微生物實驗指導(dǎo)書

1、 微生物學(xué)實驗 實驗指導(dǎo)書 廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院實驗一 顯微鏡的使用、細(xì)菌革蘭氏染色法及細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察（一） 實驗?zāi)康?. 了解普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造和工作原理2. 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。 3. 在油鏡下觀察細(xì)菌幾種基本形態(tài)4掌握細(xì)菌革蘭氏染色法（二） 實驗原理1顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理      現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常 被稱為復(fù)式顯微鏡。它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學(xué)顯微

2、鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大，對微生物學(xué)研究最為重要。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，這主要有如下二方面的原因：     1. 增加照明亮度     油鏡的放大倍數(shù)可達(dá) 100 ，放大倍數(shù)這樣大的鏡頭，焦距很短，直徑很小，但所需要的光照強度卻最大。從承載標(biāo)本的玻片透過來的光線，因介質(zhì)密度不同（從玻片進(jìn)入空氣，再進(jìn)入鏡頭），有些光線會因折射或全反射，不能進(jìn)入鏡頭，致使在使用油鏡時會因射入的光線較少，物像顯現(xiàn)不清。所以為了不使通過的光線有所損失，在使用油鏡時須在油鏡與玻片

3、之間加入與玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油鏡（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。     2. 增加顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指顯微鏡能辨別兩點之間的最小距離的能力。從物理學(xué)角度看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光的干涉現(xiàn)象及所用物鏡性能的限制，分辨力D可表示為：D=/2N.A，式中= 光波波長； NA= 物鏡的數(shù)值孔徑值。    光學(xué)顯微鏡的光源不可能超出可見光的波長范圍（ 0.4-0.7 m ），而數(shù)值孔徑值則取決于物鏡的鏡口角和玻片與鏡

4、頭間介質(zhì)的折射率，可表示為：NA=n × sin 式中為光線最大入射角的半數(shù)。它取決于物鏡的直徑和焦距，一般來說在實際應(yīng)用中最大只能達(dá)到 120 O ，而 n 為介質(zhì)折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空氣及水的折射率（分別為 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作為鏡頭于玻片之間介質(zhì)的油鏡所能達(dá)到的數(shù)值孔徑值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍鏡、高倍鏡等干鏡（ NA 都低于 1.0）。若以可見光的平均波長 0.55 m來計算，數(shù)值孔徑通常在0.65左右的高倍鏡只能分辨出距離不小于0.4m的物體，而油鏡的分辨率卻可達(dá)到 0.2 m 左右。2革蘭氏染色法是1884年

5、由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚

6、糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。 （二） 實驗器材1 菌種枯草芽孢桿菌1218h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、大腸桿菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物2 溶液或試劑香柏油，二甲苯，結(jié)晶紫染色液、盧哥氏碘液、95%乙醇、番紅染色液，蒸餾水3 儀器及相關(guān)用品 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、

7、酒精燈、鑷子（三） 實驗方法1 顯微觀察 顯微觀察時應(yīng)遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序。 油鏡觀察 高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。將聚光器升至最高位置并開足光圈，若所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過 1.0 ，還應(yīng)在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，保證其達(dá)到最大的效能。調(diào)節(jié)照明使視野亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。 2革蘭氏染色（1） 涂片  常規(guī)涂片法 取一潔凈的載

8、玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側(cè)標(biāo)上菌號，并在兩端各滴一小滴蒸餾水，以無菌接種環(huán)分別挑取少量菌體涂片，干燥、固定。玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。 （2） 初染 滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于兩個玻片的涂面上，染色12min ，傾去染色液，細(xì)水沖洗至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。 （3）  媒染用盧戈氏碘液媒染約1 min ，水洗。 （4）  脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，終止脫色，將載玻片上水甩凈。 革蘭氏染色結(jié)果是否

9、正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時間一般約2030s。 （5）  復(fù)染 在涂片上滴加番紅液復(fù)染約23min ，水洗，然后用吸水紙吸干。在染色的過程中，不可使染液干涸。 （6） 鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。4用畢后的處理    （1）上升鏡筒，取下載玻片。     （2） 用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯

10、（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。    （3）用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。    （4）分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，涼干后備用。（四） 實驗結(jié)果1 繪出你在油鏡下觀察到的三種菌的形態(tài)2 列表簡述兩株細(xì)菌的染色結(jié)果(菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng))。（五） 思考題1、用油鏡觀察時應(yīng)注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作用？ 2、影響顯微鏡分辨率的因素

11、有哪些？ 3、 進(jìn)行革蘭氏染色時，為什么特別強調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題? 4、 你認(rèn)為制備細(xì)菌染色標(biāo)本時，應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)? 實驗二 沉降法檢測空氣中微生物數(shù)量（一） 實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握用沉降法檢測空氣中的微生物2了解空氣中微生物的分布狀況（二）實驗原理在我們周圍的環(huán)境中存在著種類繁多、數(shù)量龐大的微生物。空氣中也不例外。雖然空氣不是微生物棲息的良好環(huán)境。但由于氣流、灰塵和水沫的流動，人和動物的活動等原因，仍有相當(dāng)數(shù)量的微生物存在。當(dāng)空氣中個體微小的微生物落到適合于它們生長繁殖的固體培養(yǎng)基的表面時，在適溫下培養(yǎng)一段時間后，每一個分散的菌體或孢子就會形成一

12、個個肉眼可見的細(xì)胞群體即菌落。觀察大小、形態(tài)各異的菌落，就可大致鑒別空氣個存在的微生物的種類。（三)實驗器材1 試劑牛肉蛋白胨培養(yǎng)基配方：牛肉膏 5.0g, 蛋白胨 10.0g，NaCl 5g, 水1000ml，pH 7.27.4馬鈴薯培養(yǎng)基配方：馬鈴薯 200g, 蔗糖 20g, 水1000ml， pH 7.2高氏一號培養(yǎng)基配方：淀粉 20g, 硝酸鉀 1.0g, 磷酸氫二鉀 0.5g, 硫酸鎂0.5g, 氯化鈉0.5g, 硫酸亞鐵0.01g, 水1000ml, pH 7.27.42. 儀器及其他用品高壓滅菌鍋，操作工作臺，三角瓶，培養(yǎng)皿，酒精燈，培養(yǎng)箱等（四）實驗方法1倒平板：按常法配置上

13、述培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，高壓滅菌備用。臨用前將培養(yǎng)基熔化，冷卻至50左右，各倒16個平板備用。2暴露取樣在指定的地點草地，一層樓，三層樓，七層樓各放4皿，將平板皿蓋打開，在空氣中暴露5min和10min,時間一到，立即合上皿蓋。3 培養(yǎng)觀察： 細(xì)菌置于37培養(yǎng)，放線菌培養(yǎng)基平板和真菌培養(yǎng)基平板置于28培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌和放線菌培養(yǎng)4-6天。計數(shù)平板上的菌落，觀察各種菌落的形態(tài)、大小、顏色等特征。4.計算1m3空氣中微生物的數(shù)目奧梅染斯基（）曾建議：如面積為1002的平板培養(yǎng)基，暴露在空氣中5分鐘，置于37培養(yǎng)24小時后所生長的菌落數(shù)，相當(dāng)于10L空氣中的細(xì)菌數(shù)。N×100&

14、#215;1002X=X：每m3空氣中的細(xì)菌數(shù)N：平板暴露5分鐘，置37培養(yǎng)24小時后生長的菌落數(shù)r：平皿底半徑（）（五）實驗結(jié)果1列表比較不同放置地點空氣菌落種類以及數(shù)量的差異？ 菌落平均數(shù)環(huán)境細(xì)菌霉菌放線菌室外5min10min室內(nèi)5min10min2用沉降法計算1m3空氣環(huán)境中所含菌數(shù)。（六）思考題1對沉降測定法的結(jié)果，進(jìn)行分析。實驗三 多管發(fā)酵法檢測水中的大腸菌群（一） 實驗?zāi)康?. 了解飲用水和水源水大腸菌群的原理和意義2學(xué)習(xí)檢測水中大腸菌群的方法 （二）實驗原理 大腸菌群是評價水質(zhì)好壞的一個重要的衛(wèi)生指標(biāo)，也是反映水體被生活污水污染的一項重要監(jiān)測項目。大腸菌群是一群以大腸埃希氏菌（

15、Escherichiacoli）為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在37生長時，能在48小時內(nèi)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定一升水樣中總大腸菌群數(shù)不超過三個。多管發(fā)酵法包括初發(fā)酵試驗、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗三個部分。發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。1初發(fā)酵試驗水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37下培養(yǎng)，24小時內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果。48小時后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。2平板分離初發(fā)酵管24至48小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在復(fù)紅亞硫酸

16、鈉瓊脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，Endos medium）或伊紅美藍(lán)瓊脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上劃線分離菌落。3復(fù)發(fā)酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過此試驗再進(jìn)一步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，經(jīng)24小時培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。（二） 實驗器材1. 水樣自來水2試劑乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍(lán)或復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂平板，革蘭氏染液。3 儀器及其它用品 載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管，革蘭氏染液，顯微鏡，香柏油，二甲苯，擦鏡紙

17、，吸水紙，滅菌三角瓶等。（四） 實驗方法1 水樣的采取水源水2初發(fā)酵試驗 取16支發(fā)酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，1支加入9ml自然水。完成后包裝好，于121高壓滅菌鍋中滅菌30min左右。冷卻后，在無菌操作條件下，向裝有三倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液的5支試管加入10ml水樣，向裝有一倍的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5支試管中加入1ml水樣，向裝有一倍的乳酸蛋白胨培養(yǎng)液的另5支試管中加入1ml 10-1水樣。 將各試管充分混均，置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。（2）平板分離 經(jīng)24小時培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶）液體，分別劃線

18、接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，再置于37下培養(yǎng)1824小時，將符合下列特征的菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。（a）深紫黑色、有金屬光澤。（b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。（c）淡紫紅色、中心顏色較深。（3）復(fù)發(fā)酵試驗 經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落13個，37培養(yǎng)24小時，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。證實有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管（瓶）數(shù)查表，即得大腸菌群數(shù)。表1 大腸桿菌群的最可能數(shù)（MPN單位：個·（100ml）-1出現(xiàn)陽性份數(shù)

19、每100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值10ml 管1ml管0.1ml管下限上限10ml 管1ml管0.1ml管下限上限000<2421269780012<0.57430279800102<0.574313311930204<0.5114403412931002<0.57500237701014<0.5115013411891104<0.51150243151101116<0.5155103311931206<0.51551146161202005<0.5135126

20、321150201711752049171302107117521702317021192215229428220220922153079251902301232853111031250300811953214037310301112255331804450031011225540130353003111443454117043190320144345422205770032117546543280908503301754654435012010004001333155024068750401175465513501201000410175465525401801400出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml

21、水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)95%可信限度值10ml 管1ml管0.1ml管下限上限10ml 管1ml管0.1ml管下限上限4112176355392030032004122697855416006405800420227675552400水樣總量：55.5ml(5管10ml水樣，5管0.1ml水樣，5管0.1 1:10稀釋水樣時，不同陽性和陰性情況下100ml水樣中細(xì)菌的最可能數(shù)和95%可信限度值)（五）實驗結(jié)果1查表1得每升水源水樣中大腸菌群數(shù)是多少？ 出現(xiàn)陽性份數(shù)10ml 管1ml管0.1ml管（六） 思考題 1為什么要選擇大腸菌群作為

22、水源被腸道病原菌污染的指示菌？實驗四 活性污泥中生物相與放線菌、霉菌、酵母菌的形態(tài)觀察（一） 實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)觀察活性污泥中生物相的方法。2初步分析生物處理系統(tǒng)工作狀態(tài)是否正常。3. 學(xué)習(xí)并掌握放線菌、霉菌、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的方法。4加深理解放線菌、霉菌、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)特征（二）實驗原理1活性污泥中生物相比較復(fù)雜，以細(xì)菌、原生動物為主，還有真菌、后生動物等。某些細(xì)菌能分泌膠粘物質(zhì)形成菌膠團(tuán)，進(jìn)而組成污泥絮絨體（絨粒）。在正常的成熟污泥中，細(xì)菌大多集于菌膠團(tuán)絮絨體中，游離細(xì)菌較少，此時，污泥絮絨體可具有一定形狀、結(jié)構(gòu)稠密、擴(kuò)光率強、沉降性能好。原生動物常作為污水凈化指標(biāo)；當(dāng)固著型纖毛蟲優(yōu)勢時，一般認(rèn)

23、為污水處理池運轉(zhuǎn)失常。當(dāng)后生動物輪蟲等大量出現(xiàn)時，意味著污泥極度衰老。2放線菌在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長而得名。放線菌是由不同長短的纖細(xì)的菌絲所形成的單細(xì)胞菌絲體。菌絲體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋形、波浪形或分枝狀等。孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。3. 霉菌菌絲較粗大，細(xì)胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標(biāo)本時常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片其特點是（a）細(xì)胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長時間；（c）溶液本身呈

24、藍(lán)色，有一定染色效果。霉菌的菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)常作為分類的重要依據(jù)。4. 酵母菌是多形的、不運動的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細(xì)菌大。繁殖方式也較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。本實驗通過用美藍(lán)染色浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的，用它來對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用。使細(xì)胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色，而對于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還原能

25、力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。（三）實驗器材1活性污泥樣品2菌種放線菌、 霉菌、酵母菌3. 試劑0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液4儀器以及其它用品顯微鏡，目鏡測微尺，200ml量筒、載玻片、蓋玻片、玻璃小吸管、橡皮吸頭、鑷子。吸水紙， 香柏油，二甲苯（四）實驗方法1活性污泥生物相的觀察（1）肉眼觀察：取曝氣池的混合液置于100ml量筒內(nèi)，直觀活性污泥在量筒中呈現(xiàn)的絮絨體外觀及沉降性能（30分鐘沉降后的污泥體積）。（2）制片鏡檢：滴混合液12滴于載玻片上，加蓋玻片制成水浸標(biāo)本片，在顯微鏡中倍或高倍鏡下觀察生物相。絲狀微生物：伸出絮絨體外的

26、多寡，以哪一類為優(yōu)勢？見本實驗附注1。微型動物：原生動物的識別。常見后生動物特征描述見本實驗附注2。2. 放線菌的觀察直接觀察法用鑷子連同培養(yǎng)基挑取放線菌菌苔置載玻片中央。放在潔凈的載玻片上，選擇菌苔邊緣部位，在顯微鏡下依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡直接觀察，觀察時需不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，仔細(xì)觀察氣生菌絲，基內(nèi)菌絲和孢子絲的形狀。 插片觀察法 將高氏1號培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，制成4左右的培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)檢驗后無菌，備用。然后將孢子懸液涂皿（濃度以稀釋10-210-3為好）。用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)， 倒置，于28培養(yǎng)45天后，小心地將蓋玻片取出，把有菌的一面朝上，

27、放在載玻片上，置顯微鏡下進(jìn)行觀察。一般情況是氣生菌絲顏色較深，并比營養(yǎng)菌絲粗二倍左右。3霉菌的觀察用鑷子連同培養(yǎng)基挑取放線菌菌苔置載玻片中央。放在潔凈的載玻片上，選擇菌苔邊緣部位，在顯微鏡下依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡直接觀察，觀察時需不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，仔細(xì)觀察菌絲，分生孢子梗和分生孢子。4. 酵母菌的觀察（1）在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，液滴不可過多或過少，以免蓋上蓋玻片時，溢出或留有氣泡。然后按無菌操作法取在瓊脂斜面上培養(yǎng)48小時的酵母菌少許，放在呂氏堿性美藍(lán)染液中，使菌體與染液均勻混合。（2）用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。蓋蓋玻片時應(yīng)注意，不能將蓋玻片平放下去，應(yīng)先將

28、蓋玻片的一邊與液滴接觸，然后將整個蓋玻片慢慢放下，這樣可以避免產(chǎn)生氣泡。（3）將制好的水浸片放置3分鐘后鏡檢。先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，同時可以根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細(xì)胞。（4）染色半小時后，再觀察一下死細(xì)胞數(shù)是否增加。（5）用0.05%呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述的操作。（五）實驗結(jié)果1將鏡檢結(jié)果填于下表中，并列出所見主要生物?；钚晕勰鄟碓?，采樣日期絲狀微生物原生動物后生動物3繪圖說明你所觀察到的放線菌、酶菌以及酵母菌的形態(tài)特征。（六）思考題 1根據(jù)實驗觀察情況，試對活性污泥質(zhì)量及運行情況作初步評價。2.在自然界和實際應(yīng)用中放線菌有什么作用？（七）附錄1活性

29、污泥中常見的絲狀微生物（1）球衣菌（Sphaerotilus）：由許多圓柱形細(xì)胞排列成鏈，外面包圍一層衣鞘，形成絲狀體。具有假分枝。單個菌體可自衣鞘游出，活潑運動或粘附于鞘外。（2）貝氏硫菌（Beggiatoa）：無色而寬度均勻的絲狀體，與球衣菌不同的是外面無衣鞘，各絲狀體分散不相連接。絲狀體由圓柱形細(xì)胞緊密排列而成，有時可見硫粒。絲狀體不固著于基質(zhì)上，可呈匍匐狀滑行，菌體扭曲、穿插匍匐滑行于污泥之中。（3）發(fā)硫菌（Thiothrix）：亦由細(xì)胞排列成絲狀體，具薄鞘但一般鏡檢時不可見。其絲狀體基部有吸盤，可使菌體固著于基質(zhì)上生長。在附著生長時，有時菌絲體左右平等伸長成羽毛狀，有時以放射狀從活性

30、污泥絮絨體內(nèi)向四周伸展，有時菌絲體交織在一起自成中心向四周伸展。（4）霉菌（mould）：活性污泥中常見到菌絲體遠(yuǎn)較上述細(xì)菌為粗大的霉菌菌絲體和霉菌孢子。菌絲體有的有隔，并具有真分枝。2活性污泥中常見的后生動物（1）線蟲（Nematoda）：身體細(xì)長呈線形，其橫切面呈圓形。常見卷曲不能自由伸縮，而是靠身體作蛇形扭曲而運動。（2）輪蟲（Rotifera）：形體很小，身體的前端或靠近前端有輪盤（頭冠），其上的纖毛經(jīng)常擺動，有游泳和攝食的功能。在口腔或口管下面的咽喉部分膨大而形成咀嚼囊，內(nèi)有一套較復(fù)雜的咀嚼器，可以多少地伸出口外以攫取食物。（3）顫體蟲（Aeolosoma）：在活性污泥中最大、分化最

31、高級的一種多細(xì)胞動物，身體分節(jié)，節(jié)間有剛毛伸出，體表具有帶色澤的油點。實驗五 土壤中微生物的分離與純化（綜合性實驗）（一） 實驗?zāi)康? 明確培養(yǎng)基的配制原理，并通過對微生物培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟2.掌握按照研究需要選取不同的環(huán)境以找到自己需要的目標(biāo)菌株的基本方法，學(xué)習(xí)分離純化微生物的基本操作技術(shù)。進(jìn)一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù)；掌握微生物培養(yǎng)方法以及接種技術(shù)。（二）實驗原理培養(yǎng)基是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長的需要配制而成的一種混合營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)或分離各種微生物。因此，營養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)當(dāng)有微生物所能利用的營養(yǎng)成分（包括碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因素）和水。根據(jù)微

32、生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制。在土壤、水、空氣或及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化微生物，直至得到純菌株。（三） 實驗器材1 培養(yǎng)基與試劑牛肉膏蛋白胨

33、培養(yǎng)基：牛肉膏 5g，蛋白胨  10g ， NaCl  5g，瓊脂 1520g ，H2O 高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g， NaCl  0.5g ，MgSO4.7H2O  0.5g ，KNO3  1g ， FeSO4  0.01g，瓊脂 1520g ，H2O 1000ml，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g, 蔗糖20g，瓊脂1520g，H2O 1000ml, pH自然。1%鏈霉素，0.5%重鉻酸鉀，結(jié)晶紫染液，盧戈氏

34、碘液，95%乙醇，番紅2 儀器以及其他用品高壓滅菌鍋，超凈工作臺，普通光學(xué)顯微鏡，培養(yǎng)皿， 移液器， 天平，滅菌的袋子，小鏟，250ml三角錐形瓶，250ml燒杯，藥勺，無菌培養(yǎng)皿，盛9m1無菌水的試管6支、盛45m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃珠、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、稱量紙等。（四） 實驗方法1土壤取樣根據(jù)實驗的目的選取采樣地點，把采到的土壤裝進(jìn)取樣袋后直接帶回微生物實驗室立即使用或放入4的冰箱備用，但放置時間不要超過一天。2 培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基的類別 培養(yǎng)基配制原料 配置方法用于培養(yǎng)的菌種馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，葡萄糖20g

35、, 瓊脂20g，水1000ml。將馬鈴薯去皮切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸1020min。用紗布過濾，補加蒸餾水至1000mL。加入瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。霉菌酵母菌 高氏1號培養(yǎng)基  可溶性淀粉20g,KNO3 1g,NaCl 0.5g,K2HPO4·3H2O 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,瓊脂20g,水 1000mL，pH 試紙。 先將淀粉溶入燒杯中加熱攪拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至1000mL。調(diào)pH7.27.4，加入瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。 放線菌 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g,瓊脂20g，水1000ml，pH 試紙 。先將牛肉膏、蛋白胨溶入燒杯中加熱攪拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至1000mL。調(diào)pH7.27.4，加入瓊脂，加熱溶化，分裝，121高壓滅菌20min。 細(xì)菌3.儀器滅菌將配置好的培養(yǎng)基，用報紙包扎好的培養(yǎng)皿、用橡膠塞封好的盛有9mL的試管、槍頭和裝有45mL蒸餾水與玻璃珠的三角錐瓶，玻璃珠放到高壓滅菌鍋進(jìn)行高溫蒸汽滅菌。4微生物的分離（1）倒