氯喹對煙霧吸入傷大鼠肺細胞膜ATP酶活性和丙二醛含量的影響

1、    氯喹對煙霧吸入傷大鼠肺細胞膜ATP酶活性和丙二醛含量的影響*        摘要目的：探討氯喹對煙霧吸入傷大鼠肺細胞膜ATP酶活性及丙二醛含量的影響。方法：80只Wistar大鼠隨機分成正常對照組，煙霧吸入傷1，3，6，12和24h組以及氯喹治療6h和12h組；分別于各時相點活殺動物，取肺制備膜制劑，用生化比色法測定膜上Na+,K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，用比色法測定膜上丙二醛含量，并用定磷法測定膜總磷脂含量。結果：煙霧吸入傷后，肺細胞

2、膜3種ATP酶活性從傷后1h至傷后24h均明顯降低(P0.01),同時伴有膜丙二醛含量增加和膜總磷脂含量降低；氯喹治療6h組Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和總磷脂含量明顯高于吸入傷6h組，而丙二醛卻明顯低于吸入傷6h組(P0.05與P0.01)。結論：肺細胞膜磷脂分解、丙二醛含量增加和ATP酶活性降低可能是煙霧吸入傷發(fā)生發(fā)展的重要原因；氯喹部分改善ATP酶活性、降低丙二醛含量、穩(wěn)定細胞膜而對煙霧吸入傷具有防治作用。關鍵詞氯喹；三磷酸腺苷酶；磷脂；丙二醛；煙霧吸入傷Influences of chloroquine on the activities of adenosine t

3、riphosphatases and the content of malondiadehyde in pulmonary cellular membrane of rats with smoke inhalation injuryYang Tiande(Yang TD),Yang Zongcheng(Yang ZC),Luo Qizhi(Luo QZ),et al(Anesthesia Department of*全軍95指令性課題第95L043號 Xinqiao Hospital,Chongqing 400037)ABSTRACTOBJECTIVE：To explore the influ

4、ences of chloroquine on the activities of adenosinetriphosphatases(ATPases) and the content of malondialdehyde(MDA) on rats model of smoke inhalation injury.METHODS:Eighty wistar rats were randomly divided into normal control group,injurious groups at 1,3,6,12 and 24h following smoke inhalation,and

5、chloroquine treatment groups(chloroquine was purchased from Sigma,10mg/kg,immediatly injected intraperitoneally after smoke inhalation) at 6h and 12h following smoke inhalation.The rats were killed at each time site and the lungs were incised for preparing pulmonary cellular membrane,the activities

6、of Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase and Ca2+-ATPase were detected by biochemistry-chromatometric method,the content of MDA was assayed by chromatometric method and the content of total phosphatide of pulmonary cellular membrane was measured by quantified phosphorus.RESULTS:The activities of three kinds of

7、ATPases were declined significantly from 1 hour to 24 hours after smoke inhalation injury(P0.01),with increasing in the content of MDA and decreasing in the content of total phosphatide of pulmonary cellular membrane,but the activities of Na+,K+-ATPase and Ca2+-ATPase and the content of total phosph

8、atide were increased and the content of MDA was decreased in 6h group of chloroquine treatment while comparing with 6h group of smoke inhalation injury(P0.05).CONCLUSION:The decomposition of phosphatide,the increase in the content of MDA and the decreases in the activities of ATPases in pulmonary ce

9、llular membrane might be important factors of the occurrence and the development of smoke inhalation injury.Chloroquine might prevent and treat smoke inhalation injury for partially improving the activities of ATPases,decreasing the content of MDA of pulmonary cellular membrane and stabilizing pulmo

10、nary cellular membrane.KEY WORDSchloroquine,adenosinetriphosphatases,phosphatide,malondiadehyde,smoke inhalation injury煙霧吸入傷(Smoke inhalation injury)是當前燒傷病人死亡的重要原因之一，其發(fā)生機制尚未完全闡明。研究表明，磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)激活與花生四烯酸代謝產物釋放參與了煙霧吸入傷發(fā)生的病理生理過程1,2,但有關磷脂酶A2抑制劑對煙霧吸入傷的影響尚無文獻報道。本文在大鼠煙霧吸入傷模型上，觀察了非特異性磷脂酶A2抑

11、制劑氯喹(chloroquine,CQ)對受傷大鼠肺細胞膜ATP酶活性和丙二醛含量的影響。1材料與方法1.1動物分組與致傷:80只Wistar大鼠(體重180220g),不拘，隨機分成正常對照組，煙霧吸入傷1,3,6,12h和24h組以及氯喹(Sigma產品,10mg/kg體重，傷后立即腹腔注射，用前配成10mg/ml)治療6h和12h組。除治療組外，其余各組于相應時間腹腔注射生理鹽水1ml/kg體重。受傷組和治療組動物按王敦報告的方法致傷3:即預熱煙霧發(fā)生器使排煙管口溫度至70,放入發(fā)煙材料(100g木屑+30ml煤油)發(fā)煙5min，然后啟動呼吸機向發(fā)煙器吹入新鮮空氣，使致傷室內充滿煙霧(溫

12、度控制在3840),5min后，將大鼠放入致傷室，使吸入煙霧5min,然后取出大鼠，呼吸空氣,5min后再放入致傷室，共吸入煙霧3次，分別于各時相點活殺動物，取肺作各項指標測定。1.2指標測定：肺細胞膜制備，按文獻方法4，將新鮮肺組織用冰冷的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L,含10mmol/L MgCl2,pH7.4)洗去血污，剔出支氣管及其周圍結締組織，稱重后剪碎，按1100(W/V)比例加入上述緩沖液，在冰浴中用內切式組織勻漿器(5000r/min,15s×2次)勻漿，然后經4、400g×10min離心，取上清超速離心(40000g×15min,4),

13、用Tris-HCl緩沖液洗滌后再離心，沉淀用上述緩沖液重懸，按Lowry法作蛋白定量后備用。ATP酶活性測定：取適量膜制劑，按ATP酶試劑藥盒說明書(南京建成生物工程研究所)，用定磷法同時測定Na+,K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，其活性單位表示為mol Pi//h。膜丙二醛含量測定：取適量膜制劑，用硫代巴比妥酸法測定膜丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量5,以nmol/表示。細胞膜總磷脂(TP)測定：取一定量膜制劑，加入2倍容積的氯仿-甲醇(21,V/V)抽提液，加塞后強振1min,3000r/min×10min離心，

14、棄上層液，再加入下層液1/4容積的甲醇：蒸餾水(11,V/V)強振1min,同上離心，棄上層液及界面雜質，用氮氣吹干6,用ATP酶測試藥盒內定磷試劑，按李健齋的方法7測定細胞膜總磷脂含量，以g/mg.Pro表示。1.3統(tǒng)計處理：各組計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，用t檢驗比較各均數(shù)差異的顯著性。2結果煙霧吸入傷后，肺細胞膜三種ATP酶活性從傷后1h至傷后24h均明顯低于正常對照組(P0.01),氯喹治療動物傷后6h Na+,K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明顯高于吸入傷6h組(P0.05)，但仍明顯低于正常對照組P0.01)，而氯喹治療12h組與吸入傷12h組無明

15、顯差別(P0.05),但明顯低于正常對照組(P0.01)(見表1);傷后肺細胞膜總磷脂從傷后3h至24h均明顯低于正常對照組(P0.01)，而丙二醛從傷后1h至傷后24h均明顯高于正常對照組(P0.01或P0.05),氯喹治療6h組總磷脂和丙二醛含量分別高于或低于吸入傷6h組(P0.01或P0.05),氯喹治療12h組上述兩指標與吸入傷6h組無明顯差別(P0.05),但氯喹治療12h組丙二醛含量與正常對照組也無顯著差別(P0.05)(見表2)。表1氯喹對煙霧吸入傷大鼠肺細胞膜ATP酶活性的影響(n=10,±s,mPi/mg.Pro/h)組別Na+,K+-ATPaseMg2+-ATPa

16、seCa2+-ATPase正常對照組9.0±1.42.6±0.52.1±0.3吸入傷1h6.2±1.0*11.9±0.3*11.5±0.2*1吸入傷3h5.0±0.7*11.5±0.2*11.2±0.2*1吸入傷6h4.8±0.8*11.3±0.2*11.1±0.2*1吸入傷12h4.5±0.7*11.2±0.2*11.1±0.2*1吸入傷24h4.3±0.7*11.3±0.3*11.1±0.2*1氯喹(10mg/k

17、g)治療6h6.0±1.1*1，*21.5±0.3*11.4±0.4*1，*2氯喹(10mg/kg)治療12h4.6±0.6*11.3±0.3*11.1±0.2*1與正常對照組比較，*1P0.01；與吸入傷6h比較，*2P0.05表2氯喹對煙霧吸入傷大鼠肺細胞膜總磷脂與丙二醛含量的影響(n=10,±s)組別TP(g/mg.Pro)MDA(nmol/mg.Pro)正常對照組163.5±21.71.0±0.2吸入傷1h152.7±16.21.8±0.4*1吸入傷3h132.1±1

18、7.0*12.1±0.5*1吸入傷6h114.7±18.1*12.3±0.5*1吸入傷12h117.4±15.8*11.8±0.5*1吸入傷24h105.6±8.2*11.5±0.3*2氯喹(10mg/kg)治療6h142.8±14.1*1，*31.5±0.2*2，4*氯喹(10mg/kg)治療12h116.9±9.0*11.3±0.2與正常對照組比較，*1P0.01，*2P0.05；與吸入傷6h比較，*3P0.01，*4P0.053討論磷脂酶A2激活與花生四烯酸代謝產物釋放是煙霧吸入

19、傷后重要的病理生理變化之一1，2。研究表明，磷脂酶A2激活是多種原因引發(fā)急性肺損傷的重要中介8。磷脂酶A2激活的確切機制尚未完全闡明，可能與蛋白激酶C(PKC)活性增加、去甲腎上腺素釋放、緩激肽釋放、補體激活、活性氧自由基攻擊、中毒以及細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關9。煙霧吸入傷時，大量毒性氣體吸入，兒茶酚胺釋放，補體激活，暴發(fā)性氧自由基釋放以及纖溶-凝血系統(tǒng)的變化，可能參與了磷脂酶A2激活10，11。磷脂酶A2激活后，一方面它可能直接損傷肺泡上皮、毛細血管內皮，破壞肺泡表面活性物質，降解生物膜磷脂，引起細胞膜磷脂質和量的改變，進而引起膜通透性、流動性、膜上受體與酶功能的變化；另一方面，磷脂酶A2是血小

20、板激活因子、花生四烯酸等代謝產物合成與釋放的限速酶。磷脂酶A2激活后，這些物質大量釋放，并引發(fā)脂質過氧化產物的大量產生，形成惡性循環(huán)，進一步導致膜結構和功能的損害12。我們發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入傷后，肺細胞膜總磷脂持續(xù)降低，膜丙二醛含量持續(xù)增加，同時膜上ATP酶活性降低，表明煙霧吸入傷后，膜脂質破壞與膜功能受損。磷脂酶A2非特異性抑制劑-氯喹可以部分改善上述變化，間接闡明了磷脂酶A2在煙霧吸入性損傷發(fā)生中的變化和意義。氯喹是一種人工合成的抗瘧藥，具有非特異性磷脂酶A2抑制作用，已廣泛用于創(chuàng)傷、敗血癥、休克、缺血再灌注引起的組織器官損害和急性肺損傷防治的實驗研究，并證明它可以改善多種原因引起的急性肺損傷

21、，降低動物的死亡率13，14。本實驗發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入傷后立即注射10mg/kg的氯喹，對傷后6h肺細胞膜總磷脂、膜上Na+,K+-ATP酶Ca2+-ATP酶活性有明顯改善作用，同時降低膜上丙二醛含量，說明氯喹對煙霧吸入性肺損傷具有一定的保護作用，但其劑量、用法和臨床應用價值尚需進一步探討。 作者單位：楊天德重慶 400037 第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院麻醉科楊宗城羅奇志黎鰲重慶 400038 第三軍醫(yī)大學燒傷研究所參考文獻1謝爾凡，周來杰，汪仕良，等.煙霧吸入傷后肺內磷脂酶A2活性的變化和意義.第三軍醫(yī)大學學報，1996，18(6)528.2Huang Yuesheng,Li Ao,Yang Zong

22、cheng,et al.Changes of hromboxane and prostacyclin after smoke inhalation injury in goats.J Med Coll PLA,1988,341.3王敦，馮中明，劉旭盛，等.大鼠煙霧吸入傷模型的制作.第三軍醫(yī)大學學報，1989，11379.4呂寶璋，王小兵，單京瑞.豚鼠肺組織中和受體的檢定及其在實驗性過敏、哮喘時的變化.中華醫(yī)學雜志，1985，65385.5Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K.Assay for lipid peroxides in animal tissue by thiobarbituric acid reaction.Anal Biochem,1979,95351.6Bligh EG,Dyer WJ.A rapid method of total lipi