綠色熒光蛋白高表達動物模型的建立及在活體成像中的應(yīng)用

1、綠色熒光蛋白高表達動物模型的建立及在活體成像中的應(yīng)用*        【摘要】     目的 建立綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因標記的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤裸鼠模型，利用自行研制的熒光分子成像儀實時地觀察腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成及藥物療效的觀察。方法 （1）體外擴增穩(wěn)定表達GFP的LLC腫瘤細胞，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光表達情況；（2）LLC-GFP細胞以濃

2、度為2×106/ml接種裸鼠背部，以建立LLC裸鼠移植瘤模型；（3）分別在接種瘤細胞2周后，每隔3天對裸鼠進行活體成像1次，觀察腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及局部血管生成情況，同時給予環(huán)磷酰胺（CTX）10 mg/kg治療并測定抑瘤率。結(jié)果 （1）培養(yǎng)24 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察，可見幾乎所有LLC-GFP細胞發(fā)出明亮的綠色熒光；（2）LLC裸鼠移植瘤模型建立后，用波長470 nm的藍光激發(fā)，通過熒光活體成像儀觀察可見腫瘤發(fā)出綠色熒光；（3）活體成像可見腫瘤的生長呈進行性動態(tài)變化，4周后可見胸腹腔等廣泛轉(zhuǎn)移，同時觀察到腫瘤的血管生成和發(fā)展情況，環(huán)磷酰胺組腫瘤大小明顯小于陰性對照組（P<

3、0.05）。結(jié)論 熒光分子成像的方法可以對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管生成及藥物療效判定等方面進行無創(chuàng)、實時地連續(xù)監(jiān)測，為研究腫瘤提供了新的思路和方法。     【關(guān)鍵詞】  綠色熒光蛋白 分子影像 Lewis肺癌          Development of GFP high-expressing animal model and its application to molecular imaging in vivo    L

4、I Qun,SHEN Bao-zhong,DU Jie.Department of Radiology,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China    Abstract  Objective  To develop nude mice model of Lewis lung carcinoma （LLC） expressing green fluorescent protein （GFP） and observe the tumor progression,further m

5、etastasis,angiogenesis and the effect of CTX on tumors in a noninvasive,alive,real-time and sequent way with small animal fluorescent imaging system made by ourselves.Methods  （1）LLC cells stably expressing GFP in vitro were cultured and observed with fluorescent inversion microscope.（2）LLC- GF

6、P cells were harvested and injected subcutaneously on the back of the nude mice at 2×106 cells/ml till transplanted tumors developed.（3）Fluorescence imaging system was used to image mice alive two weeks later and every three days to observe the progression,further metastasis,angiogenesis of loc

7、al tumors and tumor-inhibiting effect of CTX （10 mg/kg）.Results  （1）After cultured for 24h,almost all the LLC- GFP cells emitted bright green fluorescence.（2）Two weeks later observed by fluorescent imaging system,LLC transplanted tumors emitted green fluorescence when activated by 470nm blue li

8、ght.（3） In vivo imaging it suggested that tumors gradually grew up in volume,and there was extensive metastasis four weeks later.The angiogenesis and development of transplanted tumor could be seen,and the average size of tumors in CTX treatment group was smaller than that in control group （P<0.0

9、5）.Also,it could be seen that most tumors emitted green fluorescence which increased with tumor growth without fluorescence attenuation.Conclusion  Fluorescent molecular imaging technique can stably and conveniently monitor tumor growth,metastasis,angiogenesis and treatment effect evaluation of

10、 anticancer drugs in vivo in a real-time and noninvasive way,which provides a new idea and method and plays an important role in tumor research.    Key words  green fluorescent protein;molecular imaging；Lewis lung carcinoma    簡便、直觀地獲得腫瘤在活體上早期的細胞和分子生物學水平的信息，并對腫瘤治療早

11、期療效進行判斷，一直是腫瘤研究的目標之一，也是當今國際腫瘤研究的熱點和難點。在分子影像學成為一個學科以前，沒有任何的手段能克服這一難題。    分子影像學是將分子生物學與影像學相結(jié)合，用細微影像設(shè)備對活體動物的生理及病理過程，從細胞和分子水平上進行影像學的描述和測定。這一成像過程主要依靠分子影像探針的介導(dǎo)，使其標記的靶細胞或與之共同表達的目的基因成像。分子成像技術(shù)分為光學分子成像、MR分子成像、核素分子成像。其中，光學分子成像具有一定的優(yōu)勢，其技術(shù)相對穩(wěn)定，可應(yīng)用不同影像探針發(fā)出不同波長的熒光來研究不同基因的同時表達，與MR分子成像、核素分子成像相比，所用設(shè)備造價

12、不高，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因是光學分子成像最常用的報告基因，利用它標記Lewis肺癌移植瘤國際尚未見有報道，本研究建立荷GFP基因標記的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤裸鼠模型，應(yīng)用自行研制的熒光成像儀進行活體成像，以無創(chuàng)、實時和動態(tài)地觀察研究腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成及治療效果，以此為國內(nèi)分子影像學研究做初步的探索。    1  材料與方法    1.1  實驗材料  活體熒光

13、成像儀（Macroillumination imaging system and tunable lighting system）為自行研發(fā)；OLYMPUS XT70型熒光倒置顯微鏡，購自日本OLYMPUS公司；BC110型電子天平，購自德國賽多利絲股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，購自Gibco公司，批號20030810；胰酶，購自Sigma公司，批號20031110；胎牛血清，購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所，批號20030609。其他均為國產(chǎn)試劑純。    1.2  動物模型的建立    1.2.1  細

14、胞培養(yǎng)  小鼠Lewis肺癌（Lewis lung cancer,LLC）和穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白（GFP）的LLC細胞系（LLC-GFP），均由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤研究所凍存。常規(guī)方法使細胞復(fù)蘇后，將細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液（RPMI-1640加入10小牛血清、青霉素100 u/ml、鏈霉素100 u/ml），置于37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞為半懸浮生長，待覆蓋率為80%左右，消化、傳代。傳代培養(yǎng)24 h后細胞進入對數(shù)生長期，將細胞培養(yǎng)瓶置于熒光倒置顯微鏡下，用470 nm藍光照射培養(yǎng)瓶進行激發(fā)，于高倍鏡下觀察細胞的熒光表達情況，待所有細胞均發(fā)出

15、明亮的綠色熒光時即可用于接種于裸鼠。    1.2.2  移植瘤模型的建立  24周雄性裸鼠10只，體重1820 g，購自上海實驗動物中心。將對數(shù)生長期的LLC-GFP細胞消化、收集，用細胞計數(shù)板計數(shù)，制成2×106/ml的單細胞懸液，按照0.2 ml/只皮下接種于裸鼠背部。取LLC細胞，以同樣方法接種于2只雄性裸鼠，作為模型成像的對照。    1.3  活體成像    1.3.1  腫瘤生長動態(tài)成像  腫瘤細胞接種于裸鼠后，于第7天、18天、2

16、9天和40天，分別應(yīng)用自行研發(fā)的GFP光學活體成像儀對裸鼠進行活體成像：用50 W汞燈作為光源，光線聚焦后，經(jīng)470 nm/40帶通濾色片，形成亮度可調(diào)的高亮度藍色激發(fā)光，經(jīng)光導(dǎo)纖維傳輸形成線形光束。將模型鼠置于黑色背景載物臺上，高亮度藍色激發(fā)光照射裸鼠全身，聚焦于瘤體上，通過515 nm/20帶通的濾色片觀察到峰值為508 nm的綠色光。通過CCD數(shù)碼相機采集圖像，經(jīng)Microfire圖像處理軟件處理成像，圖像分辨率為1600 dpi×1200 dpi。    1.3.2  腫瘤轉(zhuǎn)移的成像  裸鼠移植瘤模型隨機選取2只，于第40天最

17、后一次成像后，斷髓處死。置于黑色背景載物臺上，打開470 nm高亮度藍色激發(fā)光源，透過515 nm/20帶通的濾色片觀察，剖開胸腹腔，然后用熒光成像儀采集圖像，觀察腫瘤在裸鼠全身、各臟器和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況。    1.3.3  腫瘤血管生成的成像  將對數(shù)生長期的LLC-GFP細胞，制成濃度為2×106/ml的單細胞懸液，按照0.2 ml/只皮下接種于血管較少的足背部。待接種后34周，腫瘤生長至1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm時，熒光成像儀觀察腫瘤血管生成情況。    1.3.

18、4  活體成像對CTX抑瘤率的評價  將裸鼠隨機分為三組，即空白對照組、模型組和環(huán)磷酰胺（CTX）組。接種LLC-GFP細胞兩周后，每日腫瘤局部注射給藥治療，其中CTX為10   mg/kg，模型組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水，空白對照組不予任何處置。給藥2周內(nèi)，每隔3天將各組動物麻醉，用熒光成像儀進行活體成像1次，觀察和記錄腫瘤生長情況，并評價CTX的抑瘤效果。    2  結(jié)果    2.1  培養(yǎng)細胞的熒光表達  對數(shù)生長期的LLC-GFP細胞置于熒光倒置顯微鏡下觀

19、察可見約有90%以上的細胞在470 nm藍光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光（圖1）。    2.2  移植瘤模型的建立  細胞接種后2周，裸鼠背部均長出平均大小約為1.2 cm×1.2 cm×1.0 cm的瘤塊，可見動物活動度略有減少，食欲不振。用熒光成像系統(tǒng)進行活體成像，激發(fā)光波長（470±20）nm，曝光時間343 ms，增益11。可見接種了LLC-GFP細胞的裸鼠背部腫瘤發(fā)出明亮的綠色熒光（圖2a），且熒光強度不隨照射時間的延長而減弱；而接種了LLC細胞的裸鼠活體成像未見有綠色熒光（圖2b）。  &#

20、160; 2.3  腫瘤生長動態(tài)成像  在腫瘤細胞接種后第7天、18天、29天和40天，分別應(yīng)用熒光成像儀對裸鼠進行活體成像?？梢娊臃N后1周開始小鼠背部均可見綠色熒光團塊，隨著生長時間的延長，發(fā)出綠色熒光的區(qū)域（即腫瘤部位）逐漸增大，經(jīng)測量瘤從0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm逐漸增至2.0 cm×2.1 cm×1.5 cm，且熒光強度無衰減（圖3）。至25天時腫瘤表面出現(xiàn)肉眼可見的干酪樣壞死（圖3c），壞死處不發(fā)出熒光，但周圍瘤組織仍可見明亮的綠色熒光。    2.4  腫瘤轉(zhuǎn)移的成像&

21、#160; 在腫瘤細胞接種后40天，將模型鼠胸腹腔剖開，分別應(yīng)用熒光成像儀進行成像，可見肺、胃、肝、膀胱、大網(wǎng)膜及腸系膜淋巴結(jié)和左上肢肌肉均有綠色熒光表達（圖4）。    2.5  腫瘤血管生成的成像  在腫瘤細胞接種后40天起，應(yīng)用熒光成像儀對足背部的腫瘤進行成像，可見綠色熒光背景上清晰的血管網(wǎng)分布（圖5a），小血管和毛細血管管腔擴張、彎曲（圖5b），血管密度隨時間增長及腫瘤增大而增加。    2.6  抑瘤率的評價  給藥40天后，可見CTX組腫瘤生長緩慢，瘤體積顯著小于模型組（圖6），其腫

22、瘤生長曲線與正常對照組的趨勢相一致（圖7）。    圖7  腫瘤細胞生長曲線    3  討論    1999年9月，Weissleder正式提出分子影像學的概念1，2。國際上，以哈佛大學為首的一些著名大學和研究機構(gòu)都相繼成立了分子影像研究中心，日本及歐洲很多國家也都積極投入了這一生命科學新領(lǐng)域的研究。    綠色熒光蛋白（green fluorecsent protein,GFP）基因是目前在光學分子成像中應(yīng)用較多的一種報告基因3，4。其最明顯優(yōu)勢是無需

23、底物或輔因子參與，無論在活細胞還是在完整的轉(zhuǎn)基因胚胎和動物中，都能有效地監(jiān)測基因轉(zhuǎn)移的效率。在激發(fā)光下，可自發(fā)地發(fā)射內(nèi)部熒光，易于觀察，因此適合作為報告基因來研究基因的表達、調(diào)控、細胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運等。近年來，GFP開始應(yīng)用在腫瘤的分子成像研究方面，由于GFP能在活細胞中直觀地觀察到外源基因的表達，較快篩選基因修飾的細胞，又不需外源物質(zhì)參與和對細胞無毒性5，因此本研究把GFP作為標記基因。    本實驗應(yīng)用穩(wěn)定整合GFP基因的小鼠Lewis肺癌細胞（LLC-GFP），建立了GFP高表達的裸鼠LLC移植瘤模型。體外培養(yǎng)LLC-GFP肺癌細胞，當大部

24、分細胞進入對數(shù)生長期后，細胞中GFP開始大量表達，熒光倒置顯微鏡下可見90%以上的細胞均發(fā)出綠色熒光。一般來說，建立腫瘤動物模型時，直到肉眼可見的或可觸及包塊穩(wěn)定存在兩周左右，才說明模型成功建立。但本實驗將對數(shù)生長期LLC-GFP細胞接種于裸鼠背部皮下，1周后用藍光激發(fā)后即可見接種部位發(fā)出綠色熒光。而且，隨著時間的延長，腫瘤逐漸長大，幾乎全部腫瘤都發(fā)出綠色熒光，且熒光強度不衰減。這說明所建立的模型穩(wěn)定，完全適合用于熒光活體成像，其所見熒光部分基本可代表腫瘤區(qū)域。    傳統(tǒng)的影像技術(shù)由于儀器的分辨率較低等問題，而對腫瘤的早期階段很難進行明確的診斷6。本實驗中，在腫

25、瘤細胞接種后1周，應(yīng)用熒光活體成像儀即可檢測到腫瘤的存在，為臨床腫瘤的早期診斷提供了一種極具前景的診斷方法。此外，還應(yīng)用熒光活體成像儀對腫瘤的動態(tài)生長情況進行了監(jiān)測，無需其他成像手段或儀器的輔助，在活體上實時、連續(xù)、無創(chuàng)地觀察腫瘤的生長，這種分子影像學技術(shù)的應(yīng)用在國內(nèi)尚屬首例，為臨床上腫瘤進展的監(jiān)測提供了一種簡便、實用的新方法。    對于腫瘤的各器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢出，以往只有在術(shù)中取材，進行病理學檢查才能夠確定7。而分子影像學提出應(yīng)用報告基因的標記或報告探針即可解決這一難題，即通過報告基因或探針的成像，間接地反映出腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移情況。本實驗是以GFP為報告基因

26、，但由于GFP蛋白所發(fā)出的綠色熒光穿透力差，無法透過較厚組織8，必須解剖暴露后成像才能觀察到腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。因此尚需要進一步的研究，提高儀器的分辨率或應(yīng)用發(fā)光強度更高的成像基因或熒光標記物質(zhì)，才有望解決這一問題。    當前，關(guān)于腫瘤血管生成機制及抗血管生成治療腫瘤研究已成為研究腫瘤的熱點9。腫瘤新生血管的形成是血管內(nèi)皮細胞腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)及微環(huán)境相互作用的結(jié)果10，11。如何獲得腫瘤微血管生長情況一直是一項棘手的工作，傳統(tǒng)的微血管密度計數(shù)法必須將動物處死、腫瘤組織切片作免疫組化12，而且應(yīng)用于標記血管內(nèi)皮細胞抗體如CD31、CD34、F等特異性不強，因而無法

27、直觀、活體、動態(tài)連續(xù)觀察腫瘤微血管生成情況。這就阻礙了我們對血管生成對腫瘤生長轉(zhuǎn)移作用的理解，也影響我們研究抑制腫瘤血管生成藥物的作用機制。本實驗選擇小鼠足背接種腫瘤細胞來觀察血管生成情況，是因為該處組織相對透明，幾乎無原宿主血管，表達GFP的腫瘤和其供血血管之間強烈的視覺反差，使此處的移植瘤內(nèi)血管在熒光活體成像儀下清晰可見13；而且，可以在這些血管內(nèi)研究腫瘤細胞的傳輸和增殖，還可以看到腫瘤細胞在血管內(nèi)寄留，后者是腫瘤在休眠期的表現(xiàn)14。    此外，應(yīng)用熒光活體成像還可以對抗腫瘤藥物的療效進行直觀的評價，而不需將動物處死進行腫瘤大小的測量。在環(huán)磷酰胺（CTX）治

28、療2周后通過活體熒光成像法和傳統(tǒng)的抑瘤率測定法，同時對CTX的療效進行評價，其結(jié)果基本一致。相比之下，活體熒光成像法無需將動物處死，可實時、連續(xù)地監(jiān)測療效，對于藥效學研究以及臨床藥物療效的判定具有極大的意義。    可以預(yù)見，分子影像研究今天的成果在未來510年內(nèi)，對生命科學的各個領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生直接影響。分子影像學的開展使人們在分子水平對疾病機制及其特征有了更好的理解，并可以對腫瘤進行早期篩查、轉(zhuǎn)移監(jiān)測、抗血管生成及抗癌藥物療效的評估等方面的研究。如能夠更好地應(yīng)用腫瘤的特異性參數(shù)，如惡變前分子變異、生長動力學、血管生長因子、癌細胞標志物或遺傳學改變，將會大大地提高其診

29、斷準確性和可靠性，并且提供比目前組織學檢查等更快的三維信息；如將分子影像和基因治療相結(jié)合，可在分子水平對治療效果進行監(jiān)控、評判，從本質(zhì)上理解疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，在接近分子水平更早和更直接地觀察治療效果，最終提高對疾病的早期診斷預(yù)防和治療。     【參考文獻】  1 Weissleder R,Mahmood U.Molecular imaging.Radiology，2001，219（2）:316-333.    2 Weissleder R.Molecular imaging:explori

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