細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講義（課堂PPT）

1、1常勝凱 藥理室2l一、細(xì)菌內(nèi)毒素l二、熱原3l細(xì)菌內(nèi)毒素是一種革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物，當(dāng)其死亡或菌體裂解時(shí)釋放出的一類具有多種生物活性的毒性物質(zhì)4l（1）.致熱性：內(nèi)毒素作用人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)源性熱原，刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)。l（2）.耐熱性：需250度干熱30分鐘才能徹底滅活。l（3）.分子極性：多糖鏈親水，脂肪鏈?zhǔn)杷谒谐什痪鶆蚍植?。l（4）.鱟反應(yīng)：能與鱟試劑發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng)，形成凝膠。5熱原是指臨床上引起哺乳動(dòng)物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì) 細(xì)胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）l內(nèi)源性熱原 產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的物質(zhì) 內(nèi)毒素?zé)嵩瓋?nèi)毒素?zé)嵩璴外源性熱原 非

2、內(nèi)毒素?zé)嵩ú《?、?xì)菌、真 菌、抗體-抗原復(fù)合物、細(xì)胞分裂素）6l熱原是否就是內(nèi)毒素？l在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)議，熱原不僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說(shuō)無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。7l鱟(horseshoe crab)是一類與三葉蟲(chóng) (現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動(dòng)物。鱟的祖先出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時(shí)期古生代的泥盆紀(jì)，當(dāng)時(shí)恐龍尚未崛起，原始魚(yú)類剛剛問(wèn)世，隨著時(shí)間的推移，與它同時(shí)代的動(dòng)物或者進(jìn)化、或者滅絕，而惟獨(dú)只有鱟從4 億多年前問(wèn)世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鱟有“活化石”之稱。又具有很高的藥用價(jià)值。8鱟9l鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。鱟血液顏色

3、呈藍(lán)色，是因?yàn)轺c血漿的主要成分是血藍(lán)蛋白。這種藍(lán)色血液的提取物“鱟試劑”。鱟試劑是由海洋生物鱟的血液提取物制成的“鱟試劑”，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)人體是否因細(xì)菌感染而致病；鱟試劑在制藥行業(yè)中，用于檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素。目前使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟鱟試劑兩大類。10l整體結(jié)構(gòu)整體結(jié)構(gòu)l1. 綜述部分綜述部分檢查法的描述試驗(yàn)的準(zhǔn)備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）l2. 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分凝膠法 光度測(cè)定法a 鱟試劑靈敏度復(fù)核 a 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)b 干擾實(shí)驗(yàn) b 干擾實(shí)驗(yàn)c 檢查法：限量試驗(yàn) c 檢查法 半定量試驗(yàn)111. 檢查法的描述2. 試驗(yàn)的準(zhǔn)備3. 限值（L）的確定4.

4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）12l本法是利用鱟試劑與 細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的機(jī)理，以判斷供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素限度是否符合規(guī)定的一種方法。13l細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括： 限量實(shí)驗(yàn) 凝膠法 半定量實(shí)驗(yàn)l可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)?？墒褂闷渲腥魏我环N方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。 濁度法 動(dòng)態(tài)濁度法光度測(cè)定法 終點(diǎn)濁度法 顯色基質(zhì)法 動(dòng)態(tài)顯色法 終點(diǎn)顯色法 14實(shí)驗(yàn)所需物品l細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)l細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 l凝膠法鱟試劑l漩渦混合器l適宜的恒溫器 37 1l電熱干燥箱 250 l實(shí)驗(yàn)器械等15la 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品 以內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價(jià)

5、。系自大腸埃系菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。 150600-200707 10000EU/支lb 工作標(biāo)準(zhǔn)品工作標(biāo)準(zhǔn)品 以內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價(jià)。用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照。 150601-200968 150EU/支 150601-201072 120EU/支16l用于復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等la 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水lb 光度測(cè)定法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml171819202122試驗(yàn)器械試驗(yàn)器械

6、l移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無(wú)熱原吸頭）、凝集管（1075mm）、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計(jì)時(shí)器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。23l試驗(yàn)器械的要求試驗(yàn)器械的要求試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250 干 烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物是污染。24l供試品溶液的制備供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在值在6.08.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸

7、、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。25藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定： LKMK為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kgh)表示，注射劑K= 5EU/(kgh)，放射性藥品注射劑K= 2.5EU/(kgh)，鞘內(nèi)用注射劑K= 0.2EU/(kgh)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kgh)、 mg/(kgh)或U/(kgh)表示，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按1.62計(jì)算。注

8、射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說(shuō)明理由。26l限值計(jì)算時(shí)做必要調(diào)整的幾種情況限值計(jì)算時(shí)做必要調(diào)整的幾種情況從嚴(yán)原則聯(lián)合用藥特殊情況等27l最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。MVDcLl L：供試品的內(nèi)毒素限值l c：供試品溶液的濃度l ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)， 或在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最 低的內(nèi)毒素濃度(如標(biāo)準(zhǔn)曲線為50、5、 0.5EU/ml三

9、個(gè)濃度組成) 28l計(jì)算舉例計(jì)算舉例la 當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則濃度C的單位為1.0ml/ml 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng) 小于xx EU/ml。l l例例：替硝唑注射液，計(jì)算限值為0.5EU/ml，使用l 靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，則：MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.125EU/ml4倍 29l計(jì)算舉例計(jì)算舉例lb 當(dāng)L以EU/mg表示時(shí)，則C的單位為mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/mg或EU/U。l例例：注射用阿莫西林鈉l計(jì)算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟

10、試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。l需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。l如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD20mg/ml0.15EU/mg0.25EU/ml12倍30l如果供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD 取1，計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L ；l適用于供試品為固體的情況。計(jì)算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。l 例例：注射用阿莫西林鈉l計(jì)算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。l最小有效稀釋濃

11、度lc 0.125 EU/ml0.15EU/mg0.833mg/ml 31凝膠法凝膠法光度測(cè)定法光度測(cè)定法a 鱟試劑靈敏度復(fù)核a 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)b 干擾實(shí)驗(yàn)b 干擾實(shí)驗(yàn)c 檢查法：限量試驗(yàn)c 檢查法 半定量試驗(yàn)32l目的目的 考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確 考察檢驗(yàn)人員操作方法是否正確 實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定l何時(shí)進(jìn)行何時(shí)進(jìn)行 使用新批號(hào)的鱟試劑 試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí) 33l取細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。l然后進(jìn)行稀釋，制備成4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,即2.0、1.0、0.

12、5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。34內(nèi)毒素濃度20.50.25陰性對(duì)照鱟試劑平行管35l放入371的恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘l將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性；l保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。 36l堅(jiān)實(shí)凝膠l陽(yáng)性“+”37l未形成凝膠 凝膠不堅(jiān)實(shí) l陰性“”38l結(jié)果判斷結(jié)果判斷：若最大濃度2管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對(duì)照管陰性，試驗(yàn)方有效。l結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算：反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟

13、試劑靈敏度的測(cè)定值 c=lg-1(X/4) 式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。（反應(yīng)終點(diǎn)濃度反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。） 39內(nèi)毒素濃度20.50.25陰性對(duì)照終點(diǎn)鱟試劑平行管0.50.5c=lg-1(lg+lg+lg0.5+lg0.5)/4=0.70740l當(dāng)c在0.52（包括0.5和2）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。實(shí)驗(yàn)時(shí)，以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。41l目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。42l當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法

14、時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。（注：須三個(gè)批號(hào)以上的供試品，兩個(gè)以上鱟試劑廠家的試劑）l當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。如：內(nèi)毒素檢查時(shí)，供試品陽(yáng)性對(duì)照為陰性時(shí)。43l預(yù)試驗(yàn)l正式干擾試驗(yàn)44l目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)；l優(yōu)點(diǎn)：減少摸索過(guò)程、節(jié)省成本。45l操作步驟操作步驟：l將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋；l使用鱟試劑對(duì)每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和4支供試品陽(yáng)性對(duì)照（即含2.0和

15、0.25濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）；l另做2支陰性對(duì)照和2支陽(yáng)性對(duì)照。 46l預(yù)試驗(yàn)結(jié)果判斷：預(yù)試驗(yàn)結(jié)果判斷：l當(dāng)陰性對(duì)照為陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，實(shí)驗(yàn)為有效；l當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照2管為陽(yáng)性時(shí)，供試品陽(yáng)性對(duì)照0.25管均為陰性時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。l即可選擇該稀釋倍數(shù)和相鄰濃度進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。 47l目的：檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。l通過(guò)比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來(lái)確定供試品在該濃度下是否對(duì)內(nèi)毒素檢查有干擾。48正式干擾試

16、驗(yàn)正式干擾試驗(yàn)l操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液l操作： 內(nèi)毒素檢查用水 同一支內(nèi)毒素 標(biāo)準(zhǔn)品 供試品溶液l同時(shí)制備2支供試品陰性對(duì)照供試品陰性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。含2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液含2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的供試品溶液 49編 號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無(wú)/檢查用水2A：供試品溶液 B：供試品陽(yáng)性對(duì)照 C：陽(yáng)性對(duì)照 D：陰性對(duì)照50l當(dāng)

17、供試品陰性對(duì)照當(dāng)供試品陰性對(duì)照A和陰性對(duì)照和陰性對(duì)照D都為陰性，并且都為陰性，并且系列溶液系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。方為有效。l分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）； ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4)l當(dāng)ES在0.52(包括0.5和2)及Et在0.5ES 2 ES（包括0.5 ES和2 ES）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。 51內(nèi)毒素濃度2.00.50.25終點(diǎn)終點(diǎn)內(nèi)毒素/檢查用水（系列溶液C）

18、陰性對(duì)照（溶液D）內(nèi)毒素/供試品溶液（系列溶液B）2.02.0供試品陰性對(duì)照（溶液A） ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4)1.4152l當(dāng)存在干擾時(shí)，可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或有關(guān)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。導(dǎo)致干擾的因素：排除干擾的方法：pH值稀釋抗凝因子中和螯合劑過(guò)濾葡聚糖加熱53l由于干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無(wú)關(guān)，因此在干擾實(shí)驗(yàn)中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。l建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對(duì)干擾實(shí)驗(yàn)造成

19、的陽(yáng)性影響。54l凝膠限度試驗(yàn)?zāi)z限度試驗(yàn)l凝膠半定量試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)55l檢驗(yàn)供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限度的定性方法。編 號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A供試品溶液無(wú)/供試品溶液2B供試品陽(yáng)性對(duì)照2/供試品溶液2C陽(yáng)性對(duì)照2/檢查用水2D陰性對(duì)照無(wú)/檢查用水2當(dāng)陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效56例例：替硝唑注射液，計(jì)算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算： MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.25EU/ml2倍l供試品溶液：2倍替硝唑稀釋液l供試品陽(yáng)性對(duì)

20、照為：含0.25EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的2倍替硝唑稀釋液l陽(yáng)性對(duì)照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液57供試品溶液供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 試驗(yàn)有效試驗(yàn)有效58供試品溶液供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定供試品溶液供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合規(guī)定59供試品溶液供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 須復(fù)試復(fù)試時(shí)，供

21、試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽(yáng)性，即可判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 60l半定量試驗(yàn)是使用凝膠法估測(cè)估測(cè)供試品中內(nèi)毒素含量的方法，系通過(guò)反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。l原理：通過(guò)供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點(diǎn)濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。61l操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開(kāi)始進(jìn)行對(duì)倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過(guò)所使用鱟試劑的MVD。62編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶

22、劑稀釋用液 稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液檢查用水12224282B2/供試品溶液22C2/檢查用水檢查用水12221240.5280.252D無(wú)/檢查用水2A：沒(méi)有超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的供試品系列稀釋液；B：供試品陽(yáng)性對(duì)照（為確證不存在干擾作用）；C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列（為確證本試驗(yàn)的操作和環(huán)境都符合規(guī)定）；D：陰性對(duì)照。63l當(dāng)陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性；l供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性；l系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.52之間，則試驗(yàn)有效。l若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。l若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符合規(guī)定。64

23、內(nèi)毒素濃度2.00.50.25終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C0.5稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A42供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B 陰性對(duì)照溶液D CElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.8365l例例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為0.5EU/ml； 通過(guò)使用3個(gè)鱟試劑廠家的鱟試劑對(duì)3個(gè)不同廠家的7個(gè)樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)證實(shí)：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查； 使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對(duì)一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進(jìn)行凝膠半定量試驗(yàn)。MVD0.5EU/ml0.03EU/ml16.67倍 從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進(jìn)行1、2、4、8倍稀釋(相當(dāng)于將供試品原液進(jìn)行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒(méi)有超MVD)。 66內(nèi)毒素濃度0.060.030.0150.0075終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C0.0150.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A40.0320.03供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B 陰性對(duì)照溶液D CElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.830.0849EU/ml67l如果檢驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。 由于檢驗(yàn)時(shí)采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)2倍稀釋液，因此