砷劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 論文

1、    砷劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 論文砷劑，主要成分為三氧化二砷（As2O3），在祖國(guó)醫(yī)藥中被稱為砒石。幾世紀(jì)以前，砷劑就被人們用來治療牛皮癬、風(fēng)濕癥、白血病、梅毒、痔瘡等。目前臨床上砷劑的應(yīng)用主要限于用有機(jī)砷治療錐蟲病或三氧化二砷作牙髓失活劑。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)首先報(bào)道了靜脈滴注As2O3治療復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）達(dá)到很高的完全緩解率后，上海血液研究所發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和部分分化。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)砷劑與腫瘤的研究發(fā)展很快，發(fā)現(xiàn)砷劑對(duì)惡性淋巴系統(tǒng)疾病、紅白血病甚至實(shí)體瘤有令人振奮的治療效果?，F(xiàn)就其生化作用及對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)凋亡作

2、用作一綜述。1砷的生化作用砷作為微量元素，存在于正常人體內(nèi)。其化學(xué)形式可分為三價(jià)砷(無機(jī)砷)和五價(jià)砷(有機(jī)砷)，它們?cè)隗w內(nèi)的相互轉(zhuǎn)換和代謝決定著砷的毒性作用。三價(jià)砷毒性較大，易在體內(nèi)蓄積，主要經(jīng)胃腸道緩慢排泄;而五價(jià)砷則相對(duì)毒性較低，蓄積傾向低，主要經(jīng)腎臟較快排泄。進(jìn)入人體后的三價(jià)砷在肝臟內(nèi)還原發(fā)生甲基化，形成一甲胂酸(MMA)或二甲胂酸(DMA)，從而被解毒。砷是一種細(xì)胞原漿毒，細(xì)胞內(nèi)的相鄰巰基是三價(jià)砷的主要化學(xué)受體。應(yīng)用含巰基的還原型谷胱甘肽可阻斷砷劑的毒性作用。含大量巰基的還原型角蛋白結(jié)合砷劑的量為含較少巰基的氧化型角蛋白結(jié)合砷劑量的十倍。砷劑與酶分子內(nèi)的巰基作用后可抑制其活性。受影響的

3、重要酶系統(tǒng)有丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、磷酸酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、脫氧核糖核酸聚合酶、白介素1轉(zhuǎn)化酶（ICE）等，從而直接影響了細(xì)胞的代謝過程、染色體結(jié)構(gòu)、核分裂等。線粒體是對(duì)砷劑作用最敏感的細(xì)胞器，三價(jià)砷消耗了線粒體內(nèi)親水的巰基后，干擾了線粒體內(nèi)的離子平衡以及NAD(P)H的氧化，從而干擾了線粒體的能量代謝，引起細(xì)胞功能的紊亂。砷劑是否對(duì)正常細(xì)胞有毒性作用取決于劑量，如As2O3治療APL有效血濃度及體外研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的有效濃度均在0.1M2.0M，實(shí)驗(yàn)表明As2O3在此濃度下對(duì)造血干細(xì)胞影響甚小1。2砷劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控，分化或凋亡受阻。近年來

4、研究表明砷劑既可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、部分分化，也可抑制其增殖。多項(xiàng)研究表明誘導(dǎo)凋亡為其殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制。2.1開放MPT，活化caspase家族研究表明，細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)不在細(xì)胞核而在細(xì)胞質(zhì)。雖然凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)一系列的特征性形態(tài)學(xué)變化，但這些改變僅僅是細(xì)胞凋亡的結(jié)果。凋亡細(xì)胞在被誘導(dǎo)產(chǎn)生特征性形態(tài)學(xué)改變和DNA降解之前，一個(gè)最普遍的變化是線粒體膜功能的改變即線粒體的通透性改變(permeability transition，PT)，這是調(diào)節(jié)凋亡的中心環(huán)節(jié)。線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(MPT)是位于線粒體內(nèi)外膜之間的多蛋白復(fù)合體，至少包括胞質(zhì)的己糖激酶、外膜的PBR、外室的肌酸激酶、

5、內(nèi)膜的ANT及基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（cyclophilin D）等。MPT通過調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)中的Ca2、pH和電荷，維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保證氧化磷酸化通路通暢，對(duì)凋亡控制具有重要作用。砷劑與巰基結(jié)合后，導(dǎo)致MPT開放，線粒體跨膜電位(m)下降或消失，繼之呼吸鏈脫偶聯(lián)，谷胱甘肽耗竭，活性氧類（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生及對(duì)誘導(dǎo)凋亡非常重要的蛋白酶活化物的釋放，包括細(xì)胞色素C(Cyto-C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)， Cyto-C和 AIF均可激活caspase，caspase可誘導(dǎo)凋亡。caspase即半胱氨酸蛋白

6、酶家族。在NB4（一種APL細(xì)胞系），U937及SHSY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤等細(xì)胞系中均可見As2O3等砷劑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)的caspase激活2，3。根據(jù)其在細(xì)胞凋亡中的作用可分為始動(dòng)(上游)caspase(caspase2，8，9，10)和效應(yīng)(下游)caspase(caspase3，6，7)兩大類。前者在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)作用下結(jié)合特異輔因子而活化，并進(jìn)一步活化后者。而caspase抑制劑(ZVAD，fmk等)可阻止砷劑誘導(dǎo)的凋亡。因而caspase的活化級(jí)聯(lián)形式是砷劑誘導(dǎo)凋亡的重要通路。綜上所述，砷劑引起的MPT開放和m破壞是決定細(xì)胞生存與否的關(guān)鍵，而caspase是砷劑誘導(dǎo)凋亡的下游效應(yīng)物，其活

7、化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.2改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和抗氧化代謝的平衡往往是決定細(xì)胞生存與否的關(guān)鍵。蛋白的氧化作用可能是改變核基因轉(zhuǎn)錄的重要步驟，氧化作用通過基因轉(zhuǎn)錄改變細(xì)胞的表型以便進(jìn)一步啟動(dòng)凋亡的發(fā)生，且凋亡的最后階段需要氧化過程的參與，如細(xì)胞膜蛋白的氧化能開放離子通道間接地導(dǎo)致細(xì)胞皺縮，通過組蛋白的氧化修飾作用導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的改變。砷劑可使細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多是由于：（1）MPT開放，線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈?zhǔn)茏?，致ROS外漏。（2）活化黃素蛋白依賴的超氧化物酶（如NADPH氧化酶），使H2O2產(chǎn)生增多，后者可通過從線粒體釋放Cyto-C，活化caspase-3并裂解多聚ADP核糖

8、多聚酶(PARP)而介導(dǎo)凋亡（PARP在DNA受損時(shí)可識(shí)別并結(jié)合到DNA斷裂處被激活而參與DNA的修復(fù)，是細(xì)胞凋亡中第一個(gè)被鑒定為由caspase-3降解的DNA修復(fù)酶）；又可通過與線粒體巰基形成復(fù)合物而降低GSH的活性等途徑使ROS清除減少。故砷劑可通過改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)誘導(dǎo)凋亡。但將細(xì)胞培養(yǎng)于氧濃度低于10ppm不可能產(chǎn)生ROS的條件下，仍可發(fā)生凋亡，故這可能只是機(jī)制之一。2.3快速調(diào)變PMLRAR融合蛋白的亞細(xì)胞定位APL細(xì)胞特征性染色體易位t(15;17)導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞白血病基因(PML)和維甲酸受體基因(RAR)融合，表達(dá)PML-RAR融合蛋白。通過轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)可證實(shí)PML-

9、RAR融合蛋白是APL發(fā)病的主要分子基礎(chǔ)。體外研究表明，PML-RAR融合蛋白既阻斷APL細(xì)胞的分化，也使APL細(xì)胞凋亡受阻。早期認(rèn)為砷劑通過降解此蛋白而誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡，稱之為維甲酸受體信號(hào)通路4。正常血細(xì)胞中野生型PML與RAR等共定位于核體(PODs)中。大多數(shù)APL細(xì)胞因PML-RAR與PML形成異二聚體而使PODs結(jié)構(gòu)解體，阻止細(xì)胞分化及抑制凋亡。砷劑使PML， PML-RAR重新共定位于PODs并快速降解之。該現(xiàn)象與APL細(xì)胞凋亡以及二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇(DTT)抑制NB4細(xì)胞凋亡與抑制PML-RAR快速降解在時(shí)相上均有一定的相關(guān)性，被認(rèn)為是砷劑治療APL的機(jī)制之一。

10、但有實(shí)驗(yàn)顯示5，在PML小鼠(不含PML基因的小鼠)，As2O3同樣能抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，且其誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)不僅見于APL細(xì)胞，還可見于非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞及某些正常細(xì)胞，故其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制是非特異性的，維甲酸受體信號(hào)通路并非是砷劑誘導(dǎo)凋亡的惟一機(jī)制。2.4抑制Bcl-2基因Bcl-2基因即細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因69，是一種凋亡抑制基因，又稱長(zhǎng)壽基因，是維持癌細(xì)胞無限制生長(zhǎng)的主要基因。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bax、Bcl-X、Bcl-w、Bak、Bad、A1 、NR-13和Mcl-1，其中Bax、Bak、Bcl-Xs是促凋

11、亡因子，其余為抗凋亡因子。Bcl-2對(duì)細(xì)胞周期無明顯影響，而對(duì)細(xì)胞死亡的干擾有選擇性，阻止了細(xì)胞死亡的最后途徑，包括核苷酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的降解。Bax是Bcl-2的一種同源蛋白，Bax既可以形成同聚體，又可與Bcl-2形成異二聚體，Bax蛋白與Bcl-2蛋白的比值影響著細(xì)胞受到刺激后發(fā)生凋亡的比率。目前認(rèn)為，Bcl-2家族促凋亡因子和抗凋亡因子的相對(duì)表達(dá)水平至少部分決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)性。大量實(shí)驗(yàn)表明，Bcl-2與Bcl-X l能夠抑制MPT開放和維持線粒體m，進(jìn)而抑制Cyto_C和AIF從線粒體釋放入胞漿并阻斷了ROS的生成，增加胞內(nèi)GSH含量并促進(jìn)其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，即有細(xì)胞內(nèi)抗

12、氧化作用。在砷劑誘導(dǎo)的NB4、U937及B細(xì)胞白血病細(xì)胞系LyH7細(xì)胞凋亡中Bcl-2表達(dá)下調(diào)10。在1.0M As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡時(shí)11,CPP32（caspase3）被激活和降解PARP，同時(shí)Bcl-2不僅在mRNA水平而且在蛋白質(zhì)水平均被下調(diào)；而在1.0M As2O3誘導(dǎo)惡性淋巴性白血病細(xì)胞凋亡過程中既無CPP32激活又無Bcl-2調(diào)變，提示砷劑誘導(dǎo)的凋亡中Bcl-2發(fā)揮的作用各異。有實(shí)驗(yàn)表明，2.5M As2O312使肝癌細(xì)胞系Hep201Bcl-2表達(dá)明顯下降，而凋亡的促進(jìn)因子Bax的表達(dá)明顯增加，兩種基因表達(dá)比例發(fā)生變化。又有報(bào)道，10M

13、60;As2O3處理人肝癌QGY-7701、QGY-7703細(xì)胞48小時(shí)后其Bcl-2基因表達(dá)明顯下降，Bax和Fas基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax蛋白與Bcl-2蛋白比值增加。對(duì)Bax、Bcl-Xl等基因是否表達(dá)各報(bào)道不同1315。Bcl-2的過度表達(dá)可抑制砷劑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)現(xiàn)象，而通過反義技術(shù)使Bcl-2下調(diào)可抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡。綜上所述，砷劑可通過對(duì)Bcl-2基因的抑制誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的凋亡。但As2O3并不影響惡性淋巴瘤細(xì)胞及某些成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系Bcl-2（Bcl-Xl）的表達(dá)，提示Bcl-2可能不是參與誘導(dǎo)以上細(xì)胞凋亡的主要中介。NF-B就被釋放、激活并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列的基因表

14、達(dá)。其中，NF-B在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的抗凋亡作用，因此，抑制腫瘤細(xì)胞NF-B的活性將引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。有研究表明17，As2O3可強(qiáng)烈抑制HTLV-1和HTLV-2（human T-cell leukemia virus type 1,2）細(xì)胞的IB磷酸化，使NF-B不能進(jìn)入細(xì)胞核中，即抑制了NF-BN的活化。啟動(dòng)子為NF-B依賴性的抗凋亡蛋白Bcl-X1的表達(dá)也因此而下調(diào)。m下降及Cyto-C的釋放導(dǎo)致caspase-3激活，進(jìn)而誘導(dǎo)了HTLV-1和HTLV-2這兩種對(duì)大多數(shù)凋亡誘導(dǎo)劑有抵抗作用的細(xì)胞發(fā)生凋亡?？梢姡?/p>

15、抑制NF-B的活性也是砷劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。2.6使胞質(zhì)Ca2濃度升高Zhang等18發(fā)現(xiàn)以As2O3處理胃癌細(xì)胞系MGC803時(shí)，胞質(zhì)Ca2濃度升高與MGC803細(xì)胞凋亡呈平行關(guān)系，且兩者對(duì)As2O3呈時(shí)間、劑量依賴性。推測(cè)砷可能通過以下機(jī)制改變胞質(zhì)Ca2濃度：（1）由于膜表面的Bcl-2相關(guān)蛋白具有陽離子選擇性通道的功能，Bcl-2能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和線粒體水平影響Ca2的亞細(xì)胞分布。因而，砷等凋亡信號(hào)對(duì)Bcl-2的抑制作用使Ca2通道開放，胞質(zhì)Ca2濃度升高；（2）細(xì)胞內(nèi)ROS活性升高及砷劑直接作用于細(xì)胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)位酶的巰基均可使胞內(nèi)外Ca2平衡失控；（3）線粒體m下降使得Ca

16、2吸收逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致Ca2由線粒體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體內(nèi)Ca2耗竭可直接或通過加強(qiáng)線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而且，鈣離子本身作為一種凋亡信號(hào)，可調(diào)節(jié)鈣離子敏感的關(guān)鍵酶如蛋白激酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶及谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶等誘導(dǎo)凋亡。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，探討砷劑對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)凋亡作用很有意義，將為砷劑應(yīng)用于臨床提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):1Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, et al. Use of arsenic trioxide (A

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