高效液相色譜操作規(guī)范

1、高效液相色譜一. 簡(jiǎn)介l 儀器型號(hào)：Agilent 1200 HPLC高效液相色譜l 儀器廠商：美國(guó)安捷倫  公司l 儀器性能： 流速范圍：0.0015.0mL/min, 0.001mL/min步進(jìn)；壓力范圍： 0-40 MPa (0-400 bar, 0-5880psi)；梯度組成精密度：<0.15% SD （1mL/min）。l 可測(cè)項(xiàng)目：可用于痕量分析，其檢測(cè)限為ppbppm級(jí)。l 樣品要求：樣品一般需預(yù)處理。二、實(shí)驗(yàn)原理分配色譜原理：主要基于樣品分子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同（

2、分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。C18柱-反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。熒光檢測(cè)器（FLD） Agilent 1200 HPLC液相色譜儀的工作過(guò)程：輸液泵將流動(dòng)相（經(jīng)過(guò)在線過(guò)濾器）以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在進(jìn)入色譜柱之前通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入，流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)不同而被分離，并依次隨流動(dòng)相流至檢測(cè)器，

3、檢測(cè)到的信號(hào)送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)記錄、處理或保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟 開(kāi) 機(jī)1) 將待測(cè)樣品按要求前處理，準(zhǔn)備HPLC所需流動(dòng)相，檢查線路是否連接完好，廢液瓶是否夠用等。2) 開(kāi)機(jī)。打開(kāi)電腦、HPLC各組件電源、打開(kāi)軟件。3) 配置儀器 （配置1200系統(tǒng)模塊，根據(jù)需要配置）儀器自動(dòng)配置。4) 打開(kāi)工作界面，按操作要求趕流動(dòng)相氣泡。（排氣：擰松泵閥（放置流動(dòng)相的底下模塊中黑色的旋鈕，逆時(shí)針擰松），在“四元泵”模塊內(nèi)右擊，點(diǎn)擊“方法”選項(xiàng)，進(jìn)入泵編輯畫(huà)面，設(shè)流速：3-5ml/min，點(diǎn)擊“OK”。 點(diǎn)擊“ 四元泵 ”圖標(biāo)內(nèi)綠色圓圈，則系統(tǒng)開(kāi)始走流動(dòng)相，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無(wú)氣泡為止，切換通道（A-B

4、-C）繼續(xù)Purge，直到所有要用通道無(wú)氣泡為止。點(diǎn)擊“ 四元泵 ”圖標(biāo)內(nèi)紅色圓圈，關(guān)泵。 排完氣泡后，記得把四元泵的泵閥擰緊。（放置流動(dòng)相的底下模塊中黑色的旋鈕，順時(shí)針擰緊）5) 調(diào)整瓶填充：點(diǎn)擊（左擊）四元泵模塊中，四個(gè)綠色瓶子中的任何一個(gè)。根據(jù)自己配置流動(dòng)相的量改。裝色譜柱1) 如果別人的色譜柱未卸下，要小心卸下，把兩端用白色的螺帽旋緊。2) 先把四元泵打開(kāi)，要液體從連接色譜柱前端的線路中流出后，再接色譜柱。連接時(shí)要確認(rèn)色譜柱上流動(dòng)相水流方向，切勿接反。如果有保護(hù)柱，應(yīng)該分段連接。兩端接上后，先打開(kāi)泵小流速過(guò)柱0.5ml/min。在不漏的前提下，逐漸升高流速，直至你分析時(shí)需要的流速。3)

5、 色譜柱上卸下來(lái)的白色螺帽放置在柱溫箱上面一格內(nèi)。編輯方法及樣品分析4) 方法信息：從“方法”菜單中選擇“編輯完整方法” 點(diǎn)擊“Ok”，進(jìn)入下一畫(huà)面。點(diǎn)擊“Ok” 進(jìn)入下一畫(huà)面。5) 自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定:選擇合適的進(jìn)樣方式, “標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣”-只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無(wú)洗針功能?！扒逑春筮M(jìn)樣”-可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會(huì)在洗瓶中洗針。“進(jìn)樣程序”-可以點(diǎn)擊“編輯 ”鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。點(diǎn)擊“Ok”進(jìn)入下一畫(huà)面。6) 泵參數(shù)設(shè)定：（以四元泵為例）在“流速”處輸入流量,如1.5ml/min ， 在“Solvent B”處輸入70,(A=100-B-C-D) ,也可添加”

6、時(shí)間表”，編輯梯度。在“設(shè)置最高壓力”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。點(diǎn)擊“Ok”進(jìn)入下一畫(huà)面。注意點(diǎn)：如下圖所示，如果保持前1.9min是百分之百的D相，需要如下兩行設(shè)置。7) 柱溫箱參數(shù)設(shè)定:在”溫度”下面的空白方框內(nèi)輸入所需溫度,并選中它。8) DAD檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定：檢測(cè)波長(zhǎng)：一般選擇最大吸收處的波長(zhǎng)。樣品帶寬BW： 一般選擇最大吸收值一半處的整個(gè)寬度。參比波長(zhǎng)：一般選擇在靠近樣品信號(hào)的無(wú)吸收或低吸收區(qū)域 。參比帶寬BW：至少要與樣品信號(hào)的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。Peak width（Response time）：其值盡可能接近要測(cè)的窄峰峰寬。Slit-狹縫窄，光

7、譜分辨率高；寬時(shí)，噪音低。同時(shí)可以輸入采集光譜方式，步長(zhǎng)，范圍，閾值。選中所用的燈。9) FLD檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定: 激發(fā) A: 激發(fā)波長(zhǎng):200-700nm,步長(zhǎng)為1nm,或Zero Order。發(fā)射: 發(fā)射波長(zhǎng): 280-900nm, 步長(zhǎng)為1nm。鍵入你所需要的激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)。如果需要在分析時(shí)間內(nèi)改變波長(zhǎng)的，需要添加一個(gè)時(shí)間表進(jìn)行波長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。序列的編輯10) 序列參數(shù)信息：從“序列”菜單中選擇“序列參數(shù)” 保存路徑，子目錄改為自己的文件夾；關(guān)機(jī)菜單處，選中后序列命令/宏，下拉菜單中選擇STANDBY。11) 序列表的編輯：從“序列”菜單中選擇“序列”，建立自己的序列表，整個(gè)序列表一般包括測(cè)試前洗柱子，走基線，測(cè)試樣品，測(cè)試后洗柱子幾個(gè)部分。12) 通過(guò)追加行和插入增添列表個(gè)數(shù)。進(jìn)樣次數(shù)/瓶 1；樣品瓶按放置樣品次序。試前洗柱子，測(cè)試后洗柱子樣品瓶不用填寫(xiě)。進(jìn)樣次數(shù)填寫(xiě)“1”。13) 序列表建立完成后，點(diǎn)擊運(yùn)行序列，運(yùn)行該序列，等儀器顯示ready，樣品自行進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)分析1) 從“視圖”菜單中，點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)分析”進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫(huà)面。2) 從“文件”菜單選擇“調(diào)用信號(hào)”， 選中您的數(shù)據(jù)文件名， 則數(shù)據(jù)被調(diào)出。3) 如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。關(guān)機(jī)1) 退出化學(xué)工作站，依提示關(guān)泵，及其它窗口，關(guān)閉計(jì)算機(jī)。2) 關(guān)閉Agilent 1200各模塊