靈芝多糖提取工藝優(yōu)化及其活性初步研究---華雨蕾

1、 本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))靈芝多糖提取工藝優(yōu)化及其活性初步研究二級(jí)學(xué)院藥科學(xué)院專 業(yè)藥學(xué)（日語特色班）班 級(jí)2008級(jí)學(xué)生姓名華雨蕾學(xué) 號(hào)0803508257指導(dǎo)教師張德志 2012年 4 月誠(chéng) 信 聲 明我聲明，所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是本人在老師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我查證，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文（設(shè)計(jì)）中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。我承諾，論文（設(shè)計(jì)）中的所有內(nèi)容均真實(shí)、可信。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者（簽名）： 年 月 日靈芝多糖提取工藝優(yōu)化及其活性初步研究摘要：目的：確定靈芝多糖的最佳提取條件

2、，評(píng)估靈芝多糖的體外抗氧化活性和抗糖化活性。方法：通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)確定靈芝多糖提取最優(yōu)組合。采用羥基自由基體系和二苯代苦味肼基自由基(DPPH)體系，對(duì)靈芝多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行研究。采用體外蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)系統(tǒng),研究靈芝多糖體外抗糖化活性。結(jié)果：靈芝多糖提取最優(yōu)條件為：溫度90，液料比：1：30，時(shí)間：2.5h。所得靈芝多糖的結(jié)構(gòu)單元是由葡萄糖和另一種單糖組成，其中，葡萄糖為主要成分。靈芝多糖對(duì)羥基自由基有清除作用，清除率隨多糖濃度的增加而加強(qiáng)。靈芝多糖對(duì)DPPH自由基有清除作用，清除率隨多糖濃度的增加而加強(qiáng)。靈芝多糖需要在一定的時(shí)間之后才顯示出來較低的抗糖化活性。

3、關(guān)鍵詞：靈芝多糖；提取工藝；抗氧化；抗糖化 Optimization of polysaccharide extraction from Ganoderma lucidum and its preliminary studyAbstract：Objective: to determine the polysaccharide of Ganoderma lucidum extraction, evaluation of polysaccharide of G. lucidum in vitro antioxidant activity and antiglycation activity. Me

4、thod: through the single factor experiment, orthogonal experiment, experiment to determine the optimal combination of polysaccharide of G. lucidum extraction. With hydroxyl free radical system and two phenyl hydrazine radical bitter ( DPPH) system, the polysaccharide of G. lucidum in vitro antioxida

5、nt activity of. Using an in vitro protein nonenzymatic glycosylation reaction system, study of polysaccharide of G. lucidum in vitro antiglycation activity. Results: polysaccharide of G. lucidum extraction optimum condition: temperature of 90 degrees C, liquid ratio: 1: 30, time: 2.5h. The crude pol

6、ysaccharide monosaccharide composition: glucose and another monosaccharide, wherein, glucose as the main component of polysaccharide of G. lucidum on hydroxyl radical scavenging effects have, clearance rate decreases with increasing polysaccharide concentration and strengthening. polysaccharide of G

7、. lucidum on DPPH radical scavenging, clearance rate decreases with increasing polysaccharide concentration and strengthening. polysaccharide of G. lucidum need after a certain period of time will show lower antiglycation activity.Keywords： polysaccharide of G. lucidum extraction process antioxidant

8、 anti-glycated目 錄1 前言11.1 多糖的研究概述11.2 多糖的活性31.2.1 抗腫瘤作用31.2.2 調(diào)節(jié)免疫作用31.2.3 抗病毒作用41.2.4 抗凝血作用41.2.5 抗氧化、衰老作用41.2.6 降血糖、血脂作用41.3 靈芝及靈芝多糖的研究現(xiàn)狀51.3.1 靈芝的研究現(xiàn)狀51.3.2 靈芝多糖的研究現(xiàn)狀62 靈芝多糖提取工藝優(yōu)化72.1 材料及試劑72.2 儀器設(shè)備72.3 實(shí)驗(yàn)方法72.3.1 靈芝多糖提取方法82.3.2 靈芝多糖含量和得率測(cè)定82.4 單因素實(shí)驗(yàn)92.4.1 實(shí)驗(yàn)方法92.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論102.5 正交實(shí)驗(yàn)122.5.1 實(shí)驗(yàn)方法

9、122.5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論122.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)142.6.1 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果143 靈芝多糖的體外抗氧化活性153.1 靈芝多糖對(duì)羥基自由基的作用153.1.1 原理153.1.2 實(shí)驗(yàn)方法153.2 靈芝多糖對(duì)DPPH自由基的作用163.2.1 原理163.2.2 實(shí)驗(yàn)方法163.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論173.3.1靈芝多糖對(duì)羥基自由基的作用173.3.2靈芝多糖對(duì)DPPH自由基的作用174 靈芝多糖的抗糖化活性194.1 原理194.2 實(shí)驗(yàn)方法194.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論195 氣相色譜分析靈芝多糖的單糖組成225.1 實(shí)驗(yàn)方法225.1.1 多糖水解225.1.2 樣品單糖的衍生化22

10、5.1.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化225.1.4 氣相色譜條件225.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論235.2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖分析235.2.2 樣品多糖中各組分的定性分析246 結(jié)論256.1 靈芝多糖提取工藝優(yōu)化256.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)256.1.2 正交實(shí)驗(yàn)256.1.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)256.2 靈芝多糖的活性256.2.1 靈芝多糖的體外抗氧化活性256.2.2 靈芝多糖的抗糖化活性256.3 氣相色譜分析靈芝多糖的單糖組成26參考文獻(xiàn)30致謝30 1 前言1.1 多糖的研究概述多糖(polysaccharides，PS)又稱多聚糖，是由單糖連結(jié)而成的大分子多聚物，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。多糖按其來

11、源可分為植物多糖，動(dòng)物多糖，菌多糖等。植物多糖包括淀粉(starch)、纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)、樹膠(gum)、果聚糖(fractions)、粘液質(zhì)(mucilage)、粘膠質(zhì)(pectic substance)及其它葡聚糖。動(dòng)物多糖包括糖原(glycogen)，硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)，硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate)，甲殼素(chitin)，透明質(zhì)膠(hyaluronic acid)，肝素(heparin)，酸性粘多糖(acid mucopylysaccharide)或糖胺聚糖(glycosaminogl

12、ycan)。肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素又屬糖胺聚糖類，由于在體內(nèi)多以蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)存在，故統(tǒng)稱為蛋白聚糖(proteoglycan)，因此生物體內(nèi)的多糖主要以糖綴合物如糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖的形式存在。菌多糖包括細(xì)菌類多糖，如細(xì)菌脂多糖、酵母菌多糖等，真菌類多糖，如靈芝多糖、銀耳多糖、香菇多糖等1。人們對(duì)糖類的科學(xué)研與蛋白質(zhì)的科學(xué)研究幾乎同時(shí)開始，德國(guó)著名科學(xué)家EFishchrer在100多年前就開始了糖類研究，但是長(zhǎng)期以來糖類的研究并沒有得到人們足夠的重視。人們主要側(cè)重于對(duì)中藥材的脂溶性化學(xué)成分研究，而輕視了中藥材水溶性化學(xué)成分的研究，例如多糖成分。多糖的生物活性作用沒有得到廣泛

13、的關(guān)注，在天然生物活性成分研究中常常作為雜質(zhì)被除去，因此糖類的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。自20世紀(jì)60年代以后，糖類許多方面的生物活性逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，并且糖類一般沒有毒性，是較理想的藥物。隨著多糖的重要生理功能不斷被挖掘，多糖研究也引起了人們?cè)絹碓酱蟮呐d趣。80年代以后，有關(guān)糖類的結(jié)構(gòu)和功能的研究越來越深入。特別是最近十年，人們對(duì)糖類的認(rèn)識(shí)日益深入，如今國(guó)際上各個(gè)國(guó)家都加大了對(duì)糖類的研究力度，內(nèi)容主要包括糖生物學(xué)、糖工程等，并且相繼多次召開了以“糖生物學(xué)和糖工程”為主要內(nèi)容的專題會(huì)議，1984年，第十二次國(guó)際碳水化合物討論會(huì)在荷蘭由蘇聯(lián)人主持召開，會(huì)議上專家提出用合成特定結(jié)構(gòu)的莢膜多糖

14、作疫苗，與會(huì)者表現(xiàn)出了極大的興趣。1988年，幾位英國(guó)學(xué)者在從事了多年的糖類研究之后，首先提出了“糖生物學(xué)"這一名詞。1989年，日本科學(xué)家們經(jīng)商討評(píng)議，提出了關(guān)于“糖工程基礎(chǔ)與應(yīng)用研究推進(jìn)戰(zhàn)略"方案，并預(yù)定在1991年實(shí)施“糖工程前沿計(jì)劃”其內(nèi)容包括“糖生物學(xué)"和糖工程，“糖生物學(xué)"又分“糖分子生物學(xué)"和“糖細(xì)胞生物學(xué)"。1993年5月，第一屆“國(guó)際糖工程會(huì)議"在美國(guó)召開，1994年2月，G.W.Hart在第二屆國(guó)際“糖生物學(xué)"討論會(huì)，作了一個(gè)關(guān)于“糖生物學(xué)是生物醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)交叉點(diǎn)的新前沿”的報(bào)告。1994年6

15、月又在挪威召開了一次以微生物胞外多糖遺傳、生物合成、結(jié)構(gòu)與功能及特征為內(nèi)容的有關(guān)多糖工程的會(huì)議。1995年3月，關(guān)于“糖生物學(xué)和糖工程"的培訓(xùn)班2，由亞洲分子生物學(xué)組織(AMBO)在日本舉辦。目前，日本、美國(guó)及歐盟十分重視糖類的研究3，且已經(jīng)在多糖的研究與開發(fā)領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位，但是他們依然提出了各自的重大科研計(jì)劃，以加快多糖的研究進(jìn)展。歐盟為了協(xié)調(diào)歐洲的糖研究與開發(fā)，提高在糖的研究成果方面與美國(guó)和日本競(jìng)爭(zhēng)的能力，在19941998年的研究計(jì)劃中啟動(dòng)了“歐洲糖研究與開發(fā)平臺(tái)”。日本學(xué)者認(rèn)為70年代是基因工程時(shí)代，80年代是蛋白質(zhì)工程時(shí)代，90年代的糖工程是繼二者之后的第三個(gè)前沿領(lǐng)域，并

16、將成為2l世紀(jì)的熱點(diǎn)。過去人們普遍認(rèn)為生物體內(nèi)的信息流終止于蛋白質(zhì)，而現(xiàn)在日本學(xué)者認(rèn)為生物體內(nèi)的信息流終止于具有生物活性的分子，其中糖類就是最重要的一類。由此可見從蛋白質(zhì)到糖類是基因信息傳遞的延續(xù)，因此人們極度重視基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的同時(shí)，也應(yīng)該適當(dāng)適時(shí)地進(jìn)行糖組學(xué)的研究4-8。糖化學(xué)的發(fā)展已有上百年的歷史9，多糖的提取、分離、純化、組分的鑒定及結(jié)構(gòu)分析技術(shù)逐漸成熟，但由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且極易變構(gòu)，致使以目前的化學(xué)手段很難對(duì)其進(jìn)行深入精確的分析。因此，多糖的研究與蛋白質(zhì)和核酸相比差距較大，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面10.11：(1)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系的研究至今仍然很落后，大多還僅是科學(xué)家的分

17、析和推測(cè)，而關(guān)于多糖的溶液構(gòu)象和晶體結(jié)構(gòu)的研究方面幾乎還是空白；(2)多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法還很簡(jiǎn)單粗略，不像核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定那樣能達(dá)到自動(dòng)化、微量化和標(biāo)準(zhǔn)化。多糖分子中每個(gè)多糖殘基都有多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，這使糖苷鍵的鏈接就有多種可能性，而構(gòu)型又有A和B兩種，因此多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)測(cè)定困難的多。雖然近年來質(zhì)譜和核磁共振以及毛細(xì)管電泳等技術(shù)已用于測(cè)定多糖的結(jié)構(gòu)，但是依然有較大的局限性；(3)多糖的合成(目前實(shí)際上只是寡糖的合成)也比多肽和多聚核酸的合成復(fù)雜和困難的多；(4)多糖在體內(nèi)的作用機(jī)制還沒有完全明了。該領(lǐng)域還有很大的研究空間，還有待人們通過大量的創(chuàng)新性、探索性工作去進(jìn)行深入研究。

18、多糖作為一種重要的植物化學(xué)成分，己成為現(xiàn)在學(xué)者們研究的重要領(lǐng)域，不斷受到人們的關(guān)注。到目前為止，一些多糖已應(yīng)用于臨床，例如云芝多糖、裂褶多糖、豬苓多糖、香菇多糖、茯苓多糖等，它們?cè)诳鼓[瘤、抗凝血、抗突變、降血脂、抗衰老、抗病毒等病癥的治療方面已顯示了良好的效果。有些學(xué)者認(rèn)為“21世紀(jì)將是多糖的時(shí)代”這預(yù)示著多糖研究的廣闊前景。1.2 多糖的活性許多中藥材的生物活性與多糖有著密切的聯(lián)系12。自20世紀(jì)60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了多種不同結(jié)構(gòu)和組成的糖類，不斷深化其新功能的研究，大量研究結(jié)果表明， 很多多糖都具有抗腫瘤、免疫、抗病毒等活性。1.2.1 抗腫瘤作用目前的研究認(rèn)為中藥多糖主要是通過增強(qiáng)

19、機(jī)體的免疫功能來達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，即抗癌作用經(jīng)過宿主中介作用，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性和特異性免疫作用，而非直接殺傷腫瘤細(xì)胞。對(duì)于多糖抗腫瘤作用的研究始于上世紀(jì)30年代，研究表明香菇、豬苓、云芝、甘草、黃精、銀杏外種皮、枸杞、地黃、黃芪、當(dāng)歸、牛膝、刺五加、人參等植物多糖具有較好的抗腫瘤作用，其中如香菇多糖、裂裥菌多糖、豬苓多糖和云芝糖肽等作為抗腫瘤藥物早已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段13.14。此外，如南沙參多糖、茶多糖、黑木耳多糖、羧甲基茯苓多糖、云芝多糖、螺旋藻水溶性多糖均具有一定的抗輻射作用，有望被開發(fā)為一類治療腫瘤的輔助藥物，以減輕放化療的毒副作用15。1.2.2 調(diào)節(jié)免疫作用人體的衰老、病毒感

20、染以及腫瘤的產(chǎn)生，往往和機(jī)體免疫能力下降有關(guān)。很多多糖具有提高機(jī)體免疫能力的作用，在這方面真菌類多糖顯示出來廣闊的應(yīng)用前景，如香菇多糖具有高度特異性免疫增強(qiáng)作用，能使負(fù)瘤小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的殺傷抗原能力活化，達(dá)到恢復(fù)小鼠本已降低的免疫功能。靈芝子實(shí)體多糖、銀耳多糖、豬苓菌核多糖等真菌類多糖均能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活力促進(jìn)抗體形成。除真菌多糖外，茶多糖、大蒜多糖也具有增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能，提高機(jī)體的免疫力16-20。1.2.3 抗病毒作用研究發(fā)現(xiàn)，從海藻中分離出來的多糖多為硫酸酯化多糖，這類多糖的抗病毒作用已引起醫(yī)藥界的高度重視，有研究表明海藻多糖具有抗人類免疫缺陷病

21、毒(H)等多種藥物作用；紅藻多糖對(duì)愛滋病(AIDS)病毒的抑制率高達(dá)89.5，近似于抗愛滋病藥物疊脫氧胸腺嘧啶，現(xiàn)已經(jīng)作為抗AIDS輔助藥物使用21-22。1.2.4 抗凝血作用海洋動(dòng)物多糖大部分為糖胺聚糖或氨基聚糖，帶有很多負(fù)電荷，可以抑制凝血酶活性。最早應(yīng)用于臨床的抗凝血多糖是由六糖或八糖重復(fù)單位組成的肝素，可抑制凝蛋自酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，有抗凝血作用。藻酸雙酯鈉(PSS)是我國(guó)首創(chuàng)的一種多糖硫酸酯類海洋藥物。它是從海洋褐藻中提取得到活性多糖組分，再對(duì)其加以化學(xué)修飾引入有效基團(tuán)而制備得到的新型類肝素藥物，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于治療缺血性心腦血管疾病23。此外如大蒜多糖、毛木耳多糖、

22、猴頭多糖、銀耳多糖、茶葉多糖也具有一定的抗凝血作用24-26。1.2.5 抗氧化、衰老作用機(jī)體的衰老和體內(nèi)的免疫功能、以及氧化自由基含量失衡有很大關(guān)系，而研究表明許多多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能增加老齡小鼠的白細(xì)胞介素-2分泌，達(dá)到成年小鼠水平，延緩衰老27；還有報(bào)道稱靈芝、銀耳多糖均可顯著增加正常小鼠和明顯恢復(fù)老齡小鼠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2的能力。另有研究表明多數(shù)植物多糖均具有抗氧化性的作用，如壇紫菜中得到的多糖具有顯著的抗氧化活性，蘆薈多糖和枸杞多糖等也都具有抗氧化性的功效28-29。因此多糖有望被開發(fā)成一類新的抗氧化劑類藥品或功能性食品。1.2.6 降血糖、血

23、脂作用目前對(duì)于多糖降血糖、血脂作用還處于動(dòng)物試驗(yàn)研究階段，研究表明，人參、南瓜、細(xì)莖石斛、茶葉、青錢柳、刺五加多糖等具有降血糖作用均對(duì)正常小鼠血糖有降低作用；注射用的黃芪多糖對(duì)血糖及肝糖原具有雙向調(diào)節(jié)作用，既可保護(hù)低血糖，又可抗試驗(yàn)性高血糖30。1.3 靈芝及靈芝多糖的研究現(xiàn)狀1.3.1 靈芝的研究現(xiàn)狀靈芝(Ganoderma lucidum)在我國(guó)自古就有“仙草”的美譽(yù)，已有悠久的藥用和食用歷史，神農(nóng)本草經(jīng)、本草綱目中都有靈芝的藥效記載。靈芝又稱靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。以紫靈芝藥效為最好，靈芝原產(chǎn)于亞洲東部，中國(guó)分布最廣的在江西，靈芝作為擁有數(shù)千年藥用

24、歷史的中國(guó)傳統(tǒng)珍惜藥材，具備很高的藥用價(jià)值，經(jīng)過科研機(jī)構(gòu)數(shù)十年的現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，靈芝對(duì)于增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護(hù)肝，促進(jìn)睡眠等方面均具有顯著療效。靈芝的臨床研究只有在中國(guó)有比較系統(tǒng)的臨床報(bào)告，雖然在國(guó)際上許多國(guó)家已經(jīng)認(rèn)識(shí)并承認(rèn)靈芝的藥理作用，但是目前只停留在實(shí)驗(yàn)階段，沒有在人體上開展系統(tǒng)的臨床研究，現(xiàn)階段需要針對(duì)臨床病例進(jìn)行一些收集和研究。在日本、中國(guó)和美國(guó)，靈芝多糖產(chǎn)品有不同來源與用途。在日本，產(chǎn)品叫做PSK，是蛋白多糖，是將靈芝菌絲體或子實(shí)體用堿液抽提，用硫酸鹽進(jìn)一步純化得到產(chǎn)品，多用于處方類藥物。在中國(guó)，產(chǎn)品叫做PSP，是肽多糖。是將靈芝菌絲體或子實(shí)

25、體用稀乙醇抽提，再用純乙醇進(jìn)一步純化得到產(chǎn)品，多用于OTC類藥物。在美國(guó)，產(chǎn)品叫做VPS，是蛋白多糖，是將靈芝子實(shí)體用熱水浸提，用膜過濾進(jìn)一步純化得到產(chǎn)品，多用于日常膳食供給。普遍來說，靈芝多糖大多應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是抗癌藥物，市場(chǎng)已十分成熟，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)廠家亦達(dá)百余家。另外，基于靈芝多糖可提高機(jī)體免疫力，在癌癥病人經(jīng)放療、化療機(jī)體免疫力受損情況下，與放療、化療配合可達(dá)到治愈疾病目的。在食品保健方面，如靈芝飲料、靈芝茶、靈芝沖飲片、靈芝藥膳、靈芝酒等，種類更為繁多，在利用和加工新技術(shù)上有著極為廣闊發(fā)展空間。由于靈芝能潤(rùn)澤肌膚，輕身不老，目前以靈芝為原料天然美容制品異軍突起，產(chǎn)品層出不窮，已開始

26、逐步在全國(guó)各地問世，可以預(yù)料以美容為目的的靈芝制品將是今后開發(fā)的重點(diǎn)31。靈芝在我國(guó)作為藥物有2000多年歷史，臨床和藥理研究表明，靈芝具有多種生理活性與藥理作用;而靈芝多糖則是其最主要有效成分，試驗(yàn)表明，靈芝多糖在抗氧化活性方面有作用，應(yīng)有廣闊的應(yīng)用前景。1.3.2 靈芝多糖的研究現(xiàn)狀靈芝多糖，目前已分離到的有200多種，其中大部分為葡聚糖，少數(shù)為葡聚糖，多糖鏈由三股單糖鏈構(gòu)成，是一種螺旋狀立體構(gòu)型物，其立體構(gòu)型和DNA、RNA相似，螺旋層之間主要以氫鍵固定，分子量從數(shù)百到數(shù)十萬，除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高濃度酒精，在熱水中溶解，大多存在于靈芝細(xì)胞內(nèi)壁。據(jù)報(bào)道，從雙孢蘑菇、靈芝、香

27、菇、側(cè)耳等6種真菌中提取出的活性成分，可以防止細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷。研究證明，蘑菇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率可達(dá)29。真菌提取物對(duì)自由基有一定的清除作用。真菌是自由基清除劑的良好載體。而多糖是真菌中的主要活性成分。靈芝多糖有擬SOD活性，對(duì)OH自由基有清除作用，并能顯著抑制O3對(duì)紅細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用，具有保護(hù)皮膚濕潤(rùn)，延緩皮膚衰老等作用。日本美娜德化妝品公司將靈芝多糖添加到化妝品中，制成高級(jí)美容霜、護(hù)膚劑。靈芝多糖與曲酸(kojciacid)混合使用，具有抑制黑色素生成作用，可作為增白化妝品的有效成分。日本還把靈芝多糖和日本辣根wasbai提取物相結(jié)合，制成一種生發(fā)物質(zhì)，能有效地加速頭發(fā)生

28、長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)也有靈芝沐浴劑和靈芝高級(jí)洗發(fā)香波的生產(chǎn)報(bào)道。我國(guó)在開發(fā)靈芝多糖產(chǎn)品方面,科技含量偏低,大多數(shù)產(chǎn)品屬粗提取物,還不符合中藥現(xiàn)代制劑的要求，提取工藝不完善,使靈芝的一部分重要成分白白浪費(fèi)。為充分開發(fā)、利用靈芝這一我國(guó)中藥寶庫的珍品,應(yīng)以企業(yè)為主導(dǎo),企業(yè)與科研院所、高校相結(jié)合,走產(chǎn)、研、學(xué)協(xié)作開發(fā)之路,進(jìn)一步提高我國(guó)靈芝的科研水平,從而使之在國(guó)際市場(chǎng)上占有更大份額。由于靈芝多糖可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域，市場(chǎng)需求量越來越大。另外，多糖的研究涉及生命現(xiàn)象中眾多深?yuàn)W的理論基礎(chǔ)問題，而靈芝多糖的體外抗氧化活性研究比較少，特別是抗糖化活性的研究，這方面的研究尚需大大深入，才能闡明靈芝的活

29、性成分及其作用機(jī)理。2 靈芝多糖提取工藝優(yōu)化2.1 材料及試劑靈芝菌粉（從江蘇省淮安市玉兔靈芝發(fā)展有限公司購得，從真菌薄樹芝中分離的菌種并經(jīng)現(xiàn)代生物工程技術(shù)深層發(fā)酵所得的干燥粉末）。葡萄糖廣州化學(xué)試劑廠維生素C北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司牛血清白蛋白北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司DPPHsigma公司疊氮化鈉sigma公司重蒸酚北京索萊寶科技有限公司2.2 儀器設(shè)備紫外分光光度計(jì)島津UV-2550日本島津熒光分光光度計(jì)島津RF-5301/PC日本島津冷凍干燥機(jī)LGC-18型北京松源華興科技有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52-99型上海亞榮生化儀器廠電子天平JA1203N型上海精密科學(xué)儀器有限公司培養(yǎng)

30、箱HPX-9162MBE型上海博迅實(shí)業(yè)有限公司氣相色譜儀GC-6820型安捷倫科技有限公司2.3 實(shí)驗(yàn)方法取上清液2.3.1 靈芝多糖提取方法抽濾離心提取熱水靈芝菌粉乙醇沉淀冷凍干燥離心醇沉減壓濃縮靈芝多糖圖2-1 靈芝多糖提取工藝路線具體操作:取定量靈芝菌粉，按設(shè)計(jì)的料液比加入去離子水，采用熱水提取法提取，提取液離心,抽濾，濾液濃縮為原液體積三分之一，加入95%乙醇，使溶液中乙醇濃度達(dá)到75%，靜置24h以上，濾過，沉淀冷凍干燥2天，即得靈芝多糖。2.3.2 靈芝多糖含量和得率測(cè)定2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用苯酚-濃硫酸法32。精密稱取105下干燥至恒重的葡萄糖10mg置于100mL量

31、瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于帶刻度試管中加水至1mL，分別加入新蒸的苯酚1.0mL溶液，搖勻，加入濃硫酸5.0mL，搖勻后室溫放置30min；另以蒸餾水1.0mL加苯酚和硫酸，同上做空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖溶液的糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3.2.2 含量與得率的測(cè)定精密稱取靈芝多糖樣品10mg置于100mL容量瓶中，搖勻。即得供試品溶液。精密吸取樣品液0.1mL，照(1)方法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品中多糖的含量。多糖的得率用下式

32、計(jì)算：多糖得率(%)=多糖重量材料重量×100%2.4 單因素實(shí)驗(yàn)2.4.1 實(shí)驗(yàn)方法影響靈芝多糖得率的主要因素為提取時(shí)間、提取溫度、提取液料比和提取次數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)一組單因素試驗(yàn)，通過固定其中三個(gè)因素的提取條件改變另一因素的提取條件，來測(cè)定這一因素對(duì)多糖得率的影響33。2.4.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響固定提取溫度、提取液料比和提取次數(shù)，改變提取時(shí)間，研究提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖得率的影響（提取溫度為80, 提取液料比為1：30，提取次數(shù)為3次, 設(shè)提取時(shí)間為1 , 1.5 , 2 , 2.5 , 3h)。2.4.1.2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響固定提取時(shí)間、提取液料比和提取次數(shù)，改

33、變提取溫度，研究提取溫度對(duì)靈芝多糖得率的影響（提取時(shí)間為2h, 提取液料比為1：30, 提取次數(shù)為1次, 設(shè)提取溫度為50, 60, 70, 80, 90)。2.4.1.3 提取料液比對(duì)多糖得率的影響固定提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)，改變提取料液比，研究不同提取料液比對(duì)靈芝多糖得率的影響（提取溫度為80, 提取時(shí)間為2h, 提取次數(shù)為1次, 設(shè)提取液料比為1: 10, 1: 15, 1: 20, 1: 25, 1: 30）。2.4.1.4 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響固定提取溫度、提取時(shí)間和提取料液比，改變提取次數(shù)，研究不同提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖得率的影響（提取溫度為80，提取時(shí)間為2h，提取液料比為

34、1：30，設(shè)提取次數(shù)為1, 2, 3次）。2.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2-2 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線2.4.2.2 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖得率的影響圖2-3 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖得率的影響由圖2-3可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，靈芝多糖的得率增高。這是因?yàn)殪`芝多糖的提取實(shí)際上是一個(gè)擴(kuò)散的過程，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，梯度差越來越小，擴(kuò)散的速度也就越來越慢，所以延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于多糖的充分浸出。時(shí)間為1h時(shí)多糖得率較低，因此不能作為正交試驗(yàn)的因素水平。1.5h和2h的得率較接近，但和2.5h相差較大，因此綜合考慮，故選取2h、2.5h、3h作為正交試驗(yàn)時(shí)間的因素水平。 2.4.2.3 提取溫度對(duì)

35、靈芝多糖得率的影響圖2-4 提取溫度對(duì)靈芝多糖得率的影響由圖2-4可知，在一定條件下，提取溫度越高，靈芝多糖的得率也越高。原因是隨著溫度的升高，多糖在溶劑中的溶解度及擴(kuò)散系數(shù)均會(huì)增大，也就是說多糖被提取出來的速度將變快，這是有利于多糖提取的。溫度為50、60時(shí)多糖得率較低，因此不能作為正交試驗(yàn)的因素水平。故選取70、80、90作為正交試驗(yàn)溫度的因素水平。2.4.2.4 提取液料比對(duì)靈芝多糖得率的影響圖2-5 提取液料比對(duì)靈芝多糖得率的影響由圖2-5可知，在一定條件下，提取液料比越大，靈芝多糖的得率也越高。這是因?yàn)榧铀仍酱?，達(dá)到提取平衡以后靈芝料和提取液中的多糖濃度越低，最后殘留在靈芝多糖提取

36、后的殘?jiān)械亩嗵窃缴?，得率就越高。故選取1: 20、1: 25、1: 30作為正交試驗(yàn)液料比的因素水平。2.4.2.5 提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖得率的影響圖2-6 提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖得率的影響由圖2-6可知,在一定條件下，提取次數(shù)越多，靈芝多糖的得率也越高；但是，兩次提取與三次提取的多糖得率沒有大幅度增加。此外，提取次數(shù)是影響生產(chǎn)周期的一個(gè)主要因素，故根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及考慮到實(shí)際生產(chǎn)，提取次數(shù)最佳為二次提取。2.5 正交實(shí)驗(yàn)2.5.1 實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)為1次，用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)表(見表2-1)對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、提取液料比對(duì)靈芝多糖得率的影響在最佳值附近分別取3個(gè)水平進(jìn)行正

37、交實(shí)驗(yàn)，確定熱水提取法提取靈芝多糖的最佳條件34-35。 表2-1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平 實(shí)驗(yàn)水平提取液料比A提取溫度B 提取時(shí)間C11:20702h21:25802.5h31:30903h2.5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論表2-2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)因素液料比A溫度B時(shí)間C空白多糖得率%111115.9996.70510.455.9108.1399.5186.9179.07914.512122231333421235223162312731328321393321均值17.7186.2358.1999.549-均值27.8567.9749.0427.713-均值310.16911.4938.

38、5028.480-極差值2.4515.2180.8431.836-由表2-2可知，各因素對(duì)多糖提取得率的影響大小由正交試驗(yàn)的極差值大小很清楚地看出，影響因素主次順序?yàn)椋禾崛囟忍崛×弦罕忍崛r(shí)間。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值1, 2, 3表明，靈芝多糖提取的最佳組合工藝條件為A3B3C2, 即靈芝多糖提取的最佳工藝條件為：提取液料比為1：30，提取溫度為90，提取時(shí)間為2.5 h。表2-3 方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性液料比A11.37522.23019.000無溫度B42.48628.37219.000無時(shí)間C1.09420.21419.000無誤差5.102-由表2-3可知，因素

39、A,B,C的F比都比F臨界值小，因此三個(gè)因素對(duì)得率的影響都不顯著。原因可能是實(shí)驗(yàn)誤差大且誤差自由度?。?），使檢驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于因素對(duì)得率的影響都不顯著，不必再進(jìn)行各因素水平間的多重比較。此時(shí)，可從上表中選擇極值大的水平A3， B3 ， C2組合成最優(yōu)條件。2.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)2.6.1 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果根據(jù)正交試驗(yàn)所得出的最佳組合條件為：提取時(shí)間2.5h、提取溫度90、提取液料比1:30。取20g靈芝菌粉進(jìn)行提取，平行操作三次，求其平均值。表2-4 最優(yōu)條件下提取靈芝多糖的得率序號(hào)得率（%）118.34218.40317.95由表2-4可知，在相同的條件下提取，多

40、糖得率不完全一樣；得出的均值為18.23%，與正交試驗(yàn)的得率14.51%有一些差距，原因在于每次葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程有差異導(dǎo)致最終得率有差異，但提取出來的靈芝多糖重量相當(dāng)，所以基本能驗(yàn)證此條件（提取時(shí)間2.5h、提取溫度90、提取液料比1:30）為最佳提取條件。3 靈芝多糖的體外抗氧化活性3.1靈芝多糖對(duì)羥基自由基的作用3.1.1 原理實(shí)驗(yàn)采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系：鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成Fe2+-鄰二氮菲配合物，該配合物在536nm波長(zhǎng)處有最大吸收；通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH；而當(dāng)·OH氧化Fe2+-鄰二氮菲成Fe3+-鄰二氮菲時(shí)，就使536nm波長(zhǎng)處

41、最大吸收消失或減弱。當(dāng)反應(yīng)體系中存在·OH清除劑時(shí)，此氧化過程受到抑制，536nm波處最大吸收降低不明顯，故可通過536nm波長(zhǎng)處吸光度比較抗氧化劑清除·OH的作用。3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法靈芝多糖樣品/維生素C溶液濃度配成0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、10、15、20、25、30、40、50、60mg/mL。 參照文獻(xiàn)36-38方法，按表3-1配方加入。表3-1 各試劑加入量名稱磷酸緩沖液50mmol/L鄰二氮菲5.0mmol/LFeSO47.5mmol /L超純水樣品/維生素CH2O20.1%A未損(mL)1.00.750.52.75-A損傷(mL)1.00.7

42、50.52.25-0.5A樣品(mL)1.00.750.51.750.50.5每加入一樣試劑時(shí)充分混合。反應(yīng)在37溫水浴中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)lh后，快速記錄536nm處的吸光度。每個(gè)濃度設(shè)3組平行。按公式3-1計(jì)算樣品對(duì)OH·自由基的清除率:清除率%=(A536(加樣)-A536(損傷)/(A536(未損傷)-A536(損傷) ×100% （3-1）上式中，A536(加樣)：樣品組吸光度；A536(損傷)：空白組吸光度；A536（未損傷)：標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組吸光度。3.2 靈芝多糖對(duì)DPPH自由基的作用3.2.1 原理DPPH自由基屬于比較穩(wěn)定的有機(jī)物自由基具有單電子而使其在517nm

43、處有一強(qiáng)吸收（呈深紫色），當(dāng)存在自由基清除劑時(shí), 由于其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系。3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法DPPH溶液配制：取0.010g DPPH用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，DPPH的濃度為0.1mmol/L。配制好后于棕色瓶避光置冰箱待用。靈芝多糖樣品/維生素C濃度配成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/mL。參照文獻(xiàn)38-40的方法，將實(shí)驗(yàn)分為樣品組、對(duì)照組和空白組;具體操作如下:樣品組： 2mLDPPH溶液+0.5mL多

44、糖樣品溶液+l.5mL水陽性對(duì)照組：2mLDPPH溶液+0.5mL維生素C對(duì)照品溶液+l.5mL水空白組： 2mL乙醇+0.5mL多糖樣品或維生素C對(duì)照品溶液+l.5mL水陰性對(duì)照組：2mLDPPH溶液+2mL水每一支試管加完試劑充分混勻，靜置30min后在517nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品做三組平行。清除DPPH自由基的能力按公式3-2計(jì)算:清除率%=l-(A2-A1)/A0 ×100% (3-2）上式中，A2: 2mLDPPH溶液+0.5mL多糖樣品或維生素C對(duì)照品溶液+l.5mL水的吸光度； A1: 2mL乙醇+0.5mL多糖樣品溶液+l.5mL水的吸光度； A0: 2mLDPP

45、H溶液+2mL水的吸光度。3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.3.1靈芝多糖對(duì)羥基自由基的作用圖3-1 靈芝多糖/維生素C對(duì)羥基自由基的清除作用由圖3-1可知，靈芝多糖體外有一定的清除羥基自由基作用，其清除率與濃度存在量效關(guān)系，濃度越大，對(duì)羥基自由基清除作用越強(qiáng)。相同濃度下，維生素C清除羥基自由基的能力強(qiáng)于靈芝多糖。維生素C的IC50 值為0.80mg/mL，靈芝多糖的IC50 值為27.55mg/mL。維生素C濃度很低就有比較強(qiáng)的清除作用，然而隨著濃度繼續(xù)增加，對(duì)羥基自由基的清除率有所下降。3.3.2靈芝多糖對(duì)DPPH自由基的作用圖3-2 靈芝多糖/維生素C對(duì)DPPH自由基的清除作用由圖3-2可知，靈

46、芝多糖在體外對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，其清除率與濃度存在量效關(guān)系，濃度越大，對(duì)DPPH自由基清除作用越強(qiáng)。相同濃度下，維生素C清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于靈芝多糖。維生素C的IC50 值為0.056mg/mL，靈芝多糖的IC50 值為3.85mg/mL。維生素C的清除率曲線呈線性迅速提高，達(dá)到最大清除率后基本保持不變。4 靈芝多糖的抗糖化活性4.1 原理糖化是指體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)與從食物中攝取的“糖”相結(jié)合后生成糖化蛋白質(zhì)，積存在體內(nèi)的現(xiàn)象。非酶糖化是指在無須酶的參與下，還原性糖的醛基與蛋白質(zhì)氨基發(fā)生的一系列反應(yīng)。這一反應(yīng)中生成的一類物質(zhì)稱之為蛋白質(zhì)糖化終末產(chǎn)物。經(jīng)過非酶糖化反應(yīng)最后形成

47、的非酶糖化終產(chǎn)物產(chǎn)生棕色色素，具有高度熒光性和交聯(lián)性。本實(shí)驗(yàn)用熒光檢測(cè)的方法來檢測(cè)非酶糖化的強(qiáng)弱，從而得出靈芝多糖的抗糖化作用。4.2 實(shí)驗(yàn)方法量取0.05mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.4）700mL，依次加入14g牛血清白蛋白，12.611g葡萄糖，0.35g疊氮化鈉，使各組分充分溶解，配成含2%牛血清白蛋白，0.1M葡萄糖和0.05%疊氮化鈉的原液。稱取靈芝多糖樣品/氨基胍 10mg、20mg、30mg，分別加入25mL上述血清白蛋白原液，配成0.4、0.8、1.2mg/mL的溶液。每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行對(duì)照.對(duì)照組無靈芝多糖和氨基胍。用孔徑0.22微米膜過濾去除細(xì)菌，各組分別在3

48、7的培養(yǎng)箱中避光孵化三個(gè)星期。每一周使用熒光光譜儀熒光測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm41-42?？固腔钚杂晒?-1計(jì)算：抑制率（%）=（對(duì)照組熒光值-樣品組的熒光值）/對(duì)照組熒光值×100%(4-1)4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論表4-1 氨基胍/靈芝多糖的抑制率0.4（mg/mL）0.8（mg/mL）1.2（mg/mL）氨基胍抑制率%1（周）10.5312.4214.782（周）34.1739.3047.383（周）26.3936.7246.40多糖樣品抑制率%1（周）-2.27-0.035-8.542（周）-1.223.32-4.713（周）-1.082.78-1.9

49、0圖4-1 氨基胍的抗糖化作用圖4-2 靈芝多糖的抗糖化作用由以上圖表可以看出，氨基胍有抗糖化作用，而且在第一、二周其抑制率與濃度、時(shí)間存在量效關(guān)系。濃度越大，抑制率越大；時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越大。在第三周時(shí)，抑制率有所下降。孵化一個(gè)周的靈芝多糖樣品的抗糖化作用都沒表現(xiàn)出來，2,3個(gè)星期后0.8mg/mL的樣品有一定的抗糖化作用，但濃度和抑制率沒有明顯的線性關(guān)系。5 氣相色譜分析靈芝多糖的單糖組成5.1 實(shí)驗(yàn)方法5.1.1 多糖水解稱取25mg靈芝多糖樣品于安瓿瓶中，加入2mL 2mol/L的三氟乙酸，封管后置于120中水解，6h后取出冷卻，濃縮至干，得單糖樣品置于干燥箱中備用43。5.1.2 樣

50、品單糖的衍生化將上述備用的靈芝多糖水解產(chǎn)物中，加入20mg鹽酸羥胺及1mL無水吡啶，充分振蕩溶解，于90水浴反應(yīng)30min，取出，冷卻到室溫，加入1mL醋酐，于90反應(yīng)30min，取出冷卻后濃縮蒸干，殘?jiān)尤?mL氯仿溶解，即可直接進(jìn)行氣相色譜分析。5.1.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化單糖：分別稱取木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖10mg于試管中，分別加入10mg鹽酸羥胺和0.5mL吡啶溶解后，90密閉加熱30min后，冷卻，加入0.5mL醋酐，再于90密閉加熱30min。取出冷卻后真空濃縮蒸干，殘?jiān)尤?.5mL 氯仿溶解，即可直接進(jìn)行氣相色譜分析?；旌蠁翁牵悍Q取木糖、阿拉伯糖、甘露糖

51、、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖5mg于50mL圓底燒瓶中，分別加入35mg鹽酸羥胺和1.75mL吡啶溶解后，90密閉加熱30min后，冷卻，加入1.75mL醋酐，再于90密閉加熱30min。取出冷卻后真空濃縮蒸干，殘?jiān)尤?.5mL氯仿溶解，即可直接進(jìn)行氣相色譜分析44。5.1.4 氣相色譜條件進(jìn)口溫度：250，分流比：0.06，起始溫度：200，以15/min升至220，保持10min，再以10/min升至240，保持10min。5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖分析由各標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖得各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間，可給標(biāo)準(zhǔn)單糖混合樣的氣相色譜圖中各色譜峰定性。其結(jié)果見表5-1及圖5-1。表

52、5-1 各標(biāo)準(zhǔn)單糖的出峰時(shí)間單糖 鼠李糖 阿拉伯糖 木糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖保留時(shí)間 7.482 8.204 8.520 14.316 14.621 15.628 (min)鼠李糖(7.402min),阿拉伯糖（8.033min）,木糖（8.432min）,甘露糖（14.160min）, 葡萄糖（14.585min）,半乳糖（15.288min）圖5-1 標(biāo)準(zhǔn)單糖混和樣品的氣相色譜圖5.2.2 樣品多糖中各組分的定性分析圖5-2 靈芝多糖水解物的氣相色譜圖根據(jù)各色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)照，可知靈芝多糖水解物氣相色譜圖中保留時(shí)間為14.605min的峰與圖5-1中的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰相

53、吻合。由此推斷，靈芝多糖由葡萄糖組成。而保留時(shí)間為13.510min的峰在圖5-1中不與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰相吻合，有可能是有其他單糖成分。因此，靈芝多糖的結(jié)構(gòu)單元是由葡萄糖和另一種單糖組成，其中，葡萄糖為主要成分。6 結(jié)論6.1 靈芝多糖提取工藝優(yōu)化6.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)（1）提取時(shí)間越長(zhǎng)，靈芝多糖的得率越高。3h為最佳提取時(shí)間。（2）提取溫度越高，靈芝多糖的得率也越高。90為最佳提取溫度。（3）提取液料比越大，靈芝多糖的得率也越高。1: 30為最佳提取液料比。（4）提取次數(shù)越多，靈芝多糖的得率也越高。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及考慮到實(shí)際生產(chǎn)，提取次數(shù)最佳為二次提取。 6.1.2 正交實(shí)驗(yàn)靈芝多糖提取的最佳工

54、藝條件為：提取液料比為1: 30，提取溫度為90，提取時(shí)間為2.5 h。6.1.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)在相同的條件下提取，多糖得率不完全一樣；但提取出來的靈芝多糖重量相當(dāng)，所以基本能驗(yàn)證此條件（提取時(shí)間2. 5h、提取溫度90、提取液料比1: 30）為最佳提取條件。6.2 靈芝多糖的活性6.2.1 靈芝多糖的體外抗氧化活性靈芝多糖在一定的濃度范圍內(nèi), 對(duì)羥基自由基和DPPH自由基都有清除作用，清除率與濃度之間存在量效關(guān)系。6.2.2 靈芝多糖的抗糖化活性靈芝多糖需要在一定的時(shí)間之后才顯示出來較低的抗糖化活性，且濃度和抑制率沒有明顯的線性關(guān)系。6.3 氣相色譜分析靈芝多糖的單糖組成靈芝多糖的結(jié)構(gòu)單元是由葡萄糖和另一種單糖組成，其中，葡萄糖為主要成分。參考文獻(xiàn)1 張霞. 蕨麻多糖免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用的研究D. 上海: 中國(guó)科學(xué)院上海冶金研究所, 20002 金城, 張樹政. 糖生物學(xué)與糖工程的興起與前景J. 生物工程進(jìn)展, 1995, 15(3): 12-173 陳惠黎. 牛津大學(xué)糖生物學(xué)研究概況J. 生物工程進(jìn)展, 2000, 2(4): 23-254 陳金煙, 盧政輝. 真菌多糖的免疫效應(yīng)抗腫瘤作用機(jī)理的探討J. 福建輕紡，2002, 8(4): 4-75 閎三弟. 真菌的藥用價(jià)值J. 食用菌學(xué)報(bào), 1997, 1(4):