病毒與非病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較研究

1、    病毒與非病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較研究        自1992年綠色熒光蛋白(GFP)基因的cDNA被成功克隆以來(lái)，由于GFP結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、在受到藍(lán)光或紫外光照射時(shí)可自發(fā)發(fā)出綠色熒光，而這一過(guò)程不需要其他共刺激因子、底物或其他基因產(chǎn)物的協(xié)助，故在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛1，2。因此，深入研究各種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法在GFP基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的效率及優(yōu)缺點(diǎn)、分析GFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和生物學(xué)行為的影響等，對(duì)于合理應(yīng)用GFP十分重要。 一、材料與方法1.重組質(zhì)粒：GFP真核表達(dá)

2、質(zhì)粒pEGFP-N1購(gòu)自Clontech公司。GFP重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLNCX-EGFP是我們自己構(gòu)建的。來(lái)自pEGFP-N1、編碼增強(qiáng)型GFP的cDNA片段經(jīng)Hind 和Not 酶切及電泳分離后，由DNA聚合酶Pfu補(bǔ)齊成平頭，然后插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX(購(gòu)自Clontech公司)的多克隆位點(diǎn)Hpa 處。另一組質(zhì)粒pHook2-lacZ（購(gòu)自Invitrogen公司）的結(jié)構(gòu)與pEGFP-N1相似。我們用編碼增強(qiáng)型GFP的cDNA片段取代lacZ基因構(gòu)建了pHook2-EGFP。上述各種質(zhì)粒中l(wèi)acZ和GFP基因的表達(dá)均受人巨細(xì)胞病毒即刻早期抗原基因（CMV）啟動(dòng)子調(diào)控，neo基因的表

3、達(dá)受SV40啟動(dòng)子控制。2.細(xì)胞系：GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝采用Phoenix逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系， GFP腺病毒的擴(kuò)增采用人胚胎腎細(xì)胞系293。病毒與非病毒介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)采用大鼠乳腺癌細(xì)胞系R3230AC和小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1。新霉素(neo)抗性克隆的篩選及持續(xù)培養(yǎng)采用400 g/ml G418。3.GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺相關(guān)病毒的制備：生長(zhǎng)至80%90%密度的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，按1×107/ml重懸于無(wú)血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLNCX-EGFP的轉(zhuǎn)染采用電穿孔技術(shù)，每次電穿孔采用400 l細(xì)胞懸液和20 g質(zhì)粒DNA。電

4、穿孔儀為BTX公司產(chǎn)品，各項(xiàng)參數(shù)按廠家推薦設(shè)置。轉(zhuǎn)染后4872 h收集含有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，離心后-80儲(chǔ)存。一般情況下逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度為105 cfu/ml(GFP腺病毒由Dr. Borreli和Dr. Corry贈(zèng)送，GFP腺相關(guān)病毒由Dr. Samulski贈(zèng)送)。4.GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺相關(guān)病毒的感染：GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染：于感染的前1 d將1×106腫瘤細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，至細(xì)胞達(dá)到50%60%的密度時(shí)，將含病毒顆粒的上清液與聚季胺鹽混合（終濃度為4 g/ml），按每個(gè)細(xì)胞15 moi.加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染624 h，然后更換新鮮培養(yǎng)液，24

5、h后檢測(cè)GFP感染效率3。GFP腺病毒感染：按平均每個(gè)細(xì)胞100 pfu加入R3230AC和4T1細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中，腺病毒感染持續(xù)30 min，漂洗細(xì)胞后更換新鮮培養(yǎng)液，24 h后檢測(cè)GFP感染效率4。GFP腺相關(guān)病毒感染：先用無(wú)血清的Opti-MEN 培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞一次，按每個(gè)細(xì)胞1001 000 pfu，先將GFP腺相關(guān)病毒與2 ml Opti-MEN 培養(yǎng)液混合，再加入細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)，37過(guò)夜。次日改換含血清的新鮮培養(yǎng)液，24 h后檢測(cè)GFP感染效率5。5.脂質(zhì)體介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)染，以及持續(xù)、高效、穩(wěn)定表達(dá)GFP 的腫瘤細(xì)胞系：轉(zhuǎn)染的前1 d將1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞接種于10 cm細(xì)

6、胞培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)。轉(zhuǎn)染時(shí)先分別將5 g pEGFP-N1質(zhì)粒DNA及10 l DMRIE脂質(zhì)體（Gibco-BRL公司）加入到1 ml Opti-MEN 無(wú)血清培養(yǎng)液內(nèi)，混合，室溫放置3045 min。進(jìn)一步與2 ml Opti-MEN 混合，然后加入經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)液漂洗過(guò)的細(xì)胞中，37孵育5 h。此后加入等體積含20%胎牛血清的Opti-MEN ，37過(guò)夜。次日更換成正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，24 h后檢測(cè)GFP感染效率。表達(dá)GFP的腫瘤細(xì)胞系由G418篩選獲得。于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后第2 d先用胰蛋白酶消化，按150將細(xì)胞接種于含G418的細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，2周后熒光顯微鏡下選擇表達(dá)GFP的抗性克隆，進(jìn)一步在96

7、孔板中亞克隆。6.感染或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞GFP表達(dá)的檢測(cè)：感染或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞是否表達(dá)GFP，表達(dá)的強(qiáng)弱，以及細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式有無(wú)改變等的觀察采用Zeizz Axioskope顯微鏡及FITC濾光片。像經(jīng)與顯微鏡連接的照相裝置采集后，由計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存并分析。GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分析與分選、表達(dá)水平的檢測(cè)等采用BD公司FACStar流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源采用488 nm氬離子激光。細(xì)胞生長(zhǎng)速度參照細(xì)胞群體倍增時(shí)間，分別將穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染GFP的親代細(xì)胞按2×104接種于6孔板中，于24、48、72、96、120及148 h胰蛋白酶消化，Coulter Z2 Particle Count

8、Size Analysis儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。7.表達(dá)-半乳糖苷酶的細(xì)胞的染色分析：細(xì)胞經(jīng)pHook2-lacZ質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染、G418選擇23周后，抗性克隆先用4%甲醛固定10 min，然后與X-gal染色液孵育過(guò)夜。X-gal染色液包含1 mg/ml X-gal、4 mmol/L K3Fe(CN)6、4 mmol/LK4Fe(CN)4-3H2O 、2 mmol/L MgCl2。計(jì)數(shù)藍(lán)色克隆數(shù)目。二、結(jié)果1.病毒及非病毒介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及表達(dá)情況比較：GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染大鼠乳腺癌細(xì)胞系R3230AC，通常2 d以后方可見(jiàn)GFP表達(dá)。表達(dá)GFP的細(xì)胞其亮度比較均勻，但較弱。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的G

9、FP基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率依逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差異較大，變化在20%80% 之間。但感染后的細(xì)胞可長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)GFP。GFP腺病毒以平均一個(gè)細(xì)胞100 pfu感染R3230AC細(xì)胞，56 h后即可見(jiàn)明顯的GFP表達(dá)，幾乎100%的細(xì)胞可被感染。受腺病毒感染的細(xì)胞GFP表達(dá)程度很不均一，有的很亮，F(xiàn)ACS分析其亮度超過(guò)對(duì)照4個(gè)數(shù)量級(jí)。不過(guò)腺病毒介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)導(dǎo)其表達(dá)時(shí)間較短，通常僅持續(xù)高水平表達(dá)1周左右，然后逐漸降低，3周后幾乎完全消失。GFP腺相關(guān)病毒感染R3230AC細(xì)胞后2 d出現(xiàn)GFP表達(dá)，但對(duì)R3230AC細(xì)胞的感染能力很低，即使按1001 000 pfu感染R3230AC細(xì)胞，

10、僅1%左右表達(dá)GFP。脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染R3230AC細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后6 h可見(jiàn)GFP表達(dá)，24 h達(dá)到高峰，以后逐漸下降，如果不加任何選擇壓力，1周后完全消失。在最佳條件下GFP質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到50%以上，GFP的表達(dá)程度也很不均一，可見(jiàn)到很亮和較弱的細(xì)胞（14）。1未經(jīng)GFP基因轉(zhuǎn)移的大鼠乳腺癌細(xì)胞系透射光下觀察2脂質(zhì)體介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)移熒光顯微鏡下觀察3逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)移熒光顯微鏡下觀察4腺病毒介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)移熒光顯微鏡下觀察14經(jīng)不同病毒和脂質(zhì)體介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)移的大鼠乳腺癌細(xì)胞系GFP表達(dá)情況×4002.GFP表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)

11、速度及生物學(xué)行為的影響：R3230AC細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染及G418選擇后，其抗性克隆中70%完全看不見(jiàn)GFP表達(dá)，GFP陽(yáng)性克隆間其GFP的表達(dá)量差別也很大，即使在同一個(gè)克隆中，表達(dá)有時(shí)也不均一。為了深入研究GFP表達(dá)效率降低是否因GFP對(duì)宿主細(xì)胞有毒性所致，我們對(duì)比分析了pHook2-EGFP及pHook2-LacZ抗性克隆中GFP與LacZ基因的表達(dá)情況。結(jié)果是經(jīng)pHook2-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞G418抗性克隆中65%(165個(gè)克隆中的103個(gè)）X-gal染色呈陽(yáng)性，而pHook2-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞G418抗性克隆中僅18（76個(gè)克隆中的14個(gè)）熒光顯微鏡下呈綠色。此外，GF

12、P陽(yáng)性克隆中表達(dá)水平特別高的細(xì)胞常常變小變圓，傾向于脫離細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，這在腺病毒及脂質(zhì)體介導(dǎo)的GFP基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中尤其明顯。對(duì)4個(gè)表達(dá)GFP的陽(yáng)性克隆的細(xì)胞生長(zhǎng)速度進(jìn)行檢測(cè)，其中3個(gè)的群體倍增時(shí)間（24 h）與親代未轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞無(wú)明顯差異，1個(gè)表達(dá)水平特別高的克隆其細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，其群體倍增時(shí)間增加到27 h。GFP陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)可繼續(xù)生長(zhǎng)形成腫瘤并持續(xù)表達(dá)GFP。三、討論根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，病毒與非病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法均可介導(dǎo)GFP 基因轉(zhuǎn)移。腺相關(guān)病毒的宿主范圍較窄，對(duì)我們所采用的幾種腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率均極低。脂質(zhì)體介導(dǎo)的GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染可以獲得較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可高達(dá)50

13、%以上。逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒其宿主范圍較廣，對(duì)腫瘤細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均較高，能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)各種類型的細(xì)胞，且適量的GFP表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和生物學(xué)行為沒(méi)有明顯影響，表達(dá)GFP 的細(xì)胞不需任何處理即可在熒光顯微鏡下清晰顯示或被流式細(xì)胞儀所檢測(cè)，為今后研究基因表達(dá)，特別是監(jiān)測(cè)各種基因表達(dá)載體在活體內(nèi)的分布，以及組織和器官靶向傳遞等提供了有效的工具。GFP也存在缺點(diǎn)：（1）GFP的表達(dá)不夠穩(wěn)定，Hanazono等3認(rèn)為GFP基因不穩(wěn)定，容易發(fā)生重排。（2）要分離到持續(xù)、高效、穩(wěn)定表達(dá)GFP的克隆比較困難。（3）當(dāng)GFP特別高水平表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和生物學(xué)行為會(huì)發(fā)生一定的變化，提示過(guò)高水平的GFP對(duì)細(xì)

14、胞仍然具有一定的毒性。為了深入探討GFP不表達(dá)的原因，我們對(duì)比觀察了pHook2-EGFP與pHook2-lacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GFP和LacZ基因的表達(dá)情況，雖然后者G418抗性克隆中X-gal染色陽(yáng)性克隆的百分比明顯高于GFP陽(yáng)性克隆，但仍然只有65%。有人曾用單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色與X-gal染色對(duì)比分析LacZ基因轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)有的克隆盡管成功轉(zhuǎn)移了基因，也有表達(dá)，但只有有活性的-gal才能被X-gal顯示6。因此，G418抗性克隆中檢測(cè)不到綠色熒光除上述GFP基因重排外，也可能是由于GFP缺乏活性、或是表達(dá)量很低不易被常規(guī)采用的檢測(cè)方法所顯示。（本文編輯：齊文安）作者單位：黃倩（2

15、00080 上海市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室）李川源（Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center, U S A）參考文獻(xiàn)1，Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994,263:802-805.2，Cheng L, Fu J, Tsukamoto A, et al. Use of green fluorescent protein vari

16、ants to monitor gene transfer and expression in mammalian cells. Nat Biotechnol, 1996,14:606-609.3，Hanazono Y, Yu JM, Dunbar CE, et al. Green fluorescent protein retroviral vectors: low titer and high recombination frequency suggest a selective disadvantage. Hum Gene Ther, 1997,8:1313-1319.4，de Martin R, Raidl M, Hofer E, et al. Adenovirus-mediated expression of green fluorescent protein. Gene Ther, 1997, 4: 493-495.5，Peel AL, Zolotukhin S, Schrimsher GW, et al. Efficient transduction of green fluorescent protein in spinal cord neurons using adeno-associated virus vecto