基因工程的基本操作步驟

1、1 1、基因工程包括哪些步驟？、基因工程包括哪些步驟？3 3、基因工程中的核心環(huán)節(jié)是哪一步？、基因工程中的核心環(huán)節(jié)是哪一步？4 4、基因表達(dá)載體導(dǎo)入到受體細(xì)胞有哪些方法？、基因表達(dá)載體導(dǎo)入到受體細(xì)胞有哪些方法？5 5、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞就會成功表達(dá)嗎？、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞就會成功表達(dá)嗎？ 如何檢測和鑒定？如何檢測和鑒定？2 2、什么是目的基因？獲取的方法有哪些方法？、什么是目的基因？獲取的方法有哪些方法？ 思考討論問題：思考討論問題：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目

2、的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定 主要是指主要是指編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì)的基因的基因( (一）目的基因一）目的基因 目前被廣泛提取使用的目的基因有：目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因人胰島素基因人胰島素基因等。等。一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取（二）獲取目的基因的方法（二）獲取目的基因的方法1、從基因文庫中直接獲取、從基因文庫中直接獲取2、PCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增3、化學(xué)方法直接人工合成、化學(xué)方法直接人工合成1 1、從基因文庫中直接獲取、從基因文庫中直接獲取（1 1）基因文庫的概念）基因文庫的概念

3、部分基因文庫：部分基因文庫： 基因組基因組DNADNA文庫：文庫： 將含有某種生物將含有某種生物不同不同基因的許多基因的許多DNADNA片斷，導(dǎo)入到受體菌片斷，導(dǎo)入到受體菌的的群體群體中，中，各個受體菌各個受體菌分別含有這種生物的分別含有這種生物的不同基因不同基因，稱為基，稱為基因文庫因文庫含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分基因部分基因，如如:cDNA:cDNA文庫文庫（2 2）基因文庫的建立方法基因文庫的建立方法提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖杏眠m當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DN

4、ADNA片段與運載體連接片段與運載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫方法一：直接分離法方法一：直接分離法某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補單鏈互補DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存與運載體連接與運載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶方法二：反轉(zhuǎn)錄法方法二：反轉(zhuǎn)錄法-cDNA-cDNA的合成流程圖解的合成流程圖解PCR擴增儀擴增儀DNADNA半保留復(fù)制的基本原理半保留復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一

5、對引物一對引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNADNA2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因原理：原理：前提：前提：條件：條件：利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因5 53 3G GG G T TC C3 35 5 A AG GC CC C5 53 3引物引物G GG G高溫高溫變性變性低溫低溫退火退火中溫中溫延伸延伸1.1.目的基因目的基因DNADNA受熱變性，解鏈；受熱變性，解鏈；5 53 3 A AG G 引物引物2.2.引物與單鏈互補結(jié)合；引物與單鏈互補結(jié)合；3.3.合成鏈在合成鏈在DNADNA聚合酶作用下

6、進(jìn)行延伸。聚合酶作用下進(jìn)行延伸。、 核心核心二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建功能功能：使目的基因進(jìn)入使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并有效表達(dá)，受體細(xì)胞并有效表達(dá)，而且要能穩(wěn)定存在且遺而且要能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。傳給后代。啟動子啟動子 啟動子：啟動子：位于基因首端一段能與位于基因首端一段能與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合并能結(jié)合并能起始起始mRNAmRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。 RNA RNA聚合酶聚合酶: :能夠識別能夠識別啟動子上的結(jié)合位點啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)合的一種蛋白質(zhì). . 終止子：終止子：位于基

7、因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，它片斷，它能阻礙能阻礙RNARNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNADNA模板鏈上脫離模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。下來，使轉(zhuǎn)錄終止。終止子終止子啟動子啟動子終止子終止子b b、目的基因、目的基因a a、啟動子、啟動子c c、終止子、終止子d d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因e e、復(fù)制原點、復(fù)制原點1 1、下列屬于獲取目的基因的方法的是下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取從基因組文庫中提取 從受體細(xì)胞中提取從受體細(xì)胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用D

8、NADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成 A.A. B. B. C. C. D. D.2 2、19971997年，科學(xué)家將動物體內(nèi)的能年，科學(xué)家將動物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNADNA分子重組，并且在大腸桿菌中表分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。請據(jù)右下圖回答問題。達(dá)成功。請據(jù)右下圖回答問題。(1)(1)此圖表示的是采取此圖表示的是采取_合成基合成基因的方法獲取因的方法獲取_基因的過程。基因的過程。(2) (2) 圖中圖中DNADNA是以為是以為_ _ 模板，形成單鏈模板，形成單鏈DNADNA，在酶的作用下，在酶的作用下合成雙鏈合成雙鏈DNADNA，

9、從而獲得了所需要的，從而獲得了所需要的目的基因。目的基因。人工人工 目的目的 控制胰島素合成的信使控制胰島素合成的信使RNARNA (3) (3) 圖中代表圖中代表 ，它往往含它往往含 基因，以便對基因，以便對目的基因的檢測。目的基因的檢測。重組重組DNADNA分子分子 標(biāo)記標(biāo)記 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2、基因槍法、基因槍法3、花粉管通道法、花粉管通道法土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法顯微注射法顯微注射法將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞方法將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞方法宿主

10、細(xì)胞（大腸桿菌）宿主細(xì)胞（大腸桿菌）感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌）（大腸桿菌）Ca2+n首先：首先：n其次：其次：n最后：最后：n還要：還要：要檢測轉(zhuǎn)基因生物的要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因上是否插入目的基因DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 分子探針分子探針檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)個體生物學(xué)水平的鑒定個體生物學(xué)水平的鑒定多細(xì)胞生物的檢測，將每個受體細(xì)胞單獨培多細(xì)胞生物的檢測，將每個受體細(xì)胞單獨培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因

11、是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。變化的個體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)?？瓜x基因并得到表達(dá)。3（2010江蘇高考，江蘇高考，27題，題，8分分）下表中列出了幾種限制酶識）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖別

12、序列及其切割位點，圖l、圖、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：位點。請回答下列問題：（1）一個圖）一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma 切割前后，分別含有切割前后，分別含有 個游離的磷酸基團(tuán)。個游離的磷酸基團(tuán)。0、2 （2）若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的）若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Sma酶切位點越多，酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 。（3）用圖中的質(zhì)粒和外源）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割，原因是切割，原因是 。（4）與只使用）與只使用EcoR I相比較，使用相比較，使用BamH 和和Hind 兩種兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防的優(yōu)點在于可以防止止 。（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入合，并加入 酶。酶。（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了了 。（7）為了從）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，將重文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的