雙水相萃取技術(shù)在生物活性物質(zhì)分離提純中的研究進(jìn)展

1、雙水相萃取技術(shù)在生物活性物質(zhì)分離提純中的研究進(jìn)展摘要：雙水相萃取技術(shù)作為一項(xiàng)新的分離技術(shù)日益受到重視,它與傳統(tǒng)的萃取方法相比有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。本文將簡(jiǎn)要綜述雙水相萃取技術(shù)的基本原理、在分離提純生物物質(zhì)中的應(yīng)用情況以及今后的發(fā)展方向。關(guān)鍵詞：雙水相萃??；生物活性物質(zhì)；分離提純Separation and Purification of Bioactive Substances in Aqueous Two-phase Extraction in ProgressName: Chen Zhi-bin Student ID: 201011130798 Professional: Biological C

2、hemical Class: 13 classesAbstract: Aqueous Two-phase Extraction technology has received increasing attention as a new separation technology, which is compared with the traditional extraction methods has unique advantages. This article will briefly summarize two-phase extraction technology through th

3、e basic principle of separation ， purification of biological substances in the application and future development direction. Key words: aqueous two phase extraction; biologically active substances; separation and purification朗讀顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音 字典 - 查看字典詳細(xì)內(nèi)容隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞培養(yǎng)工程代謝工程等高新生物技術(shù)研究工作的廣泛展開(kāi)各種生

4、化新產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，但由于大部分的生物產(chǎn)品原液是具有低濃度和生物活性的，對(duì)分離條件以及環(huán)境要求極其苛刻，使得傳統(tǒng)的液液萃取已不能適應(yīng)分離要求，因此一種新型的液液分離技術(shù)雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取應(yīng)運(yùn)而生。雙水相萃取(Aqueous TwoPhase Extraction，ATPE技術(shù)是為適應(yīng)生物工程的迅猛發(fā)展，于六十年代首先由瑞典的PAAlbertson等提出的。近年，雙水相萃取技術(shù)因設(shè)備投資少，操作簡(jiǎn)單，引起了人們極大的重視，并且被廣泛用于生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域1，涉及到細(xì)胞、膜、病毒、蛋白質(zhì)、核酸以及其他天然藥物有效成分的分離及提純2。由于它具有活性損失小、分離步驟少、操作條件溫

5、和，且不存在有機(jī)溶劑殘留的問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，所以在生物活性成分及天然產(chǎn)物有效成分的提取分離方面有良好的應(yīng)用前景。1. 雙水相萃取相關(guān)理論的發(fā)展早在1896年,Beijerinck發(fā)現(xiàn),當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時(shí),得到一個(gè)混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉, 這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueous two phase system，ATPS。1955年由Albertson首先利用兩水相技術(shù)分離生物分子，他主要研究了聚乙二醇(PEG/葡聚糖(Dex系統(tǒng)和PEG/(NH42SO4系統(tǒng)在分離提純中的應(yīng)用。在隨后的幾十年中，這項(xiàng)技術(shù)有

6、了長(zhǎng)足的發(fā)展。在雙水相的分離模型研究中，主要提出了兩類模型3，4，Edmond等人提出的滲透維里模型，即Edmond bgston方程；Flory和Huggins根據(jù)熱力學(xué)的基本原理提出FloryHuggins晶格模型。前者在預(yù)測(cè)聚合物的成相行為和蛋白質(zhì)的分配上有較高的準(zhǔn)確度，后者在粒子的能量概念上可以很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。自20世紀(jì)80年代中期以來(lái)，各國(guó)學(xué)者開(kāi)展了進(jìn)一步的研究工作，各類用于計(jì)算生物物質(zhì)在雙水相系統(tǒng)分配系數(shù)的模型也時(shí)有報(bào)道,諸如Baskir晶體吸附模型5、Hayne模型、Pitzer模型6、Grossman自由體積模型等,但結(jié)果均難以令人滿意。1989年,Diamond等7以Fl

7、ory Huggins理論為基礎(chǔ),用把相間電勢(shì)表達(dá)為上下相濃度差的二次函數(shù)來(lái)關(guān)聯(lián)分配系數(shù)的方法,提出了能對(duì)肽和蛋白質(zhì)在聚合物/聚合物/水體系的分配系數(shù)很好關(guān)聯(lián)的Diamond Hsu模型。此后,針對(duì)用該模型計(jì)算蛋白質(zhì)在聚合物/鹽兩水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)時(shí)精確度不高的缺點(diǎn),Diamond等提出了改進(jìn)的Dim ond Hsu模型，進(jìn)一步提高了Diamond H su模型的精確度和普適性。Pessoa等8通過(guò)引入對(duì)聚合物水溶性和預(yù)分離物質(zhì)(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)的水化殼進(jìn)行描述的因子得到了FloryHuggi改進(jìn)模型，此模型很好地模擬了73種由PEGDex組成的雙水相體系的相平衡和分配系數(shù)。雖然雙水相萃取

8、技術(shù)在應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展，但目前這些工作幾乎都只是建立在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，至今還沒(méi)有一套比較完善的理論來(lái)解釋物質(zhì)在體系中的分配機(jī)理。2.雙水相萃取技術(shù)基本原理1.1雙水相的形成將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，體系會(huì)自然地分成互不相溶的兩相。雙水相體系的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無(wú)法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。一般認(rèn)為只要兩聚合物水溶液的憎水程度有所差異混合時(shí)就可發(fā)生相分離，且憎水程度相差越大，相分離傾向也就越大。與一般的水有機(jī)溶劑體系相比較，雙水相體系兩相的性質(zhì)差別(如密度和折射

9、率等較小。由于折射率的差別甚小，有時(shí)甚至都難于發(fā)現(xiàn)它們的相界面。兩相間的界面張力也很小，僅為10-610-4N/m(一般體系為10-310-2N/m。界面與試管壁形成的接觸角幾乎是直角。原則上，無(wú)論是天然的還是合成的親水性聚合物，絕大多數(shù)在與另一種聚合物水溶液混合時(shí)都可分成兩相，構(gòu)成雙水相體系部分雙水相系統(tǒng)列于表1。用于生物分離的高聚物體系有:聚乙二醇(簡(jiǎn)稱PEG/葡聚糖(簡(jiǎn)稱Dexteran和PEG/Dextran硫酸鹽體系。常見(jiàn)的高聚物/無(wú)機(jī)鹽體系為:PEG/硫酸性或磷酸鹽體系。表1各種雙水相系統(tǒng)聚合物1 聚合物2或鹽 聚合物1 聚合物2或鹽聚丙二醇 甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇聚乙二

10、醇 聚乙烯吡咯聚乙烯醇 烷酮聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖羥丙基葡聚糖 聚蔗糖葡聚糖乙基羥乙基纖維系 葡聚糖 羥丙基葡聚糖 葡聚糖聚丙二醇 硫酸鉀 聚乙二醇 硫酸鎂聚乙二醇 硫酸銨聚乙烯吡咯烷酮 硫酸鈉甲氧基聚乙二醇 甲酸鈉酒石酸甲鈉甲基纖維素 甲基纖維素 葡聚糖聚乙烯醇或葡聚糖 羥丙基葡聚糖聚乙烯吡咯烷酮 羥丙基葡聚糖1.2萃取原理9雙水相萃取與水有機(jī)相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的性質(zhì)不同。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等的存在和環(huán)境的影響，使其在上、下相中的濃度不同。對(duì)于某一物質(zhì)，只要選擇合適的雙水相體系，控制一定的

11、條件，就可以得到合適的分配系數(shù)，從而達(dá)到分離純化之目的。物質(zhì)在雙水相體系中分配系數(shù)K可用下式表示： K= C上/ C下 其中K為分配系數(shù)，C上和C下分別為被分離物質(zhì)在上、下相的濃度。 分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比,由于各種物質(zhì)的K值不同,可利用雙水相萃取體系對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。其分配情況服從分配定律，即“在一定溫度一定壓強(qiáng)下，如果一個(gè)物質(zhì)溶解在兩個(gè)同時(shí)存在的互不相溶的液體里，達(dá)到平衡后，該物質(zhì)在兩相中濃度比等于常數(shù)”，分離效果由分配系數(shù)來(lái)表征。 3. 雙水相萃取的應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工和食品化工等領(lǐng)域，并取得了許多成功的范例，主要是分離蛋白質(zhì) ，酶，病毒，

12、脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細(xì)胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。下面就生物活性物質(zhì)的應(yīng)用進(jìn)行闡述。3.1在發(fā)酵工程中的應(yīng)用由于發(fā)酵液中成分比較復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物含量低，而傳統(tǒng)的分離純化方法步驟繁瑣，導(dǎo)致產(chǎn)品回收率低，成本居高不下。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有利用雙水相休系從發(fā)酵液萃取分離目標(biāo)產(chǎn)物的報(bào)道和研究，并取得了一些成績(jī)。Pan等10利用PEG 1500/NaH2PO4體系從Trichoderma koningi i發(fā)酵液中分離純化木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數(shù)33。M aria等11利用PEG1000/NaH 2PO4體系從Fusarium s

13、olanipisi發(fā)酵液中分離純化角質(zhì)酶，該酶主要分配在上相，酶活回收率91%，純化倍數(shù)4.1。Mirjana12利用PEG 4000/Dex體系從Polypor ussquamosus發(fā)酵液中分離果膠酶，該酶主要分配在上相，酶活回收率80.2%，純化倍數(shù)2.45。Martinha13利用PEG 8000/(NH 42SO4體系從K l uy v er omy cesmar x i anus發(fā)酵液中分離胞外多聚半乳糖醛酸酶，該酶主要分配在上相，酶活回收率91%，純化倍數(shù)19。馮菁等14采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的PEG4000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的Na2 SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%NaCl組成的雙水相直接從重

14、組巴氏畢赤酵母發(fā)酵上清液中分離人溶菌酶，雙水相萃取率達(dá)到96.63%，純化因子為6.5。黃瑛等15采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的PEG 2000、15%的磷酸鹽和1%的NaCl組成的雙水相系統(tǒng)從洋蔥假單細(xì)胞G 63發(fā)酵粗酶液中提取脂肪酶，當(dāng)系統(tǒng)的pH為8.0時(shí)，分配系數(shù)4.36，純化因子3.98，脂肪酶的回收率達(dá)到87.25%。3.2在藥物方面的應(yīng)用薛珺等16采用PEG 800與吐溫80組合表面活性劑、硫酸銨、水形成雙水相體系萃取蘆丁，蘆丁在該雙水相體系的平均萃取率為95.0%。謝濤等17利用PEG 4000/K2HPO4組成的雙水相體系從三七中萃取三七皂苷，三七總皂苷的分配系數(shù)為14.2，回收率為96

15、%；趙愛(ài)麗等18利用質(zhì)K2 H PO4組成的雙水相體系分離純化黃苓苷，黃苓苷的分配系數(shù)達(dá)到29.8，收率達(dá)到98.6%。石慧等19利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%PEG 400、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%(NH42SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%NaCl組成的雙水相體系從加楊葉萃取液中萃取加楊葉總黃酮，萃取率達(dá)到95%以上。朱自強(qiáng)等20用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的PEG 2000與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的(NH 42 SO4組成的雙水相系統(tǒng)直接處理青霉素G發(fā)酵液，分配系數(shù)高達(dá)58.39，濃縮倍數(shù)為3.53，回收率為93.67%。3.3在生物工程中的應(yīng)用雙水相技術(shù)作為一種生化分離技術(shù)，由于其條件溫和，易操作，可調(diào)節(jié)因素多，并可借助傳統(tǒng)溶劑萃取的成

16、功經(jīng)驗(yàn)，而被認(rèn)為是一種生物下游工程初步分離的單元操作。Babu21等用質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%的PEG 1500與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的磷酸鹽組成的雙水相從菠蘿中萃取菠蘿蛋白酶和多酚氧化酶，菠蘿蛋白的純化倍數(shù)為4.0，酶活回收率達(dá)到22.8%，下相多酚氧化酶的純化倍數(shù)為2.07，酶活回收率達(dá)到90%。Chet hana22等用PEG 6000與(NH 42SO4組成的雙水相從甜菜根中萃取甜菜色素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%75%甜菜色素被萃取到上相，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%以上的糖類被萃取到下相。Harve和Bajpai23利用PEG/Dex雙水相系統(tǒng)分離純化了假單胞桿菌胞內(nèi)的立體專一性酒石酸脫氫酶。4. 雙水相技術(shù)的發(fā)展趨

17、勢(shì)244.1廉價(jià)新型雙水相系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)目前雙水相萃取技術(shù)走向工業(yè)化所需解決的最大問(wèn)題是構(gòu)成雙水相成相系統(tǒng)組分的價(jià)格十分昂貴。為了解決這個(gè)問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的研究，一方面用廉價(jià)的無(wú)機(jī)鹽代替以往常用的昂貴的葡聚糖。硫酸鈉、硫酸鎂、碳酸鉀等鹽與PEG形成的雙水相系統(tǒng)現(xiàn)已經(jīng)大量用于萃取操作；另一方面開(kāi)發(fā)可替代聚乙二醇和葡聚糖的高聚物。變性淀粉PPT、阿拉伯樹(shù)膠、Pulluan的微生物多糖、糊精、麥芽糖糊精、乙基羥乙基纖維素等取代葡聚糖，乙醇、異丙醇、丙酮、四氫呋喃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羥基纖維素等替代PEG，均取得階段性的成果。此外，有利用臨界膠束濃度下表面活性劑的特異自組織行為及良好的穩(wěn)定性

18、形成的ATPS，此類ATPS分相依據(jù)的是膠束的形成，包括由非離子型表面活性劑組成的ATPS和由離子型表面活性劑組成的ATPS。這些由表面活性劑組成的ATPS與傳統(tǒng)ATPS相比有含水量更高，兩相更容易分離，表面活性劑用量很少且可循環(huán)利用等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。4.2親和雙水相萃取技術(shù)親和吸附具有專一性強(qiáng)，分離效率高等特點(diǎn)。利用其特點(diǎn)，將親和吸附與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合，即對(duì)成相聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾。該體系不僅具有萃取系統(tǒng)處理量大、放大簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而且具有親和吸附專一性強(qiáng)、分離效率高的特點(diǎn)。4.3生物轉(zhuǎn)化與雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，隨著轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物量的增加，常會(huì)抑制生化過(guò)程的進(jìn)行。因此，及時(shí)移走產(chǎn)物是

19、生化反應(yīng)中的主要問(wèn)題之一。將雙水相系統(tǒng)與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合，形成雙水相生物轉(zhuǎn)化，解決了生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中存在的產(chǎn)物抑制以及生物催化劑回收利用兩方面的問(wèn)題，為生物轉(zhuǎn)化賦予了新的內(nèi)涵。4.4雙水相萃取與膜分離相結(jié)合利用中空纖維膜傳質(zhì)面積大的特點(diǎn)，將膜分離與雙水相萃取相結(jié)合，可以大大加快萃取傳質(zhì)速率。利用膜將雙水相體系隔開(kāi)，可解決雙水相萃取的乳化和生物活性物質(zhì)在界面的吸附問(wèn)題。因此，將膜分離同雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合，是解決雙水相體系易乳化問(wèn)題及加快萃取速率的有利手段。4.5雙水相萃取與細(xì)胞破碎過(guò)程相結(jié)合利用高速珠磨機(jī)為設(shè)備，將細(xì)胞破碎和雙水相萃取同時(shí)在珠磨機(jī)內(nèi)進(jìn)行。由于珠磨機(jī)內(nèi)有良好的混合條件，PEG、無(wú)機(jī)鹽

20、和水得到充分混合，形成均勻的雙水相分散體系。經(jīng)過(guò)珠磨機(jī)加工的勻漿直接用離心機(jī)分相，細(xì)胞碎片分配在下相，胞內(nèi)產(chǎn)物分配在上相。這種方法不僅節(jié)省了萃取設(shè)備和時(shí)間，而且由于雙水相對(duì)很多蛋白質(zhì)具有保持活性的特點(diǎn)，可以避免胞內(nèi)產(chǎn)物的損失。此外，國(guó)內(nèi)外又相繼開(kāi)展了微重力雙水相萃取、高速逆流雙水相分配、雙水相電萃取、溫度誘導(dǎo)相分離雙水相萃取等新技術(shù)的研究。5. 雙水相萃取技術(shù)的局限和未來(lái)展望25目前，雙水相萃取技術(shù)已被研究用于眾多生物產(chǎn)品的分離提純，并顯示出眾多其它分離技術(shù)不具備的優(yōu)點(diǎn)，是一種應(yīng)用前景廣闊的新型生物分離技術(shù)。但是，要將這一技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用到大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程，還有許多理論和實(shí)踐方面的技術(shù)問(wèn)題有待解決。

21、主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面。(1聚合物/聚合物構(gòu)成的雙水相體系具有良好的分離性能，但用于構(gòu)造雙水相體系的成相聚合物的價(jià)格都比較昂貴，對(duì)于一般的生物產(chǎn)品，分離成本過(guò)高，從經(jīng)濟(jì)上是不合理的。(2雖然通過(guò)選擇適宜的雙水相體系和操作條件，可獲得被分離物質(zhì)在兩相間較大的分配系數(shù)和較高的純化倍數(shù)，但目標(biāo)產(chǎn)物與成相物質(zhì)的分離比較困難。(3雙水相體系界面張力較小，雖有利于提高傳質(zhì)效率，但是較小的界面張力會(huì)易導(dǎo)致乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生，使相分離時(shí)間延長(zhǎng)，分離效率降低。(4雙水相體系中組分間的作用非常復(fù)雜，目前沒(méi)有建立一套較為完整的理論和方法解釋和預(yù)測(cè)物質(zhì)在雙水相體系中的相行為和被分配物質(zhì)在兩相中的分配行為。(5缺乏對(duì)雙水相

22、過(guò)程的工程放大及設(shè)備方面的研究，在體系流體力學(xué)，相際間的傳質(zhì)，傳遞過(guò)程方面研究很少。研究的方法基本上還是通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法，研究的結(jié)果只是建立在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，大部分情況下不能外延，缺乏對(duì)過(guò)程規(guī)律的認(rèn)識(shí)。(6對(duì)雙水相萃取工藝整體的集成優(yōu)化研究還不足，對(duì)分離過(guò)程中產(chǎn)生的大量含成相物質(zhì)的稀溶液，還沒(méi)有找到一條科學(xué)合理的利用及處理途徑，大量含鹽或含成相組分的廢水溶液難于回收及處理。雖然雙水相萃取技術(shù)研究中還存在很多問(wèn)題，但隨著對(duì)雙水相體系研究的不斷深入，性能優(yōu)良的新型成相物質(zhì)不斷發(fā)現(xiàn)以及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，這些方面的問(wèn)題將會(huì)逐步獲得解決。隨著雙水相萃取技術(shù)的不斷完善,雙水相萃取技術(shù)將成為一種生物活性物質(zhì)分

23、離提純的重要技術(shù)方法。參考文獻(xiàn)1林強(qiáng)，霍清雙水相體系萃取甘草酸鹽的研究J中草藥，2002，33(8：702-7043Fu ruya T,Iw ai Y,TanakaY,et al.M eas urem ent and correlat ion of part it ion coef ficient s of hydrolyt ic enz yi mes f or dext ran+poly(et hyl ene glycol+wat er aqeueou s t w oPhase syst em s at 20%J.Fluid PHase E qu ilbria,1995,110:115128

24、.4Flory P J.Principles of polymer chemist ryM.New York:Comell Press,1953.5Peng Q H,Li Z C,Li Y G.Experimen t s correlation and prediction of prot ein partit ion coef ficient inaqueou s t wo phasesystems containing PEG an d K 2 HPO 4 K H2 PO4J.Flu id Phase E qu ilibria,1995,107:303315.6Pitzer K S.The

25、rmodynamics of electrolyt es I Theoreti calbasi s and general equat ions equationsJ.PHys Chem.,1973,77:268277.7Doamond A D,H su J T.Fundament al st udies of biomolecule part iti on in aqu eous two phase systemJ.Biotechnology and Bioengi neering,1989,34:1 0001 014.8Pessoa F P A,M ohamed R S.A salvat

26、ion basedt herm odynamic model for aqueou s two phase syst em sJ.Braz.JChem Eng,2001,18(4:449458.9 徐長(zhǎng)波,王巍杰. 雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展J. 化工科技, 2009,17(2:7579.10Pan I H,Y ao H J,Li Y K.Eff ect ive exract ion and purif icat ion of xylosidase f rom t ri chod erma koni ng ii f erm ent ati oncult ure by aqueous t w o p

27、hase part it ioningJ.E nzyme an d M icrobial Techn ol ogy.2001,(28:196201.11M aria.Improved pu rificat ion prot ocol of a f u sar iu m solanipi sirecombinant cut inase by phase part it ionning in aqueoust w o phase syst ems of poly et hylene glycol and phosp hat eJ.Enzyme and M icrob ial Techn ol og

28、y,1996,(18:251260.12M irjan a G A.Part iti on ing of pect inase produced by Poiyporu s squamosus in aqueou s t w o Phase sy st em polyet hyl eegl ycol 4000/crude dex t ran at dif f erent init ial pH valu lesJ.Carb ohydrat e Polymers,2004,(56:295300.13Wu Y T,Pereira M,V enancio A.S eparat ion of endo polyglact uroll as e u sing aqu eous t w o phase part it ioningJ.J ounral of Chromat ogra PH y A,2001,(929:2329.14馮菁,夏杰,等.人溶菌酶的雙水相萃取法分離J.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版,2006,32(12:1 4091 412.15黃瑛,尹利,閆云君.雙水相萃取法分離純化洋蔥假單細(xì)胞菌G63脂肪酸J.現(xiàn)代化工,2007,27(2:30