAG EcoRGCTTAAAATTC GCTCGAGGAGCTCCTCGAG GAGCTC Pst3 3 粘端切口粘端切口DNADNA分子中識別序列的出現(xiàn)頻率分子中識別序列的出現(xiàn)頻率 對特定的限制性內(nèi)切酶來說，在已知長度的對特定的限制性內(nèi)切酶來說，在已知長度的DNADNA分子中分子中, ,識別序列的數(shù)量能夠通過數(shù)學(xué)方法計(jì)算出來。識別序列的數(shù)量能夠通過數(shù)學(xué)方法計(jì)算出來。 這一算法假定核苷酸以一種隨機(jī)方式排列而這一算法假定核苷酸以一種隨機(jī)方式排列而4 4

11、個(gè)個(gè)不同核苷酸以相同的比例出現(xiàn)不同核苷酸以相同的比例出現(xiàn)( (例如例如GCGC含量：含量：5050) )。 一個(gè)四核苷酸序列一個(gè)四核苷酸序列( (如如GATCGATC的酶的酶) )每每4 44 4=256=256個(gè)核個(gè)核苷酸出現(xiàn)一次。苷酸出現(xiàn)一次。 實(shí)際上，這些假設(shè)不可能完全有效。實(shí)際上，這些假設(shè)不可能完全有效。如，如，DNADNA分子，分子，49kb49kb， GCGC的含量要少于的含量要少于5050。對一個(gè)六核苷酸識別序列的限制性內(nèi)切酶來說應(yīng)該對一個(gè)六核苷酸識別序列的限制性內(nèi)切酶來說應(yīng)該具有具有1212個(gè)酶切位點(diǎn)。個(gè)酶切位點(diǎn)。實(shí)際上，這些識別位點(diǎn)發(fā)生的頻率要小一些，實(shí)際上，這些識別位點(diǎn)發(fā)生

12、的頻率要小一些，如：如：BglBgl有有6 6個(gè)，個(gè)， BamBamHIHI有有5 5個(gè)，個(gè)， SalSalI I則只有則只有2 2個(gè)。個(gè)。同功異源酶同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為稱為同尾酶同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端

13、稱為。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A五、限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件五、限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件1.1.為內(nèi)切酶提供一個(gè)合適的環(huán)境為內(nèi)切酶提供一個(gè)合適的環(huán)境(buffer)(buffer)。 所有限制性內(nèi)切酶所有限制性內(nèi)切酶都需要在都需要在鎂離子鎂離子存在下才發(fā)存在下才發(fā)揮作用。揮作用。 離子強(qiáng)度通常由離子強(qiáng)度通常由氯化鈉氯化鈉(NaCl)(NaCl)提供。提供。 絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適pHpH在在7.47.4

14、左右。左右。 不當(dāng)?shù)沫h(huán)境，不僅會降低限制性內(nèi)切酶的活性，不當(dāng)?shù)沫h(huán)境，不僅會降低限制性內(nèi)切酶的活性，還會導(dǎo)致酶的專一性的改變，使還會導(dǎo)致酶的專一性的改變，使DNADNA切割額外的、非切割額外的、非標(biāo)準(zhǔn)的識別序列。標(biāo)準(zhǔn)的識別序列。2. 2. 限制性內(nèi)切酶的用量限制性內(nèi)切酶的用量 供應(yīng)商提供純的已知濃度的溶液。供應(yīng)商提供純的已知濃度的溶液。1 1個(gè)酶單位：個(gè)酶單位： 被定義為在合適的溫度與緩沖液中，在被定義為在合適的溫度與緩沖液中，在2020L反反應(yīng)體系中，應(yīng)體系中，1h1h完全切割完全切割1 1g DNAg DNA所需要的酶量。所需要的酶量。 對于大量對于大量DNADNA的酶解，反應(yīng)體積可按比例擴(kuò)

15、大，的酶解，反應(yīng)體積可按比例擴(kuò)大，加入過量的酶（加入過量的酶（2 25 5倍）和較長的反應(yīng)時(shí)間。倍）和較長的反應(yīng)時(shí)間。3. 3. 反應(yīng)溫度：反應(yīng)溫度： 絕大多數(shù)，絕大多數(shù)，3737時(shí)活性達(dá)到最大；時(shí)活性達(dá)到最大； 一小部分需要不同的工作溫度，如一小部分需要不同的工作溫度，如SamSam酶酶消化時(shí)，消化時(shí)，2525才能達(dá)到酶的最大活性。才能達(dá)到酶的最大活性。BacBac酶酶消化時(shí)，消化時(shí)，5050才能達(dá)到酶的最大活性。才能達(dá)到酶的最大活性。 4. 4. 酶解過程：酶解過程： 酶解體系的確定；酶解體系的確定； 成分的混勻；成分的混勻； 酶切反應(yīng)；酶切反應(yīng)； 終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。 終止反應(yīng)的方法：終

16、止反應(yīng)的方法： 如果酶切下來的如果酶切下來的DNADNA片段用于克隆實(shí)驗(yàn)，則反片段用于克隆實(shí)驗(yàn)，則反應(yīng)中的酶應(yīng)該消除掉以保證它不會意外地消化掉那應(yīng)中的酶應(yīng)該消除掉以保證它不會意外地消化掉那些將在以后步驟中加入的其他些將在以后步驟中加入的其他DNADNA分子。分子?！跋麥缦麥纭?” 酶：酶： 7070保存很短的一段時(shí)間；保存很短的一段時(shí)間； 苯酚抽提苯酚抽提; ; 加入加入EDTA(EDTA(鰲和鰲和MgMg2+2+) )或加入或加入SDSSDS使酶變性。使酶變性。5.限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果鑒定6. 6. 內(nèi)切酶對內(nèi)切酶對DNADNA分子的不完全酶解：分子的不完全酶解： 完全酶切消化作用。完全酶

17、切消化作用。 不完全酶切消化作用不完全酶切消化作用（構(gòu)建構(gòu)建基因組物理圖譜基因組物理圖譜、基因組文庫基因組文庫及及片段連接片段連接）。）。 減少酶量，增加反應(yīng)體系，縮短反應(yīng)時(shí)間。減少酶量，增加反應(yīng)體系，縮短反應(yīng)時(shí)間。六、影響限制性內(nèi)切酶的活性的因素六、影響限制性內(nèi)切酶的活性的因素u酶的純度酶的純度uDNADNA樣本的純度樣本的純度uDNADNA甲基化的程度甲基化的程度u酶切反應(yīng)的溫度和時(shí)間酶切反應(yīng)的溫度和時(shí)間uDNADNA的分子構(gòu)型的分子構(gòu)型u內(nèi)切酶的緩沖液內(nèi)切酶的緩沖液 如果內(nèi)切酶處于非最適的反應(yīng)條件下其識別序列如果內(nèi)切酶處于非最適的反應(yīng)條件下其識別序列位點(diǎn)有時(shí)會發(fā)生改變，這時(shí)產(chǎn)生錯誤切割的

18、能力叫位點(diǎn)有時(shí)會發(fā)生改變，這時(shí)產(chǎn)生錯誤切割的能力叫內(nèi)切酶的星活性內(nèi)切酶的星活性。高甘油含量高甘油含量內(nèi)切酶用量過大內(nèi)切酶用量過大低離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度高高pHpH值值含有機(jī)溶劑含有機(jī)溶劑MnMn2+2+、CuCu2+ 2+ 、ZnZn2+2+等非等非MgMg2+2+的二價(jià)陽離子存在。的二價(jià)陽離子存在。第二節(jié)第二節(jié) DNA連接酶連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接酶的基本性質(zhì) 修復(fù)雙鏈修復(fù)雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵。上切口處的磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接酶OHP 5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick 3 C-

19、G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3OH Pds-DNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): 切口切口, 缺口缺口, 斷口斷口缺口缺口(gap) 切口切口(nick) 斷口斷口(cut)3HO P53HO P5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)連接酶的基本性質(zhì) 連接多個(gè)平頭雙鏈連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子分子

20、。DNA連接酶連接作用的分子機(jī)理連接酶連接作用的分子機(jī)理連接酶與輔助因子連接酶與輔助因子ATP（或（或NAD+）提供的激活）提供的激活A(yù)MP形形成一共價(jià)結(jié)合的酶成一共價(jià)結(jié)合的酶AMP復(fù)合物（腺苷酰酶）。同時(shí)釋放出復(fù)合物（腺苷酰酶）。同時(shí)釋放出 焦磷酸（焦磷酸（Ppi） 或煙酰胺單核苷酸（或煙酰胺單核苷酸（NMN） 。激活的激活的AMP從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的一條鏈的5末端末端磷酸基團(tuán)上形成磷酸基團(tuán)上形成DNA腺苷酸復(fù)合物。腺苷酸復(fù)合物。3OH末端對活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯末端對活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵將缺口封起來，同時(shí)釋放出鍵將缺口封起來，同

21、時(shí)釋放出AMP。 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3OH PT4DNA連接酶連接酶ATP酶酶-AMP + PPi大腸桿菌連接酶大腸桿菌連接酶NAD+酶酶-AMP + NMN酶酶 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3OH PAPDNA連接酶的反應(yīng)條件連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5MgCl2 10 mMATP 0.5 - 1 mM (不能大于不能大于1 mM )DTTVolume 10 - 20 m mlT T

22、 4 - 15 4 - 16 hr 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15 反應(yīng)反應(yīng) 1 小時(shí)，完全連接小時(shí)，完全連接 1 m mg l l-DNA（Hind III片段）所需片段）所需的酶量的酶量 1U酶已經(jīng)足夠酶已經(jīng)足夠DNA連接酶的種類連接酶的種類T4T4噬菌體噬菌體DNADNA連接酶連接酶 分子量分子量68Ku68Ku。是噬菌體基因。是噬菌體基因30 30 編碼的產(chǎn)物，需要編碼的產(chǎn)物，需要ATPATP作為輔助因子。應(yīng)用最廣。作為輔助因子。應(yīng)用最廣。大腸桿菌大腸桿菌DNADNA連接酶連接酶 分子量分子量75Ku75Ku。是大腸桿菌基因組中的。是

23、大腸桿菌基因組中的lig lig 基因編碼的基因編碼的產(chǎn)物，需要產(chǎn)物，需要ATPATP作為輔助因子。不能連接平末端的兩端片作為輔助因子。不能連接平末端的兩端片段。假陽性背景低。段。假陽性背景低。影響連接反應(yīng)的因素影響連接反應(yīng)的因素溫度溫度 酶最佳反應(yīng)溫度酶最佳反應(yīng)溫度3737，在此溫度下粘性末端之間氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定在此溫度下粘性末端之間氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。連接反應(yīng)最佳溫度需介于兩者之間。的。連接反應(yīng)最佳溫度需介于兩者之間。DNADNA末端的濃度末端的濃度 兩個(gè)兩個(gè)DNADNA末端間的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，其末端間的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，其反應(yīng)速率完全由相互匹

24、配的反應(yīng)速率完全由相互匹配的DNADNA末端濃度決定。末端濃度決定。 線性分子；環(huán)狀分子線性分子；環(huán)狀分子 重組子的構(gòu)型與重組子的構(gòu)型與DNADNA濃度及濃度及DNADNA分子長度存在密切關(guān)系。小分子分子長度存在密切關(guān)系。小分子DNADNA片段易于分子內(nèi)連接；較長片段易于分子內(nèi)連接；較長DNADNA片段濃度降低有利于分子環(huán)化，濃度增片段濃度降低有利于分子環(huán)化，濃度增加利于分子間連接。加利于分子間連接。平頭雙鏈平頭雙鏈DNA片段的連接操作片段的連接操作 從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連

25、接則屬末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多 提高平頭末端連接效率的方法包括：提高平頭末端連接效率的方法包括：u加大連接酶用量（加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）倍大于粘性末端的連接）u加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會 u加入加入10% PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用，促進(jìn)大分子之間的有效作用u加入單價(jià)陽離子（加入單價(jià)陽離子（NaCl），最終濃度），最終濃度150-200 mM第三節(jié)第三節(jié) DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶（DNA

26、 polymerase） 能在能在引物引物和和模板模板的存在下，把的存在下，把脫氧核糖單核苷酸脫氧核糖單核苷酸連續(xù)的連續(xù)的加到雙鏈加到雙鏈DNA分子引物鏈的分子引物鏈的3 -OH末端，催化核苷酸的聚合末端，催化核苷酸的聚合作用。作用。DNA聚合酶的分類聚合酶的分類 依據(jù)聚合酶使用的模板不同，將其分為兩類：依據(jù)聚合酶使用的模板不同，將其分為兩類：l 依賴于依賴于DNA的的DNA聚合酶聚合酶l 依賴于依賴于RNA的的DNA聚合酶聚合酶大腸桿菌大腸桿菌 DNA聚合酶聚合酶(pol ) 生物活性 聚活酶活性 外切酶活性 外切酶活性 置換活性 用途 - Mg2+ d NTPs polA G g2 pol

27、 pp g2 pol - p ppp d NTPs 抑制抑制- DNase - g2 , pol, dNTP - 外切酶活外切酶活性聚活酶活性性聚活酶活性用途用途 用切口平移方法標(biāo)記 用于c克隆中合成第二鏈 用于對分子的突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（ Klenow Klenow ）KlenowKlenow酶的基本性質(zhì)：酶的基本性質(zhì)： 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得獲得N N端三分之二的大肽段，即為端三分之二的大肽段，即為KlenowKlenow酶。酶。 KlenowKleno

28、w酶仍擁有酶仍擁有5353的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3535的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了5353的的核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。Klenow片段 補(bǔ)平限制酶切割產(chǎn)生的凹端 用d補(bǔ)平凹端，對片段進(jìn)行末端標(biāo)記 對帶突出端的進(jìn)行末端標(biāo)記 在c克隆中，用于合成c第二鏈 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈 應(yīng)用anger雙脫氧末端終止法進(jìn)行測序 消化限制酶產(chǎn)生的突出端 應(yīng)用于技術(shù)噬菌體聚合酶 生物活性 聚合酶活性 35外切核酸酶活性 交換（置換）反應(yīng) 用途 5CCGOH33 GGCTACGA5 Mg T4DNA聚合酶聚合酶 dNTPs 5CCGATGCT3 3

29、GGCTACGA5 5CGCATCT33GCG5 Mg T4DNA聚合酶聚合酶 5CGCOH33GCG5 +5pA+5pC+5pT 5CGTCGCOH33GCAGCG5 Mg T4DNA聚合酶聚合酶 -32PdTTP5CGOH33GCAGCG5 5CGT * OH3 3GCAGCG5 補(bǔ)平或標(biāo)記限制酶消化后產(chǎn)生的凹端 對帶有突出端的分子進(jìn)行末端標(biāo)記 標(biāo)記用作探針的片段 將雙鏈的末端轉(zhuǎn)化成平端 使結(jié)合于單鏈模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸Taq DNA 聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶是一種耐熱的依賴于聚合酶是一種耐熱的依賴于DNADNA的的DANDAN聚合聚合酶，最初從極度嗜熱

30、的水生菌中純化而來。酶，最初從極度嗜熱的水生菌中純化而來。 它具有它具有2 2種活性，需種活性，需MgMg2+2+作輔助因子。作輔助因子。 DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性； 外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。 主要應(yīng)用于主要應(yīng)用于PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄酶 禽源逆轉(zhuǎn)錄酶和鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶 生物活性聚合酶活性酶活性 用途 聚合酶活性聚合酶活性 5T T T T TOH3 3AAAAAUCUGUCCUA5 Mg dNTPs 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 5 T T T T TAGACAGGAT 3 3AAAAAUCUGUCCUA 5 酶活性酶活性 RNA-5UCCGUA3DNA-3AGGCAT5 逆轉(zhuǎn)錄酶

31、逆轉(zhuǎn)錄酶 5UC33AGGCAT5+5CGUA3 用途 逆轉(zhuǎn)錄酶主要用于將轉(zhuǎn)錄成雙鏈 在此反應(yīng)中可用種類型的引物：寡脫氧胸苷酸12-18聚體,oligo dt特定序列的寡核苷酸 標(biāo)記帶突出端的片段 可用于雙脫氧鏈終止法測序 DNA和RNA的修飾酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl tranterminal deoxynucleotidyl transferasesferase），簡稱末端轉(zhuǎn)移酶（），簡稱末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferaseterminal transferase），能夠），能夠催化催化55脫氧核苷三磷酸

32、進(jìn)行脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5 35 3方向的聚合作用，逐個(gè)方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性地將脫氧核苷酸分子加到線性DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端。末端。 當(dāng)反應(yīng)混合物中只有一種當(dāng)反應(yīng)混合物中只有一種dNTPdNTP時(shí)，就可以形成僅由一種核時(shí)，就可以形成僅由一種核苷酸組成的苷酸組成的33尾巴。我們特稱這種尾巴為同聚物尾巴。尾巴。我們特稱這種尾巴為同聚物尾巴。5 pOH 3 3 HOp 5 TdT Mg2+ dATP3 HOp 5 5 pAAAAAAAAAAAA OH 3 3 HOp 5 T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶與與DNADNA分子分子5-5-末端的標(biāo)記末端的標(biāo)記 多核苷酸激酶多核苷酸激酶（polynucleotide kinasepolynucleo