甘草次酸對中藥活性成分與血清蛋白結(jié)合的影響甘草次酸對中藥活性

1、甘草次酸對中藥活性成分與血清蛋白結(jié)合的影響甘草次酸對中藥活性         【摘要】 目的研究甘草次酸(GA)對中藥活性成分與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合的影響。方法利用多種光譜技術(shù)和毛細(xì)管電泳前沿分析方法測定，用Stern-Volmer方程和Scatchard plot等對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果得到甘草次酸與BSA的結(jié)合常數(shù)、位點(diǎn)數(shù)等結(jié)合特征，中藥活性成分與BSA結(jié)合        【摘要】  目的研究甘草次酸(GA)對中藥活性

2、成分與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合的影響。方法利用多種光譜技術(shù)和毛細(xì)管電泳前沿分析方法測定，用Stern-Volmer方程和Scatchard plot等對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果得到甘草次酸與BSA的結(jié)合常數(shù)、位點(diǎn)數(shù)等結(jié)合特征，中藥活性成分與BSA結(jié)合的常數(shù)和甘草次酸對這些成分結(jié)合常數(shù)的影響。結(jié)論甘草次酸與牛血清蛋白有高、低兩類結(jié)合位點(diǎn)，總的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為8，蛋白與GA濃度之比為0.38時，結(jié)合率已高達(dá)95。GA使中藥活性成分與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)下降最大達(dá)67%，可能對它們的藥理作用產(chǎn)生影響。 【關(guān)鍵詞】  中藥活性成分； 牛血清白蛋白； 甘草次酸； 藥物-藥物相互作用Abstract：O

3、bjectiveTo evaluate the influence of glycyrrhetinic acid (GA) on the binding of active ingredients of Chinese herbs with serum albumin. MethodsSpectroscopic method and capillary electrophoresis frontal analysis were utilized to determine the binding data. Stern-Volmer equation and Scatchard plot wer

4、e used to process the data. ResultsBinding constant and sites etc of GA with BSA were got. Binding constants of active ingredients of Chinese herbs and influence of GA on the binding of them were aslo obtained. ConclusionThere are two kinds of binding sites (high and low) in BSA while binding with G

5、A and the total binding sites are eight. The binding percentages of GA are up to 95% when the ratio of BSA to GA is 0.38. In the presence of GA, binding constants of active ingredients of Chinese herbs decrease up to 67%, which may exert an influence on their  pharmacological actionKey words：Ac

6、tive ingredients of Chinese herbs;   Bovine serum albumin;   Glycyrrhetinic acid;   Drug-drug interaction    近年來，中藥活性成分與血清白蛋白結(jié)合的研究已經(jīng)出現(xiàn)熱潮，如，桑色素1, 巖白菜素2, 芒果苷3, 大黃素4等。然而絕大多數(shù)研究以獲得活性成分的結(jié)合特征為目的，只有極少數(shù)研究探討中藥活性成分相互之間對結(jié)合的影響。如中國藥科大學(xué)李萍研究小組最近對中藥湯劑的整體成分與血清白蛋白的結(jié)合進(jìn)行了研究，發(fā)

7、現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯成分間對各自與BSA的結(jié)合有顯著影響5，在金銀花整體活性物質(zhì)與牛血清白蛋白相互作用中，綠原酸等3種成分在整體成分與BSA結(jié)合時比單個成分與BSA結(jié)合程度低，而咖啡酸、蘆丁則相反6?？梢?，中藥活性成分與蛋白結(jié)合時相互之間確實(shí)存在協(xié)同效應(yīng)。甘草是最常用的中藥之一，也是常用食品添加劑；甘草中甘草酸含量較大（3%10%）79，是甘草中最具特色的活性成分之一；甘草酸在體內(nèi)代謝后以甘草次酸的形式吸收進(jìn)入血液。因此，本文研究了甘草次酸對中藥活性成分與血清蛋白結(jié)合的影響，嘗試從成分之間血漿蛋白結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)（藥物-藥物相互作用）探討甘草的配伍規(guī)律，同時對甘草及相關(guān)藥物的安全、合理用藥提供參考。1&

8、#160; 儀器與材料1.1  儀器F-4500型分子熒光分光光度計（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可見光分光光度計(北京普析公司)；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋渦混合器，精密天平（Germany,Sartorius），pHS-3酸度計。J-810圓二色分光光度計（Japan，Jasco）；彩陸毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（北京，中科院化學(xué)所），配紫外檢測器和HW-001色譜工作站（中國，千譜軟件有限公司）；未涂層石英毛細(xì)管，52 cm ×50 m i.d.，有效長度為44  cm（中國河北永年光學(xué)纖維公司）；超濾管，截留分子量15 000（

9、PALL FILTER CO., LTD, USA）；TGL16型高速臺式離心機(jī)（湘儀）。1.2  試劑牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5  mol/L的儲備溶液，4 保存?zhèn)溆茫?8甘草次酸（GA，97%,Fluka, product of Spain）；槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山萘酚、大黃酸、大黃素對照品，購自中國藥品與生物制品檢定所（中國北京）；甲基蓮心堿（由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科劉韶惠贈，HPLC純度大于98）；中藥活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液；Tr

10、is（淮安和元化工有限公司），氯化鈉二水磷酸二氫鈉（河南焦作），鹽酸（湖南師范大學(xué)化學(xué)試劑廠）。除已標(biāo)明者外，試劑均為分析純；水為雙重蒸餾水。2  方法2.1  光譜實(shí)驗方法2.1.1  熒光猝滅方法在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 緩沖溶液、2 ml BSA儲備溶液，以水定容為10 ml, 搖勻, 在一定溫度下靜置30 min。取該溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定體積的中藥活性成分溶液（加入總量0.03 ml)，旋渦混勻。經(jīng)指定溫度下恒溫放置3 min后，在280

11、nm的激發(fā)波長下，掃描290420 nm熒光光譜。在相同條件下，測其紫外光譜。甘草次酸對中藥活性成分的影響是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法進(jìn)行。在實(shí)驗條件下活性成分在290450 nm范圍內(nèi)吸收很小，熒光內(nèi)濾作用可以忽略，故直接對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果為3次平行實(shí)驗的平均值。2.1.2  圓二色（CD）譜方法光源系統(tǒng)用氮?dú)獗Ｗo(hù)(流量為5 L/min)，樣品池的光徑為0.1 cm。測量參數(shù)：掃描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，響應(yīng)時間1 s，累積次數(shù)3次，掃描波段為190250 nm，BSA濃度為2×10-6 mol/L，實(shí)驗時向BSA中分別加入不同量的甘草次

12、酸，混合均勻后測量，得到其CD譜。2.2  毛細(xì)管電泳前沿分析（CE-FA）方法CE運(yùn)行緩沖是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸鈉，由適量的二水磷酸二氫鈉溶解于水，然后在pH計上用2 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)到指定的酸度，再經(jīng)過0.45 m濾膜過濾。BSA儲備液（200 mmol/L）是通過溶解適量的BSA粉末于運(yùn)行緩沖中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由儲備液用運(yùn)行緩沖稀釋而得。藥物儲備液（2  mmol/L）由運(yùn)行緩沖配制，內(nèi)含30（V/V）以下甲醇。藥物工作液由其儲備液通過運(yùn)行緩沖稀釋而得，其中甲醇含量小于3（V/V）。藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液也用于配制其校準(zhǔn)曲線，游離

13、濃度由校準(zhǔn)曲線求得。所有測試溶液在應(yīng)用前進(jìn)行脫氣。    一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 mol/L） ，加入等量的GA至 160 mol/L，再加入緩沖至1 ml，渦旋混合30 s。然后在36水浴加熱孵化2 h，再于室溫下平衡2 h。若要進(jìn)行超濾，則于室溫平衡后進(jìn)行，即取適量平衡液于超濾管，然后16 000 r/min下進(jìn)行分離，濾液由CE進(jìn)行測定。試樣重復(fù)兩份，結(jié)果取平均值，毛細(xì)管電泳在室溫下進(jìn)行。    新毛細(xì)管要做預(yù)處理，以1 mol/L HCl 沖洗30 min，水沖洗5 min，1 mo

14、l/L NaOH沖洗30 min，然后水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖沖洗15 min。為了獲得較好的峰形和遷移時間的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在每天實(shí)驗開始按照下列程序進(jìn)行沖洗和平衡：水沖洗2 min，1 mol/L氫氧化鈉沖洗2 min，水沖洗2 min，緩沖沖洗5 min。    在每次測量之間，毛細(xì)管以水沖洗2 min，1 mol/L氫氧化鈉沖洗2 min，水沖洗2    min，再以緩沖沖洗2 min。在這樣的條件下，可以保證消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超濾液重力進(jìn)樣60 s（毛細(xì)管進(jìn)出口高度差為30 cm）。運(yùn)行電壓為19 k

15、V，常規(guī)極性運(yùn)行，典型電流為85 mA，紫外檢測波長為254 nm。3  結(jié)果 3.1  甘草次酸與BSA作用的研究3.1.1  甘草次酸對BSA 的熒光猝滅光譜甘草次酸在與BSA 作用的過程中能顯著地猝滅BSA 的熒光，這種猝滅在GA加入便可迅速觀察到，這提示10BSA的一個高親和結(jié)合位點(diǎn)位于色氨酸殘基的附近。測得297 K甘草次酸對BSA的熒光猝滅光譜見圖1。在此過程中，GA/BSA=3時，最大發(fā)射峰由341 nm變?yōu)樽罱K的337 nm，略有藍(lán)移，顯示色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增加。并最終移至334 nm，在研究范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度下降87.6，說明GA和BSA發(fā)生

16、了結(jié)合作用，并使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。此外，可以觀察到色氨酸熒光下降幅度比酪氨酸大。見圖1。3.1.2  熒光猝滅作用的Stern-Volmer分析見圖2。圖2是根據(jù)Stern-Volmer 猝滅方程（方程1）作圖，式中，F(xiàn)為有猝滅劑時BSA 的熒光強(qiáng)度, F0為無猝滅劑時BSA 的熒光強(qiáng)度, Q為猝滅劑濃度，KSV 為動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq 為動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù), 各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010  L·mol-1·s-11；0 為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命。從圖2可見，在pH 7.40時，猝滅呈現(xiàn)兩

17、種不同的模式，這表明，GA與BSA的有兩類不同的結(jié)合位點(diǎn)。由斜率求的前半段（GA/ BSA3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1, R=0.999 1；在292 K, Kq=2.26×1013  L·mol-1·s-1, R=0.997 5；在287 K, Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1, R=0.998 8。而GA與BSA濃度比大于3之后也有較好的線性，297 K時Kq為2.74×1012 L·mol-1·s-1。很

18、顯然，由于由于各類猝滅劑對生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010  L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此值，由此可見，GA對BSA的兩類猝滅不是動態(tài)而是靜態(tài)猝滅。    F0/F1KSVQ1Kq0Q 3.1.3  結(jié)合常數(shù)假定小分子在生物大分子上有n個相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則小分子與生物大分子的結(jié)合平衡可以由方程11 表示。    lg(F0-F)/F) =lgK+nlgQ    這里，K表示某類結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)

19、合常數(shù)；n表示一個BSA中某類結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合的小分子數(shù)目，即結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；Q表示游離小分子濃度，在研究中通常以其總濃度代替。根據(jù)方程，以低濃度的GA（GA/BSA3）進(jìn)行試驗，求得GA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為：在297 K， K =8.28× 105 L·mol-1， n =1.12 (R=0.998 5) ；292 K ，K =1.60× 105 L·mol-1 n =1.04 (R=0.996 0)；在287 K， K =1.60× 105 L·mol-1, n=0.986 (R=0.998 1) 。       &