迷你玫瑰組織培養(yǎng)中細菌污染的防止

1、植物生理學(xué)通訊第 40卷第 1期,2004年 2月 45迷你玫瑰組織培養(yǎng)中細菌污染的防止由翠榮 * 曲復(fù)寧龔雪琴林榮雙煙臺大學(xué)生物化學(xué)系, 煙臺264005提要 迷你玫瑰組織快繁體系連續(xù)繼代過程中, 插入培養(yǎng)基的試管苗切口處有云霧狀污染菌生長, 其中2種為革蘭氏陰性桿菌, 1種為革蘭氏陽性桿菌。 培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(50150mg . L -1抑制污染菌生長, 不影響試管苗不定芽分化率, 50mg . L -1的氨芐青霉素明顯促進染菌苗的生根。 加入硫酸丁胺卡那霉素(25100mg . L -1有殺滅污染菌的作用, 但 對試管苗則有不同程度的毒害(葉片、 葉柄和莖段出現(xiàn)黃化現(xiàn)象, 對不定芽

2、分化和生根也有明顯的抑制。 關(guān)鍵詞 迷你玫瑰;組織培養(yǎng); 氨芐青霉素; 硫酸丁胺卡那霉素; 抑菌作用 Control of Bacterial Contaminants in Tissue Cultures of Rosa hybrida cv. miniYOU Cui-Rong*, QU Fu-Ning, GONG Xue-Qin, LIN Rong-ShuangDepartment of Biochemistry, Yantai University, Yantai 264005Abstract Bacterial contamination is observed as faint cl

3、ouds in the medium after repeated subculture periodof mini-rose micropropagation system. The contaminants are purified and identified as two different kinds ofGram-negative and one kind of Gram-positive rod bacteria. The two antibiotics, ampicillin and kanamycinsulphate which concentrations are resp

4、ectively 50150 mg. L -1 and 25100 mg. L - 1 are used in the culture media.The result shows that ampicillin has bacteriostatic effect on contaminants and that the effect on adventitious-bud differentiation of contaminated plants after the treatments of different ampicillins concentrations has alsono

5、evident difference as that of normal plants and the treatment concentration (50 mg. L -1 greatly advances theroot formation rate of the contaminated plantlets. The treatments of different concentrations of kanamycinsulphate well kill the contaminants and have phytotoxic influence on the contaminated

6、 plantlets, which leaves,shoots and stems turn yellow. They have also greatly reduced adventitious-bud differentiation and their rootformation rate.Key words Rosa hybrida;tissue culture; ampicillin; kanamycin sulphate; bacteriostatic effect植物組織培養(yǎng)中的污染是一個很普遍的現(xiàn) 象,因此無菌操作和培養(yǎng)環(huán)境的潔凈對減少組培 物污染率來說都很重要 13。據(jù)報道,多

7、種植物 在建立快繁體系后連續(xù)繼代多次,體系中經(jīng)常會 有污染菌的出現(xiàn)。此類污染菌只生長在試管苗插 入培養(yǎng)基的切口處,在培養(yǎng)基中生長極其緩慢, 呈云霧狀。 這在松柏類植物 4,5和香蕉的莖尖培養(yǎng) 6中都有過報道。本文探討迷你玫瑰繼代培養(yǎng)過程 中抗生素防止細菌污染的效應(yīng),以及抗生素對組 培苗分化和生根的影響。材料與方法迷你玫瑰(Rosahybrida cv. mini快繁體系連續(xù) 多次繼代后, 部分試管苗插入培養(yǎng)基的切口處出現(xiàn) 云霧狀污染菌, 將此污染試管苗培養(yǎng)在1/2MS+6-BA 1mg . L -1附加氨芐青霉素(0、50、100、150mg .L -1或硫酸丁胺卡那霉素(0、25、50、75

8、、 100mg . L -1 的培養(yǎng)基上進行抑菌和不定芽分化試 驗。不定芽分化培養(yǎng) 30d 后,統(tǒng)計芽數(shù)并繼代于 不含抗生素的不定芽分化培養(yǎng)基上, 7d后統(tǒng)計污 染率,以確定次代抑菌率。進行生根試驗時, 將染菌的試管苗培養(yǎng)在以下附加氨芐青霉素或硫 酸丁胺卡那霉素(0、50mg . L -1的生根培養(yǎng) 基上:(11/2MS+IBA0.5mg . L -1;(21/2MS+IBA 0.3mg . L -1;(31/2MS+IBA0.2mg . L -1+NAA0.2mg . L -1;(41/2MS+IBA0.2mg . L -1+NAA0.2mg . L -1;(5MS +IBA0.2mg .

9、L -1+NAA0.2mg . L -1(M S 是將 M S 中 N H 4N O 3的含量減半,其余含植物生理學(xué)通訊第 40卷第 1期,2004年 2月 46量保持不變 。20d 后統(tǒng)計試管苗生根率。 污染菌于無菌條件下接種于葡萄糖蛋白胨液 體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)后,分別在牛肉膏蛋白胨、 馬鈴薯葡萄糖和豆芽汁固體培養(yǎng)基平板上劃線接 種,置于 37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24或 48h 后,觀 察菌落的生長情況,確定污染菌的適宜生長培養(yǎng) 基。之后,繼續(xù)在適宜培養(yǎng)基平板上劃線分離, 得到不同的單菌落,分別挑取單個菌落接種于斜 面上培養(yǎng)。每一種菌源均反復(fù)劃線、鏡檢,得 到純培養(yǎng)菌種。確定菌落的形狀和大小,進

10、行革 蘭氏染色,同時用測微尺測定菌體的大小。有芽 孢的菌體用芽孢染色方法進一步加以確認 7。結(jié)果與討論1 污染菌的界定分別將污染菌接種在牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯 葡萄糖和豆芽汁固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng),24或 48 h 后進行觀察。結(jié)果表明,在牛肉膏蛋白胨和豆 芽汁培養(yǎng)基上生長緩慢,甚至不見其生長;在馬 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上則生長良好。在馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)基平板上反復(fù)分離、純化,得到 3種不同 特征的純培養(yǎng)菌種:1號菌種的菌落直徑為 0. 6 m m ,系革蘭氏陰性芽孢桿菌,芽孢端生,顯微 測量菌體大小為(1.53.0m (0.50.6 m;2號菌種的菌落直徑為 0.5mm,系革蘭氏 陽性芽孢桿菌,芽孢

11、端生,菌體大小為(3 6 m (0. 9 1. 0m ;3號菌種的菌落直徑為 0. 8 m m ,系革蘭氏陰性桿菌,菌體大小為 (5 9m (1. 1 1. 2m 。2 氨芐青霉素和硫酸丁胺卡那霉素的抑菌效應(yīng)及 對不定芽分化的影響表 1顯示, 培養(yǎng)基中附加 50150mg . L -1氨芐 青霉素對當代污染菌的抑制率為 100%。氨芐青霉 素的次代抑菌效果與其濃度有關(guān),抑制率隨著氨 芐青霉素的濃度增加而增強。不同濃度氨芐青霉 素對試管苗不定芽的分化率影響不顯著。25100 mg . L -1的硫酸丁胺卡那霉素對污染菌有很明顯的殺 滅效應(yīng),但對試管苗則有不同程度的毒害,表現(xiàn) 為葉子、葉柄和莖段出

12、現(xiàn)黃化現(xiàn)象,黃化程度隨 濃度增大而增強,對不定芽分化也有明顯的抑制 作 用 。3氨芐青霉素和硫酸丁胺卡那霉素對染菌試管苗 生根的影響從表2可見:(1染菌的試管苗很難生根,即使能生根, 根褐化現(xiàn)象明顯。 氨芐青霉素對同一種生根培養(yǎng) 基上試管苗的生根有明顯的促進作用,并可消除 根的褐化現(xiàn)象。10種生根培養(yǎng)基中,1/2MS+IBA 0.2mg . L -1+NAA0.2mg . L -1的試管苗無論有否加入氨 芐青霉素,生根率比其余培養(yǎng)基的都高。但不加氨 芐青霉素的生根率比其余加有氨芐青霉素的都低。 據(jù)此可以認為,培養(yǎng)基中附加氨芐青霉素是防止污 染和提高組培苗產(chǎn)率的有效方法。(2加有 50mg .

13、L -1硫酸丁胺卡那霉素的 10 植物生理學(xué)通訊第 40卷第 1期,2004年 2月 47 根有明顯的抑制作用,對試管苗也有顯著毒害效 應(yīng),表現(xiàn)為試管苗切口出現(xiàn)明顯褐化,葉片和莖 段黃化,甚至死亡。參考文獻3李群, 杜文平, 王米力等.植物組織培養(yǎng)中控制污染技術(shù) 研究.四川林業(yè)科技,1999,20(4 :22264EwaldD,NaujokG,ZaspelIetal.Occurrenceandinfluenceof endogenousbacteriaembryogenicculturesofNorwayspruce.In:CassellAC(ed.PathogenandMicrobialCo

14、ntaminationMan-agementinMicropropagation.Dordrecht:KluwerAcadPub, 1997.1491515Ewald D,ZaspelI,NaujokGetal . Endogenousbacteriaintissue culturesofconifersappearanceandaction.Proceedingsofthe InternationalSymposiumonMethodsandMarkersforQuality AssuranceinMicropropagation.Cork, Ireland:ISHS,1999. 1371436VandenhouweI,SwennenR.Charact