納米腫瘤疫苗的制備工藝的優(yōu)化及特性鑒定

1、納米腫瘤疫苗的制備工藝的優(yōu)化及特性鑒定         11-01-31 10:23:00     作者：李俠    編輯：studa20【摘要】  目的: 制備無(wú)明顯毒性、 高效的惡性腫瘤基因工程納米疫苗。方法: 純化融合蛋白MH, 薄膜分散超聲法制備包裹MH的納米脂質(zhì)體腫瘤疫苗NL（MH）, 并評(píng)價(jià)其粒徑、 包裹率及穩(wěn)定性; 觀察NL（MH）免疫組小鼠的急性毒性反應(yīng), 及重要臟器的病理學(xué)改變。結(jié)果: 成功制備出粒徑為（80

2、±250） nm的納米脂質(zhì)體, 其藥物包裹率為30%, 于4放置6個(gè)月后或3 000 r/min 10 min離心后無(wú)分層, 證明其穩(wěn)定性良好; 與PBS對(duì)照組相比, 免疫組小鼠未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)。結(jié)論: 該惡性腫瘤基因工程納米疫苗具有良好的理化性質(zhì), 未見(jiàn)毒性反應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】  腫瘤特異性抗原 脂質(zhì)體 樹(shù)突狀細(xì)胞 腫瘤疫苗腫瘤疫苗能誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng),  在腫瘤防治上已經(jīng)顯示出一定的效果,  被認(rèn)為是最具前景的腫瘤治療方法。本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠,  結(jié)果顯示融合蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效的MAGE3特異性CT

3、L,  對(duì)表達(dá)MAGE3的B16細(xì)胞有很好的殺傷效果1。為了使該融合蛋白能更好地被機(jī)體攝取且更好地靶向腫瘤組織,  更有效地激活機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)MAGE3的特異性CTL,  對(duì)表達(dá)MAGE3的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用,  本部分實(shí)驗(yàn)中采用納米脂質(zhì)體為載體,  包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白（MH）制備惡性腫瘤基因工程納米疫苗。1  材料和方法1.1  材料 分光光度計(jì)（UV3000型）為日本島津公司產(chǎn)品; 透射電子顯微鏡（JEM2000 EX型）為日立公司產(chǎn)品;    集熱式恒溫加

4、熱磁力攪拌器（DF101B型）為鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品; 20 kHz/500 watt超聲粉碎儀為美國(guó)ColeParmer公司產(chǎn)品; RPMIl640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; 蛋黃卵磷脂和膽固醇為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品; 其他試劑均為進(jìn)口超純級(jí)或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí); pET28（+）MAGE3/Hsp70質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室研制。1.2  方法PAGE。采用80 V,  60 min轉(zhuǎn)移PVDF膜,  50 g/L脫脂乳T(mén)TBS室溫下封閉PVDF膜60 min,  用TTBS 1500稀釋MAGE3抗血清,  從封閉液中取出膜, 

5、 放入抗血清中,  37  60 min。TTBS洗膜3次每次10 min,  采用TTBS緩沖液15 000稀釋HRP標(biāo)記的生物素化二抗,  37  60 min,  TTBS洗膜,  DAB顯色。采用薄膜分散超聲法制備納米疫苗,  選用4因素、 3水平正交設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化見(jiàn)表1（4個(gè)因素分別為大豆卵磷脂和膽固醇摩爾比（A）、 脂和水體積比（B）、 超聲時(shí)間（C）、 PBS的pH值（D）, 以包封率為考察指標(biāo)來(lái)篩選處方）。脂質(zhì)體具體制備步驟如下：秤取處方量的大豆卵磷脂和膽固醇于100 mL燒瓶中,  加

6、入氯仿12 mL,  置于6570 水浴中,  于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn), 減壓除去氯仿,  得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1 g/L）的PBS（ pH=7.5±0.5）20 mL 于小燒杯中,  同置于6570 水浴中,  保溫待用。取預(yù)熱的PBS,  加至含有磷脂膜的燒瓶中,  6570水浴中攪拌水化1020 min,  即成脂質(zhì)體液。取出該液于燒杯中,  置于磁力攪拌器上,  室溫下攪拌3060 min。冰水浴條件下超聲1020 min,  即得脂質(zhì)體膠體液。0.1 

7、; m聚碳酸樹(shù)脂纖維過(guò)濾3次,  整粒,  得粒徑較均勻的脂質(zhì)體。用0.22  m的濾膜過(guò)濾除菌后,  于4保存。表1  各個(gè)因素不同配比的正交設(shè)計(jì)（略）(1)形態(tài)觀察: 將制成的NL（MH）500倍稀釋于生理鹽水中,  取100 L滴于400目銅網(wǎng)上,  1 min后吸去上清, 10 g/L磷鎢酸負(fù)染色1 min,  自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。將采集的圖象經(jīng)計(jì)算機(jī)圖象分析,  求得NL（MH）的平均粒徑。(2)包裹率及穩(wěn)定性測(cè)定: 采用SephedexG100凝膠層析法,  洗脫

8、液為PBS,  流速為0.5 mL/min。取NL（MH）1.0 mL上柱,  收集游離峰即為游離的MH。同時(shí)制備不同濃度的MH標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品,  Bradford法測(cè)定蛋白的含量,  計(jì)算出NL（MH）中游離MH的含量。將制備的NL（MH）置于4冰箱保存6個(gè)月后或3 000 r/min 10 min離心后,  電鏡觀察納米脂質(zhì)體形態(tài),  明確其穩(wěn)定性。包封率=（系統(tǒng)中的總藥量 液體介質(zhì)中未包封的藥量）/系統(tǒng)中的總藥量×100%。(3)納米疫苗急性毒性: 實(shí)驗(yàn)取二級(jí)條件C57BL/6小鼠20只,  雌雄不拘,

9、0; 隨機(jī)分為2組,  每組10只。PBS對(duì)照組：腹腔注射PBS 1.0 mL/鼠; 納米疫苗（NL（MH）組）: 腹腔注射包封MH的最大濃度0.3 g/L的納米疫苗,  1.0 mL/鼠,  觀察實(shí)驗(yàn)鼠有無(wú)急性中毒表現(xiàn),  并記錄兩周內(nèi)死亡小鼠的只數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物、剖檢（肉眼觀察主要臟器的大小、 硬度、 有無(wú)胸腹腔積液等）、 取心臟、 肝臟、 脾臟、 肺臟、 腎臟,  用4 g/L的甲醛固定,  石蠟包埋,  HE染色,  行病理組織學(xué)觀察。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,  P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,  計(jì)量數(shù)據(jù)結(jié)果均以x±s表示。組間差異性比較采用oneway ANOVA。2  結(jié)果2.1  MAGE3/Hsp70融合蛋白的純化與鑒定  含有pET28（+）MAGE3/Hsp70質(zhì)粒的BL21(DE3),