瘧原蟲抗藥性的遺傳學研究進展(一)

1、瘧原蟲抗藥性的遺傳學研究進展 一 關鍵詞：瘧原蟲屬； 抗瘧藥；抗藥性；基因摘要瘧原蟲產(chǎn)生抗藥性是瘧疾防治中遇到的主要 難題之一。 抗葉酸類抗瘧藥的抗藥性機制已根本搞清， 與其作用靶酶二氫葉酸復原酶或二氫 蝶酸合成酶基因點突變相關。 喹啉類藥物抗性影響因子尚不完全清楚。 惡性瘧原蟲 5 號染色 體上的多藥耐藥基因 1 及 7 號染色體上的 cg2 基因可能是抗性相關基因， 但二者都不能完全 解釋抗性，尚待深入研究。瘧疾的流行至今仍然十分廣泛， 普及全球 90 多個國家和地區(qū)， 20 億人面臨感染瘧疾的危險。 據(jù)統(tǒng)計，全球每年有 3億5億瘧疾病例，導致150萬270萬人死亡，其中100萬是居住 在

2、非洲的 5 歲以下兒童 1。人類在長期實踐過程中篩選了大量防治瘧疾的藥物，但是，自從 50 年代末在東南亞和南美洲分別發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲對氯喹產(chǎn)生抗藥性以后，抗氯喹惡性瘧 迅速擴散蔓延，抗藥性程度不斷增加，并且從單藥抗藥性向多藥抗藥性開展。我國的海南、 云南和廣西等省、 自治區(qū)也有抗藥性瘧疾的流行。 目前， 瘧原蟲對幾乎每一種抗瘧藥都產(chǎn)生 了抗性， 瘧疾防治形勢非常嚴峻， 迫切要求我們盡快搞清抗藥性產(chǎn)生的機制， 以便采取措施 防止或逆轉(zhuǎn)抗藥性的發(fā)生并指導新藥研究。 近年來， 分子生物學技術的開展及學科滲透大大 推動了瘧原蟲抗藥性機制的遺傳學研究， 本文就抗葉酸制劑及喹啉類藥物抗性的分子機制作 一綜

3、述。1 抗葉酸制劑抗性的分子機制1.1二氫葉酸復原酶DHFR基因乙胺嘧啶和環(huán)氯胍都是二氫葉酸復原酶抑制劑。 研究說明， 惡性瘧原蟲對兩藥產(chǎn)生抗藥性都 與DHFR基因點突變相關，但二者存在差異2,3。迄今為止，共報道了6個DHFR基因編碼區(qū)變異：108 位 SerAsn 或 Thr,51 位 Asl lle,59 位 CysfArg,16 位 Ala Val,164 位 lie 宀 Leu 單一點突變所致 DHFR108位Ser變異成Asn即可產(chǎn)生乙胺嘧啶抗性，但對環(huán)氯胍的反響性 僅稍有降低。對乙胺嘧啶產(chǎn)生高度抗性那么需其他位點突變共存，包括51位Asrlie和或59位Cyst Arg而與環(huán)氯胍

4、抗性相關的變異是DHFR108位Ser宀Th伴隨16位Ala宀Vai同樣，該抗性株對乙胺嘧啶的敏感性變化不大。另外，在對乙胺嘧啶和環(huán)氯胍交叉耐藥的惡性瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)存在多個位點變異：DHFR164位 Ile tLeu,08 位 SertAsn,59位 CysArg 和或51 位 AsrrIle。由于僅包含 Asn-108 和 Arg-59變異的原蟲別離物不具有環(huán)氯胍抗性，因此，認為Leu-164變異在瘧原蟲對兩藥產(chǎn)生交叉抗性的機制中起重要作用 3。1.2二氫蝶酸合成酶DHPS基因磺胺類藥是二氫蝶酸合成酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，正是由于磺胺類藥作用的靶酶DHPS基因點突變， 使得酶活性中心結(jié)構(gòu)域形狀改變

5、， 因而降低了對藥物的敏感性。 體外低葉酸條件下實 驗說明4，與磺胺多辛易感性降低相關的DHPS氨基酸變異主要包括 581位AlatGy,436位 SertPhe伴隨 613 位 Ala tThr/Ser以及 436 位 SertAla,437位 Ala tGly, 磺胺多辛通常與乙胺嘧啶合用于治療惡性瘧疾。 對兩藥聯(lián)用的體外研究揭示， 瘧原蟲對乙胺 嘧啶的易感性決定著兩藥協(xié)同作用的效果5。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)6，前面所述的DHFR變異類型均存在并與抗性程度相關，而DHPS基因突變與抗性的發(fā)生沒有明顯相關性，僅在抗性程度較高的玻利維亞地區(qū)可見 Gly-581 高度流行 ,Gly-437 和 Glu-

6、540 的發(fā)生與用乙胺嘧啶 - 磺胺多辛治療失敗率相當，這可能由于體外研究中葉酸和PABA水平不同于體內(nèi)。另一種解釋是 Ala-436 的變異可能僅在低度抗性時出現(xiàn)， 且不與高度抗性時的變異 Gly-437,Glu-540 和 Gly-581共存。因此推測，DHPS變異在臨床乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性的產(chǎn)生中不起主導作用。 我們能夠肯定，體內(nèi)乙胺嘧啶 磺胺多辛抗性與 DHFR基因突變相關，然而在抗性瘧流行區(qū)治 療失敗率并不像突變發(fā)生率那樣高， 提示體外研究發(fā)現(xiàn)的三種變異 Asn-108， Ile-51 和 Arg-59 不能完全解釋體內(nèi)高度抗性。在玻利維亞的高度抗性病例中曾發(fā)現(xiàn)Leu-164及另外

7、兩個新的變異 Arg-50 和插入 30-31 位間的玻利維亞重復區(qū)高度流行， 提示這些變異可能是在抗性開展 的較高時期產(chǎn)生的，關系到治療的成敗。據(jù)此Plowe 等 6提出假設，體內(nèi)乙胺嘧啶 -磺胺多辛抗性程度分級 RI ,RH ,RH正是基于DHFR和DHPS基因突變的不斷積累。 由于現(xiàn)實中惡 性瘧原蟲感染的復雜性及宿主免疫與葉酸水平的影響，事實上所檢測到的抗性突變往往是交叉重疊的?？傊?，關于抗葉酸制劑的抗藥性分子機制已根本搞清。因此，我們可以根據(jù)特有的突變類型，運用分子生物學的方法， 進行大規(guī)模的流行病學研究， 這對于鑒定某一瘧疾流行區(qū)的藥物敏 感性， 從而指導臨床用藥具有重要意義； 同時

8、也可指導新藥設計及臨床藥物聯(lián)用， 以最大限 度地減少藥物抗性的發(fā)生。2 喹啉類藥物抗性的分子機制 氯喹曾經(jīng)是使用最廣泛的抗瘧藥， 由于抗性的開展及傳播， 在大局部地區(qū)已不再具有以往的 效力。影響抗性機理最終說明的重要因素是喹啉類藥物作用機制還不十分清楚。不同地區(qū)的研究者報道關于氯喹抗性的一個共同特征是： 抗氯喹蟲株較敏感性蟲株藥物聚集水平降低了。 因此， 氯喹的轉(zhuǎn)運和聚集不僅對其發(fā)揮抗瘧活性是必需的， 而且與抗性表型密切相關， 提示 喹啉類藥物抗性產(chǎn)生可能與其作用方式?jīng)]有直接關系，這與抗葉酸制劑不同。2.1 惡性瘧原蟲多藥耐藥基因 pfmdr1 和 pfmdr2 研究發(fā)現(xiàn)， 維拉帕米 一種鈣通

9、道阻滯劑可逆轉(zhuǎn)氯喹抗藥性，促使人們考慮氯喹抗性可能與哺乳動物腫瘤細胞多藥抗藥性MDR表型相似7。研究說明，腫瘤細胞產(chǎn)生MDR是由于一種ATP依賴性的、與藥物外排相關的蛋白過量表達所致，稱為P-糖蛋白，它定位于細胞外表，與許多不同類型的化合物有親合力 8。在此根底上， Krogstad 等 9發(fā)現(xiàn)抗 氯喹株原蟲較敏感株排出氯喹的速率快4050倍，且這種排出是能量依賴性的，并可被能量缺乏及ATP阻斷劑抑制。但是也有研究顯示，抗氯喹株與敏感株藥物外排率相等10；二者藥物聚集量的差異是由于最初的藥物攝入速率不同所致 11。哺乳動物MDR表型通常伴有 mdr基因的擴增，導致其產(chǎn)物 P-糖蛋白表達增加8。

10、對惡性 瘧原蟲基因的研究說明也存在 mdr 基因同系物，以 pfmdr1 和 pfmdr2 為主 12， 13。目前 尚無證據(jù)說明 pfmdr2 及其表達產(chǎn)物與氯喹抗性有關， 而有相當多的研究認為 pfmdr1 與抗藥 性機制相關。Pfmdrl編碼一個相對分子質(zhì)量約162的蛋白，稱為P-糖蛋白同系物1 Pgh1。早期研究表明，在一些抗氯喹株中存在 pfmdr1 擴增 12， 13。免疫熒光及免疫電鏡技術觀察 pfmdr1 蛋白產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn) Pgh1 在紅內(nèi)期表達，主要定位于食物泡膜上，這與它可能充當氯喹轉(zhuǎn)運蛋 白的角色一致，但是定量分析不能確認 Pgh1 過表達與抗藥性相關 14。Foote 等

11、 15對 pfmdr1 基因 3多態(tài)性及等位基因變異分析說明，pfmdr1 突變與氯喹抗性表型相關，并提出存在兩種類型抗性相關等位基因，一種可致單一氨基酸變異86 位Asnt Ty,為K1型；另一種那么導致三種氨基酸變異，1034位Ser宀Cy、1042位AsnAsp和1246位AsprTry,為7G8型。這可能分別代表著最早在東南亞和南美洲出現(xiàn)的氯喹抗性類 型。以此為根底，運用單盲法研究，曾正確地預測了 36 份樣品中的 34 份的藥物易感性。Adagu等16的研究也說明 86位Tyr突變與氯喹抗性相關。但是，同時有些研究不能得 到相同的結(jié)果。這提示可能 pfmdr1 不是唯一的控制抗性的基

12、因。氯喹抗性與 pfmdr1 的關系尚不明確，從選自氯喹抗性親代的甲氟喹抗性株中卻發(fā)現(xiàn)有pfmdr1的擴增，并且蟲株對甲氟喹抗性增加的同時對氯喹的易感性增加了12。Barnes等17的研究說明，隨著原蟲對氯喹抗性的增加， pfmdr1 基因拷貝數(shù)減少，甲氟喹易感性 增加，這無疑加強了 pfmdr1 擴增與甲氟喹抗性的關聯(lián)。 因此推測 pfmdr1 擴增可能與氯喹高 度抗性是不相容的， Pgh1 的功能可能是促進對氯喹的易感性。將 pfmdr1 基因轉(zhuǎn)染于異源表達系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細胞CHO ，使其表達惡性瘧原蟲 Pgh1，發(fā)現(xiàn)Pgh1表達伴隨有能量依賴性的藥物攝入增加18，而且Pgh1就定位于轉(zhuǎn)染的 CHO細胞溶酶體上，經(jīng)測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞溶酶體內(nèi) pH 值有所下降，認為氯喹聚集增加可能是溶 酶體酸化的結(jié)果，推測pfmdrl可能編碼一種液泡氯化物通道。當CHO細胞被攜帶有 7G8型 1034 和 1042 位突變的 pfmdr1 基因轉(zhuǎn)染時，那么發(fā)現(xiàn)氯喹易感性喪失，細胞聚集藥物及酸 化溶酶體的能力減弱，這就從某種意義上證實了關于 Pgh1 促進氯喹易感性的推測。但這仍 缺乏以解釋抗性。