應(yīng)答蛋白基因多態(tài)性對矽肺發(fā)生的修飾作用

1、應(yīng)答蛋白基因多態(tài)性對矽肺發(fā)生的修飾作用    內(nèi)容導(dǎo)讀：R)技術(shù)測定二氧化硅粉塵處理AMs的培養(yǎng)上清刺激HELF應(yīng)答蛋白如熱休克蛋白70(HSP70)各型(HSP70-1、HSP70-2和HSP70-hom)、熱休克蛋白27(HSP27)、金屬硫蛋白(MT)亞型1A、2A和血紅素氧合酶-1(HO-1)以及與ECM合成、降解有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)及其組織抑制劑1(TIMP1)mRNA表達(dá)，觀察其誘導(dǎo)表達(dá)水平的變化規(guī)律。同時，利用蛋白質(zhì) 矽肺是我國最為嚴(yán)重的職業(yè)衛(wèi)生問題之一，其發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜至今尚未明確，可能涉及：矽塵誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生各種

2、細(xì)胞調(diào)節(jié)因子、誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷等，從而引起肺成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下大量誘導(dǎo)合成應(yīng)答蛋白，對細(xì)胞防御具有重要意義。目前關(guān)于應(yīng)答蛋白與矽肺的相關(guān)研究較少，本課題采用離體實驗和人群分子流行病學(xué)方法探討應(yīng)答蛋白與矽肺發(fā)生的關(guān)系。離體實驗：大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)和人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)組成體外模型。采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測定二氧化硅粉塵處理AMs的培養(yǎng)上清刺激HELF應(yīng)答蛋白如熱休克蛋白70(HSP70)各型(HSP70-1、HSP70-2和HSP70-hom)、熱休克蛋白27(HSP27)、金屬硫蛋白(MT)亞型1A、2A和血紅素氧合酶-1(H

3、O-1)以及與ECM合成、降解有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)及其組織抑制劑1(TIMP1)mRNA表達(dá)，觀察其誘導(dǎo)表達(dá)水平的變化規(guī)律。同時，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的雙向凝膠電泳分離技術(shù)與質(zhì)譜鑒定技術(shù)(2-DE-MS)對模型中HELF蛋白表達(dá)進(jìn)行分析并采用免疫印跡法(westernblot)對其中的HSP27進(jìn)行驗證。一定范圍內(nèi)，HELF的HSP70-1、HSP70-2、HSP70-hom以及HO-1、HSP27等應(yīng)答蛋白mRNA表達(dá)與二氧化硅(SiO_2)粉塵濃度呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系(P0.05)，但不同的應(yīng)答蛋白有不同的誘導(dǎo)動力學(xué)特征。各種應(yīng)答蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)到峰值時間各有不

4、同。MT1A、MT2A的mRNA表達(dá)雖能被染塵AMs上清誘導(dǎo)，但無明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。MMP9、TIMP1能被明顯誘導(dǎo)表達(dá)，但MMP9、TIMP1mRNA表達(dá)存在一定的時差，早期以MMP9增高為主，隨著時間的延長，以TIMP1表達(dá)增加更為明顯。2-DE-MS初步鑒定了經(jīng)誘P70-1(G190C)、HSP70-2(A1267G)和HSP70-hom(T2437C)基因進(jìn)行基因分型。粉塵接觸評估經(jīng)單因素方差分析：JEM在病例組明顯高于對照(P0.01)。病例組中期矽肺均勻JEM：105.4±46.9，期矽肺均勻JEM：114.3±40.3，期矽肺均勻JEM：92

5、.3±34.3，其別間差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。相關(guān)分析顯示：JEM與矽肺分期呈明顯的正相關(guān)(P0.01)。研 導(dǎo)的HELF的數(shù)個蛋白：HSP27、Peroxiredoxin亞型b、鈣網(wǎng)蛋白-3和鈣網(wǎng)蛋白-5類似物等。其中經(jīng)westernblot檢測證實HSP27蛋白可被染塵AMs上清誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)水平隨染塵劑量的增加而增加，與HSP27mRNA表達(dá)趨勢基本一致。人群分子流行病學(xué)：采用病例-對照方法。選擇中國西南某兩大煤礦519例礦工為研究對象，其中接塵對照294例，確診的矽肺患者225例(期134例、期73例、期18例)。采用工種接觸數(shù)值估測(JEM)對累積粉塵暴露進(jìn)行接觸

6、評估；對礦工的吸煙、飲酒等生活習(xí)慣、職業(yè)衛(wèi)生習(xí)慣、職業(yè)危害認(rèn)知狀況、心理狀況及營養(yǎng)狀況等進(jìn)行具體的問卷調(diào)查；進(jìn)行肺功能檢查并調(diào)查呼吸困難情況等對接塵礦工的健康效應(yīng)進(jìn)行評價；采用采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法對174例非吸煙人群(41名健康對照、133名礦工)血清中的MMP9TIMP1進(jìn)行測定；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)基因分型技術(shù)對519例礦工的MMP9(C-1562T)、HSP70-1(G190C)、HSP70-2(A1267G)和HSP70-hom(T2437C)基因進(jìn)行基因分型。粉塵接觸評估經(jīng)單因素方差分析：JEM在病例組明顯高于對照(P0

7、.01)。病例組中期矽肺均勻JEM：105.4±46.9，期矽肺均勻JEM：114.3±40.3，期矽肺均勻JEM：92.3±34.3，其別間差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。相關(guān)分析顯示：JEM與矽肺分期呈明顯的正相關(guān)(P0.01)。研究現(xiàn)場粉塵現(xiàn)況為：各項指標(biāo)基本達(dá)標(biāo)，但是個別工種均勻濃度還有超標(biāo)現(xiàn)象，總粉塵濃度甚至達(dá)到30。提示還存在一定的隱患。對各期矽肺患者的肺通氣功能測定并結(jié)合具體的個體調(diào)查進(jìn)行分析：矽肺組肺功能參數(shù)中用力肺活量(FVC)、一秒鐘用力呼氣量(FEV1.0)、FEV1.0FV C的實測值、實測值與猜測值百分比均明顯低于對照組(P0.05)；各

8、項肺功能參數(shù)隨著JEM分級的增加而呈下降的趨勢(P0.05)；趨勢卡方檢驗：肺功能異常類型發(fā)生率從高到低依次為限制性通氣功能障礙、阻塞性通氣功能障礙、混合性通氣功能障礙。兩分類Logistic回歸分析，礦工肺功能障礙有統(tǒng)計學(xué)差異的影響因素按OR值從大到小依次排列為： 期矽肺(OR=12.557)、期矽肺(4.863)、BI400(2.971)、BI600(2.504)、JEM150(2.390)、BI400(2.300)、慢支(1.715)。174例非吸煙人群(健康對照41例，接塵工人64例，矽肺患者69例)血清MMP9及TIMP1檢測結(jié)果經(jīng)秩和檢驗：與健康對照組比較，接塵工人血清中MMP9增

9、加較為明顯(P0.05)，而TIMP1增加的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)，各期矽肺的MMP9、TIMP1濃度呈增加趨勢，而MMP9TIMP1比值呈下降趨勢，且與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)JEM分級與年齡分級校正，與接塵對照組比較，期矽肺患者的TIMP1升高(P0.05)，期矽肺患者M(jìn)MP9TIMP1比值增加(P0.05)以及期矽肺患者的MMP9、TIMP1升高(P0.05)，而MMP9TIMP1呈下降趨勢(P0.01)?；蚍中徒Y(jié)果經(jīng)卡方檢驗：HSP70-2(A1267G)等位基因頻率在矽肺各期間分布差異有邊沿統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046)，G位點的攜帶率在 期矽肺中

10、明顯高于期矽肺和接塵對照組(P0.05)。 期矽肺的HSP70-hom(T2437C)的突變純合子(CC)攜帶率高于接塵對照組和期矽肺(8.8vs2.4和3)，在相同JEM分級和相同的布萊克曼吸煙指數(shù)(BI)分級，攜帶突變純合基因型的個體發(fā)生矽肺的風(fēng)險明顯高于雜合子攜肺的發(fā)生除了通過控制作業(yè)場所的粉塵濃度，同時做好個體防護(hù)，減少粉塵暴露；加強(qiáng)礦工職業(yè)衛(wèi)生教育和健康促進(jìn)，識別易感人群(如HSP70-hom2437C的CC基因型、以及HSP70-1，HSP70-2和HSP70-hom的G-G上一頁 1 2 3 4 5 6 下一頁

11、 帶個體與野生純合子攜帶個體(P0.05)。MMP9-1562CC野生純合子基因型與HSP70-2G位點攜帶者在 期矽肺中的分布與對照和期矽肺組比較差異有臨界差異(P=0.087)；JEM(150)水平下，HSP70-hom2437C突變位點的攜帶者中，其分布在矽肺與對照組比較也表現(xiàn)出臨界差異(P=0.094)。吸煙和基因間的交互作用分析沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。LDA分析顯示HSP70-1(190)、HSP70-2(1267)和HSP70-hom(2437)三對等位基因處于高度連鎖不平衡；PHASE軟件進(jìn)行單倍型分析：HSP70-1，HSP70-2和HSP70-hom的190，126

12、7和2437等位基因構(gòu)成的G-A-T和G-G-T單倍型在 期矽肺中明顯增加，與期矽肺和接塵對照相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。綜上所述，HELF應(yīng)答蛋白HSP70各型(HSP70-1、HSP70-2和HSP70-hom)、HSP27、HO-1以及MMP9TIMP1mRNA的表達(dá)能被染SiO_2粉塵的AMs上清誘導(dǎo)并呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系，但各自存在不同的誘導(dǎo)動力學(xué)特征，提示可能是由于被研究基因表達(dá)的調(diào)控序列存在差異；不同應(yīng)答蛋白表達(dá)存在時相差，交錯對細(xì)胞起到保護(hù)作用。MMP9TIMP1mRNA表達(dá)時相差異提示早期以MMP9表達(dá)及活性增加，基質(zhì)降解為主；TIMP1出現(xiàn)對MMP

13、9起拮抗作用，隨著MMP9TIMP平衡打破，膠原沉積。HSP27、Peroxiredoxin及鈣網(wǎng)蛋白等與SiO_2引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。預(yù)防矽肺的發(fā)生除了通過控制作業(yè)場所的粉塵濃度，同時做好個體防護(hù)，減少粉塵暴露；加強(qiáng)礦工職業(yè)衛(wèi)生教育和健康促進(jìn)，識別易感人群(如HSP70-hom2437C的CC基因型、以及HSP70-1，HSP70-2和HSP70-hom的G-G -T、G-A-T單倍型攜帶者)。為達(dá)到WHO消除矽肺的目標(biāo)而奮斗。【關(guān)鍵詞】：矽肺二氧化硅肺泡巨噬細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)雙向凝膠電泳離子化-飛行時間質(zhì)譜職業(yè)流行病學(xué)熱休克蛋白70熱休克蛋白27血紅素氧合酶

14、-1基質(zhì)金屬蛋白酶-9基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1多態(tài)性【論文提綱】：· 中文摘要6-9· 英文摘要9-13· 前言13-16· 第一部分應(yīng)答蛋白對矽肺發(fā)生的修飾作用之離體實驗研究16-48· 1.材料與方法16-26· 1.1主要試劑與儀器16-17· 1.2實驗粉塵的制備17· 1.3大鼠AMs的收集、純化與培養(yǎng):17· 1.4粉塵誘導(dǎo)的肺泡AMs上清制備:17-18· 1.5二氧化硅粉塵對實驗大鼠AMs的毒性效應(yīng)18· 1.6二氧化硅粉塵處理的AMs上清對HELF的作用18-19

15、· 1.7HELF應(yīng)答蛋白與MMP9/TIMP1mRNA表達(dá)19-21· 1.8SiO_2粉塵處理的AMs上清對HELF蛋白表達(dá)的作用21-24· 1.9差異蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)時間質(zhì)譜飛行儀(MALDI-TOF-MS/MS)分析24-25· 1.10差異蛋白的驗證25-26· 1.11統(tǒng)計方法26· 2.結(jié)果26-42· 2.1二氧化硅粉塵對大鼠AMs的毒性效應(yīng)26-28· 2.2二氧化硅粉塵處理的AMs上清對HELF的作用28-31· 2.3體外模型HELF應(yīng)答蛋白與MMP9/TIMP1mRNA表達(dá)31-3

16、8· 2.4二氧化硅粉塵處理的AMS上清對HELF的蛋白表達(dá)的作用38-42· 2.4.1IPG-DALT雙向凝膠電泳(2-DE)38-40· 2.4.2差異蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)時間質(zhì)譜飛行儀(MALDI-TOF-MS/MS)分析40-41· 2.4.3差異蛋白HSP27的表達(dá)驗證41-42· 3.討論42-48· 第二部分應(yīng)答蛋白基因多態(tài)性對矽肺發(fā)生修飾作用的分子流行病學(xué)48-81· 1.研究內(nèi)容與方法49-56· 一、接塵礦工的職業(yè)流行病學(xué)調(diào)查49-51· 二、接塵工人的健康效應(yīng)調(diào)查594綜述94-109上一頁 1 2 3 4 5 6  1-52· 三、血清MMP9/TIMP1及候選基因的基因多態(tài)性檢測52-56· 2.結(jié)果56-74· 一、接塵礦工的職業(yè)流行病學(xué)56-60· 二、