冷凍干燥或交聯(lián)制胰島素-殼聚糖納米顆粒的設(shè)計(jì),表征和生物效率(譯文)

1、冷凍干燥或交聯(lián)制胰島素-殼聚糖納米顆粒的設(shè)計(jì)，表征和生物效率M. Diopa, N. Aubervalb, A. Viciglioa, A. Langloisa, W. Bietigera, C. Muraa, C. Peroneta, A. Bekelb, D. Julien Davidc, M. Zhaoc, M. Pingeta, N. Jeandidiera, C. Vauthierd,E. Marchionic, Y. Frereb, S. Sigrista,*摘要: 胰島素口服給藥是理想的給藥方式，但是由于胃腸道的苛刻條件沒有效果。使用封裝在自組裝顆粒中的胰島素的保護(hù)是有希望的方法

2、。然而，這種顆粒在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性缺乏導(dǎo)致口服給藥后封裝的胰島素的生物利用度低。這項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)冷凍干燥和交聯(lián)兩種穩(wěn)定策略的單獨(dú)或聯(lián)合作用，對(duì)胰島素負(fù)載的殼聚糖納米粒的影響，并確定其體外和體內(nèi)的生物有效性。通過胰島素和殼聚糖之間的復(fù)合凝聚制備納米粒，通過與三聚磷酸鈉溶液（TPP）交聯(lián)或冷凍-干燥或兩種方法同時(shí)處理而穩(wěn)定。體外納米顆粒吸收的生物有效性通過流式細(xì)胞儀對(duì)上皮模型（Caco-2 / RevHT29MTX（粘液分泌細(xì)胞）評(píng)估。在體內(nèi)，納米顆粒通過導(dǎo)管注射在對(duì)胰島素缺乏的大鼠的腹膜或十二指腸。與不影響納米顆粒電荷但降低納米顆粒尺寸（-25）的交聯(lián)相比，凍干在尺寸和電荷上增加（+15

3、vs control 412±7nm; + 36±0.3mV）。當(dāng)兩種方法組合時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)水平相比，連續(xù)處理降低納米顆粒大小并增加電荷。沒有冷凍干燥的，其中60的納米顆粒在2小時(shí)后被破壞，與沒有冷凍干燥的相比，冷凍干燥是必需的，用以防止納米顆粒在腸環(huán)境中的破壞。另外冷凍干燥結(jié)合交聯(lián)處理時(shí)提高了納米顆粒的生物效率，當(dāng)存在粘液時(shí)細(xì)胞中的攝取增加。在體內(nèi)兩種處理的組合顯示了其對(duì)胰島素的保護(hù)，當(dāng)施用納米顆粒時(shí)具有降低血糖的作用。這項(xiàng)工作表明，冷凍干燥和交聯(lián)處理的組合是必要的，以在體外和體內(nèi)胰島素的遞送中穩(wěn)定（冷凍干燥）和增加自組裝納米顆粒的生物效率（交聯(lián)）。關(guān)鍵詞：殼聚糖 胰島素 納

4、米顆粒 口服 復(fù)合凝聚1.介紹 皮下胰島素注射廣泛用于糖尿病治療。然而，注射通常是痛苦的，導(dǎo)致患者依從性低（Al-Tabakha and Arida,2008）。通過最大限度地減少注射，可以增加患者依從性，從而提高治療療效?？诜o藥是遞送藥物方便舒適的方法，因?yàn)槠湎伺c注射相關(guān)的疼痛和創(chuàng)傷。 然而，由于胃腸道的惡劣條件，口服給藥會(huì)使胰島素在到達(dá)血流之前使蛋白質(zhì)變性。例如，小于0.1的口服胰島素可以完好的地到達(dá)血流（Foss and Peppas,2004）。此外，低pH和蛋白酶介導(dǎo)的水解限制了完整胰島素的腸吸收（Aoki et al.,2005）和轉(zhuǎn)運(yùn)到體循環(huán)中。因此，為了開發(fā)有效的口服糖尿

5、病治療劑，保護(hù)胰島素抵抗胃腸環(huán)境是必要的。已經(jīng)開發(fā)了改善胰島素?cái)z取的方法，包括吸收促進(jìn)劑，化學(xué)修飾和納米膠囊或納米球中的包封。聚合物膠體系統(tǒng)在治療性蛋白質(zhì)的口服遞送中表現(xiàn)出一定程度的成功。 正在進(jìn)行許多研究以改善使用遞送系統(tǒng)的生物活性大分子的口服生物利用度。由天然聚合物，例如殼聚糖配制的納米顆粒（NPs）作為蛋白質(zhì)的載體是有利益的（Sarmento et al.,2007）。殼聚糖對(duì)于納米顆粒開發(fā)具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括生物相容性，生物降解性，低免疫原性和毒性（Agnihotri et al., 2004；Pandey et al., 2005）。殼聚糖的粘膜粘附性質(zhì)與其高正電荷密度有關(guān)（Plapi

6、ed et al.,2010）。因此，殼聚糖是藥物遞送到粘膜組織的理想物質(zhì)（Sayin et al., 2009）。殼聚糖主鏈上的許多游離胺基團(tuán)產(chǎn)生有利的性質(zhì)，允許在藥物遞送應(yīng)用中廣泛使用。在酸性環(huán)境中，納米顆粒自發(fā)形成，由于帶正電荷和帶負(fù)電荷的物質(zhì)之間的分子內(nèi)和分子間連接（Veis,2011），其形成聚電解質(zhì)復(fù)合物（復(fù)合凝聚）。這個(gè)過程基于自組裝的殼聚糖和胰島素納米顆粒，似乎有希望在不使用苛刻的有機(jī)化學(xué)品的情況下制備納米顆粒。通過離子對(duì)和靜電相互作用形成的納米顆粒保留聚合物完整性。包括胰島素在內(nèi)的蛋白質(zhì)的胃腸攝取可以通過包裹在納米顆粒中來改善，納米顆粒保護(hù)胰島素免于降解。這些載體具有改善的口

7、服肽遞送，這是由于它們?cè)谖改c道中的長(zhǎng)期保留和由游離氨基介導(dǎo)的對(duì)粘液層的良好滲透（Renukuntla et al.,2013）。正電荷可以與許多帶負(fù)電荷的表面反應(yīng)，包括細(xì)胞膜，粘液襯里中的唾液酸和陰離子聚合物。這些顆粒系統(tǒng)還對(duì)帶負(fù)電荷的大分子（Mohammadpourdounighi et al.,2010）顯示高親和力，例如粘膜表面上的粘蛋白。此外，它們被腸細(xì)胞吸收，腸吸收是主要的吸收途徑。然而，殼聚糖是非腸溶聚合物。因此，殼聚糖納米顆粒不能在胃環(huán)境中保護(hù)胰島素。在專利CA2522868（Belcourt et al.,2004）中提出了一種解決方案，其描述了基于含有保護(hù)腸中活性成分的納米顆

8、粒的胃阻力制劑的雙重包封系統(tǒng)。在以前的研究中，我們開發(fā)了適合于大鼠十二指腸特異性藥物遞送的腸溶膠囊（Reix et al.,2012），其可以填充胰島素-殼聚糖納米顆粒。在本研究中，我們?cè)u(píng)估了殼聚糖納米顆粒在腸道條件下保護(hù)胰島素的能力（Chaudhury and Das,2010）。然而，眾所周知，在含有磷酸鹽的環(huán)境中，復(fù)合凝聚是不穩(wěn)定的。因此，這些復(fù)合物用作藥物載體穩(wěn)定。與三聚磷酸鈉（TPP）的交聯(lián)和冷凍干燥可能是一個(gè)有利的解決方案。三聚磷酸鈉是具有三個(gè)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)的多價(jià)陰離子。該性質(zhì)使其能夠交聯(lián)殼聚糖（Rekha and Sharma,2009）。冷凍干燥是在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存不穩(wěn)定分子的

9、公認(rèn)方法，包括生物技術(shù)-藥物，例如蛋白質(zhì)和肽（Sameti et al.,2003）。納米顆?？梢栽谌哿姿徕c，殼聚糖和胰島素的混合物中通過三聚磷酸鈉磷酸酯和殼聚糖氨基之間的分子間和分子內(nèi)連接自發(fā)形成（Wu et al., 2005）。本研究試圖使用交聯(lián)和冷凍干燥法制備穩(wěn)定的胰島素負(fù)載的殼聚糖納米顆粒，并進(jìn)行體外和體內(nèi)生物效率的驗(yàn)證。2.材料和方法2.1.材料 超純的殼聚糖氯化物（CS Protasan UP CL113,75-90脫乙酰化，分子量70-150kDa）購(gòu)自Nova Matrix（FMC BioPolymer，德拉門，挪威）。商業(yè)人胰島素溶液（Umuline1 100IU / m

10、L）由Eli Lilly Pharma（Indianapolis，IN，USA）大量提供。由Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）提供人重組胰島素，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胰島素，三聚磷酸鈉溶液，D-甘露醇，異丙醇，胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，鏈脲佐菌素，24孔板（CELLSTAR1 organic Greiner） MO，USA）。用于高效液相色譜（HPLC）的化學(xué)品是液相色譜級(jí)。乙腈來自VWR（Fontenay-sous-Bois，F(xiàn)rance），無水硫酸鈉來自SDS（Peypin，F(xiàn)rance）。人腺癌細(xì)胞系Caco-2獲自ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，

11、VA，USA），RevHT29MTX細(xì)胞系由Dr.ThéclaLesuffleur（INSERM U505，Villejuif，F(xiàn)rance）提供。從Invitrogen（Cergy Pontoise，F(xiàn)rance）購(gòu)買改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM），抗生素和抗真菌劑，非必需氨基酸溶液，谷氨酰胺，磷酸鹽緩沖液（PBS）和Hanks平衡鹽緩沖溶液（HBSS）。碘化丙啶和膜聯(lián)蛋白-V試劑盒購(gòu)自Clinisciences（Nanterre，F(xiàn)rance）。2.2.納米顆粒制備 將殼聚糖氯化物CL113溶解于重蒸水（1mg / mL w/v）中。 在微量磁力攪拌（300rpm）下，通過注射器向

12、殼聚糖溶液（500mL）中滴加等體積的胰島素。 將混合物在室溫下緩慢攪拌下維持30分鐘以獲得標(biāo)準(zhǔn)（STD）納米顆粒。 交聯(lián)，將粉末溶解在重蒸水中來制備三聚磷酸鈉溶液溶液（27mM）。 三聚磷酸鈉溶液溶液（50L）引入到絡(luò)合介質(zhì)中并攪拌30分鐘（300rpm）以獲得交聯(lián)的納米顆粒。 在存在或不存在用作凍干保護(hù)劑的甘露醇的情況下，對(duì)天然或交聯(lián)的納米顆粒進(jìn)行過夜冷凍干燥。甘露醇直接溶在納米顆粒制劑（5mg / mL）中，然后冷凍干燥。 冷凍干燥后，將納米顆粒以目標(biāo)濃度分散在重蒸水中用于進(jìn)一步分析。2.3. 納米顆粒表征 納米顆粒的物理化學(xué)參數(shù)通過動(dòng)態(tài)光散射使用Malvern NanoZS（Malve

13、rn，Instruments，Worcestershire，United Kingdom）在25下在重蒸水中稀釋至1:500。通過從納米顆粒光散射強(qiáng)度的累積函數(shù)計(jì)算直徑來確定平均納米顆粒尺寸。還確定了全局表面電荷（電位）和多分散指數(shù)（PDI）。通過透射電子顯微鏡（TEM; Hitachi High Technologies Corporation，Tokyo，Japan）檢查形態(tài)。在離心納米顆粒分散體后測(cè)定包封效率（20,000×g，41小時(shí)）并通過高效液相色譜法定量上清液中沒有包封的藥物。該系統(tǒng)由兩個(gè)Prostar 210溶劑遞送系統(tǒng)，Prostar 410自動(dòng)進(jìn)樣器和Prosta

14、r 330光電二極管陣列（PDA）UV / vis檢測(cè)器（Varian，Les Ulis，法國(guó)）和Symmetry C18（4.6mm×250mm，5m，300A）柱（Waters，Milford，MA，USA）。洗脫液A由pH2.3的0.2M Na2SO4水溶液組成，洗脫液B是洗脫液A和乙腈（55:45，v / v）的混合物。流動(dòng)相由洗脫液A /洗脫液B（42:58，v / v）的混合物組成，流速為1mL / min。柱溫度保持在40，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。使用以下等式計(jì)算包載功效（EE）：EE（%）（胰島素的封裝量/胰島素的理論總量）×1002.3.1. 滲透壓計(jì)算 我

15、們使用以下Van't Hoff方程計(jì)算滲透壓（mmHg）： =(M /用于粒度測(cè)量的稀釋因子)×R×T其中M是溶解物質(zhì)的濃度（單位mol / L）。R是理想氣體常數(shù)（0.08206L atm mol -1 K -1）。T是在開爾文（293K）上表示的溫度。物種濃度：殼聚糖3.3×10-9M.胰島素3.01×10-4 M. 三聚磷酸鈉溶液1.28x10-3M. D-甘露醇0.027 M.2.4. 透射電子顯微鏡 使用在真空下的電碳沉積物使云母片親水化。將合成的納米顆粒（2mL）置于切片上1分鐘，并除去過量的懸浮液。鈾1的尿酸乙酯（1）加入到切片中，

16、1分鐘后取出。通過Tecnai G2 Sphera（FEI公司，Hillsboro，NC，USA）分析樣品。2.5.藥物釋放 在37緩慢攪拌下，與磷酸鹽緩沖液孵育預(yù)定時(shí)間：Tx = 0,0.25,0.5,1,2和4小時(shí)。在1280nm測(cè)量從納米顆粒釋放的胰島素的量。結(jié)果表示為胰島素濃度的增加百分比，如下：(胰島素 T0/ 胰島素 Tx)× 100。2.6.穩(wěn)定性測(cè)試制備 胃液（35mM NaCl，80mM HCl，pH 1.2）和腸內(nèi)培養(yǎng)基（50mM KH2 PO4，15mM NaOH，pH 6.8）。將納米顆粒與培養(yǎng)基在室溫下孵育預(yù)定量的時(shí)間：T0 = 0小時(shí)，Tx = 0.5,1

17、,1.5,2,4和7小時(shí)。在500nm（Abs）下測(cè)量樣品的光密度。結(jié)果表示為光密度的降低百分比，如下：(Abs.Tx/Abs.T0)×1002.7. 納米顆粒的生物驗(yàn)證2.7.1. 體外驗(yàn)證2.7.1.1.模型和細(xì)胞培養(yǎng)。 使用兩種細(xì)胞培養(yǎng)模型：Caco-2細(xì)胞和與75Caco-2和25RevHT29MTX細(xì)胞的共培養(yǎng)物，以獲得體外腸上皮模型，如Nollevaux et al. (2006)。 細(xì)胞培養(yǎng)如Reix et al. (2012)。 簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞接種（73000個(gè)細(xì)胞/ cm2）于補(bǔ)充有20胎牛血清，1抗生素 - 抗真菌溶液和1非必需氨基酸（10mM儲(chǔ)備溶液）的DMEM

18、中。 使細(xì)胞在含有5CO2的氣氛中在37下生長(zhǎng)21天以獲得腸細(xì)胞表型，并從第30代至第60代使用。將體外使用的納米顆粒冷凍干燥，并且結(jié)果表示為幾何平均值乘以熒光細(xì)胞的百分比。2.7.1.2. 殼聚糖的吸收 為了研究細(xì)胞中納米顆粒的攝取，如Reix等人所述進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù) （2012）。 將細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)21天，并與不含磷酸鹽緩沖液的改良伊格爾培養(yǎng)基中的異硫氰酸熒光素-胰島素負(fù)載的納米顆粒（10IU /孔）孵育4小時(shí)。 孵育后，用不含鈣和鎂的Hanks平衡鹽緩沖溶液溶液洗滌細(xì)胞3次（10分鐘），并通過胰蛋白酶消化，離心并在Hanks平衡鹽緩沖溶液中的懸浮分離。 懸浮后加入2L碘化丙啶和2L膜

19、聯(lián)蛋白V-APC用以評(píng)估細(xì)胞活力。 通過BD LSR II流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson and Company，Piscataway，NJ，USA）一式三份分析樣品，每孔記錄50,000個(gè)事件。 結(jié)果表示為熒光強(qiáng)度的幾何平均值乘以異硫氰酸熒光素標(biāo)記陽性細(xì)胞的百分比。2.7.2.體內(nèi)驗(yàn)證 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)歐洲健康指導(dǎo)委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物的護(hù)理和使用的實(shí)驗(yàn)程序（批準(zhǔn)號(hào)：AL / 60/67/02/13）進(jìn)行。將雄性Wistar大鼠（120-140g）置于具有調(diào)節(jié)溫度（23±1）室的房間中的標(biāo)準(zhǔn)集體籠中。將大鼠保持在12小時(shí)光照/ 12小時(shí)黑暗循環(huán)中，并喂以顆粒形式的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室嚙

20、齒動(dòng)物飲食（SAFE A04，Villemoisson-sur-Orge，F(xiàn)rance）。食物和水隨意獲得。通過腹膜內(nèi)單次注射鏈脲霉素（75mg / kg）誘導(dǎo)糖尿病。 3天后形成糖尿?。ㄑ?gt; 6g / L和C-肽<100pM）。糖尿病大鼠經(jīng)歷手術(shù)以植入腹膜內(nèi)（IP）和十二指腸（ID）導(dǎo)管。導(dǎo)管的近端皮下穿透以在頸部后部離開，并縫合。手術(shù)后兩天，通過十二指腸途徑向動(dòng)物施用10IU胰島素，通過腹膜內(nèi)途徑施用2IU胰島素。 納米顆粒生物功能通過在腹膜內(nèi)治療的大鼠中每30分鐘評(píng)價(jià)空腹血糖4小時(shí)，并且每小時(shí)治療12小時(shí)治療的十二指腸。2.8. 統(tǒng)計(jì)分析 使用Statistica版本10（

21、StatSoft，USA）和GraphPad Prism 4（USA）分析數(shù)據(jù)。 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。 所有數(shù)據(jù)通過單因素方差分析Tukey HSD檢驗(yàn)法，事后檢驗(yàn)進(jìn)行物理化學(xué)和體外分析。進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析測(cè)試用于體內(nèi)研究。 當(dāng)p <0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。3.結(jié)果3.1. 納米顆粒表征 標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒為412±7nm，電位為+36±1mV（表1）。 沒有甘露醇的冷凍干燥顯著增加了納米顆粒尺寸（490±26nm）和電位（+44±1mV）。用甘露醇凍干顯著減小尺寸至368±5nm和電位至+42±2mV。交聯(lián)的納米

22、顆粒為346±7nm，電位為+36±0.8mV。 具有或不具有甘露醇的冷凍干燥和交聯(lián)的組合保持了納米顆粒大?。ǚ謩e為313±2和326±19nm）和電位（分別為+42±1和+42±1mV）。 所有的納米顆粒具有小于或等于0.4的多分散指數(shù)。透射電子顯微鏡圖像顯示平滑和球形的納米顆粒，并且該形態(tài)在冷凍干燥后保留（圖1）。 高效液相色譜法測(cè)量表明標(biāo)準(zhǔn)和交聯(lián)的納米顆粒的截留效率分別為61和69（圖2）。表格1冷凍干燥和交聯(lián)過程對(duì)負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒的物理化學(xué)特性的影響。標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒交聯(lián)的納米顆粒冷凍干燥甘露醇凍干標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒交聯(lián)納米顆粒標(biāo)

23、準(zhǔn)納米顆粒交聯(lián)的納米顆粒尺寸標(biāo)準(zhǔn)差(nm)412±7346±7a490±26313±3a,b368±3a,b326±19b,c多分散指數(shù)0.3±0.060.31±0.040.4±0.080.3±0.060.3±0.070.3±0.05電位標(biāo)準(zhǔn)差(mV)+36±1+36±1+44±1a+0.3±1c+42±2a+43±1c 動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 應(yīng)用單因素方差分析Tukey法比較所有組。

24、 a.p < 0.05 與標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒比較. b.p < 0.05與不含甘露醇的冷凍干燥的納米顆粒比較。 c.p < 0.05 與冷凍干燥的具有甘露醇的納米顆粒比較。圖1.胰島素負(fù)載殼聚糖的透射電子顯微鏡。冷凍干燥前（A）和冷凍干燥（B）后裝載胰島素的殼聚糖顆粒的結(jié)構(gòu)。交聯(lián)顆粒具有相同的方面（未示出）。圖2.殼聚糖顆粒的包封效率。 包封的胰島素的高效液相色譜法定量（歐洲藥典方案），象形圖（）代表標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒，（）是用于交聯(lián)的納米顆粒。通過平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示顆粒，進(jìn)行t檢驗(yàn)（n = 3批合成）*p <0.001。3.2. 納米顆粒穩(wěn)定性測(cè)試 當(dāng)不同的納米顆粒制劑

25、在水中孵育7小時(shí)時(shí)，沒有觀察到光密度的變化（圖3）。納米顆粒立即溶解在模擬胃介質(zhì)中，不管配方法（圖3，紅色）。在模擬的腸介質(zhì)（圖3，綠色）中，標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒在1小時(shí)后迅速破壞，84在7小時(shí)溶解。相比之下，20的冷凍干燥的納米顆粒，有或沒有甘露醇，在30分鐘內(nèi)溶解。這些納米顆粒穩(wěn)定7小時(shí)。 圖3.模擬胃和腸介質(zhì)中殼聚糖顆粒制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)。（對(duì)于文本中對(duì)顏色的引用的解釋，讀者參考本文的web版本。） 通過在模擬介質(zhì)中隨時(shí)間推移濁度的演變進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)量。去離子水中顆粒的穩(wěn)定性表示為黑色，腸介質(zhì)為綠色，胃介質(zhì)為紅色。模式（）是用于非冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)或交聯(lián)的納米顆粒，（）用于冷凍干燥的納米顆粒和（）用于用

26、甘露醇納米顆粒冷凍干燥。結(jié)果以比率表示：通過測(cè)量的吸光度T0在Tx處測(cè)量的吸光度。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用方差分析（重復(fù)測(cè)量）以比較所有組，與去離子水相比，*p <0.05和*p <0.01，相對(duì)于冷凍干燥的納米顆粒腸介質(zhì)，#p <0.05和# p <0.01。3.3. 藥物釋放 無凍干標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)納米顆粒在37下在磷酸鹽緩沖液中孵育時(shí)立即倒轉(zhuǎn)（圖4）。當(dāng)顆粒冷凍干燥時(shí)，在磷酸鹽緩沖液中溫育15分鐘后釋放50包封的胰島素，4小時(shí)后釋放70。施用甘露醇的冷凍干燥時(shí)減少爆發(fā)釋放25并在4小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。圖 4.從殼聚糖顆粒釋放胰島素。通過紫外吸光法測(cè)量評(píng)價(jià)了在磷

27、酸鹽緩沖液中殼聚糖的藥物釋放。（）用于冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（）用于冷凍干燥交聯(lián)的顆粒，（）用于加入D-甘露醇冷凍干燥交聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（）用于加入D-甘露醇冷凍干燥交聯(lián)的顆粒，(; ) 分別為干燥納米顆粒（標(biāo)準(zhǔn)和交聯(lián)）。結(jié)果以百分比標(biāo)準(zhǔn)差表示，幾何平均值乘以熒光細(xì)胞的百分比。3.4. 使用Caco-2細(xì)胞的體外驗(yàn)證和共培養(yǎng) 與陰性對(duì)照相比，異硫氰酸熒光素-胰島素?zé)晒庠诩{米顆粒孵育后在Caco-2細(xì)胞和共培養(yǎng)物中增加。 在Caco-2細(xì)胞中，標(biāo)準(zhǔn)和沒有甘露醇的交聯(lián)冷凍干燥的納米顆粒都與細(xì)胞高度相關(guān)（圖5）。甘露醇誘導(dǎo)熒光的顯著降低。 在共培養(yǎng)（圖6）中，與具有或不具有甘露醇的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒相比，具有

28、或不具有甘露醇的冷凍干燥的交聯(lián)的納米顆粒是高度相關(guān)的。有趣的是，Caco-2細(xì)胞呈現(xiàn)比共培養(yǎng)物更高的熒光。這可以通過共培養(yǎng)物中粘液的存在來解釋。圖5.在Caco-2模型上負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒。 通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行相關(guān)熒光測(cè)量，每孔記錄50,000個(gè)事件，并且數(shù)據(jù)由Geo平均值乘以每個(gè)孔n = 3的熒光細(xì)胞的百分比（每n次9次測(cè)量）表示。 模式（）代表的陰性對(duì)照，（）代表冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（）代表冷凍干燥的交聯(lián)顆粒，（）代表具有D-甘露醇的凍干標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（）代表施用D-甘露醇的交聯(lián)顆粒。 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示，應(yīng)用單因素方差分析Tukey法比較所有組與陰性對(duì)照ap <0.

29、001，與凍干標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒bp <0.001，與凍干交聯(lián)的納米顆粒cp <0.001。圖6.在共培養(yǎng)模型上負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒。 通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行相關(guān)熒光測(cè)量，每孔記錄50,000個(gè)事件，并且數(shù)據(jù)由Geo平均值乘以每個(gè)孔n = 3的熒光細(xì)胞的百分比（每個(gè)n，9次測(cè)量）表示。 模式（）代表的陰性對(duì)照，（）代表冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)顆粒，（）代表冷凍干燥的交聯(lián)顆粒的，（）代表具有D-甘露醇的凍干標(biāo)準(zhǔn)顆粒的，() 代表施用D-甘露醇的交聯(lián)顆粒。 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示，應(yīng)用單因素方差分析Tukey法以比較所有組，與陰性對(duì)照ap <0.001，與冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒bp &

30、lt;0.05，與凍干交聯(lián)的納米顆粒cp <0.05。3.5. 納米顆粒毒性 與對(duì)照細(xì)胞（37）相比，在標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒孵育后觀察到細(xì)胞活力的顯著降低（表2）。具有甘露醇的冷凍干燥的納米顆粒降低細(xì)胞凋亡（23）。使用在存在或不存在甘露醇（分別為22和20）的情況下冷凍干燥的交聯(lián)的納米顆粒，也降低了凋亡。使用共培養(yǎng)模型，除了在甘露醇（17）存在下冷凍干燥的交聯(lián)的納米顆粒，沒有觀察到活力的降低。表2評(píng)價(jià)胰島素負(fù)載的殼聚糖顆粒對(duì)體外模型的毒性。陰性對(duì)照凍干用甘露醇凍干標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒納米顆粒交聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒納米顆粒交聯(lián)Caco-210063737779共培養(yǎng)1001009510083在流式細(xì)胞術(shù)中通過

31、逆染色與納米顆粒孵育細(xì)胞后評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，每孔記錄50,000個(gè)事件，并且數(shù)據(jù)以百分比n = 3（每個(gè)n，9次測(cè)量）表示。 數(shù)據(jù)以平均值表示，應(yīng)用單因素方差分析Tukey法比較所有組。 與陰性對(duì)照相比，p <0.001，與冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒相比，bp <0.001，與陰性對(duì)照相比，cp <0.001。3.6. 納米顆粒的腹膜內(nèi)施用 與接受鹽溶液的大鼠相比，納米顆粒的腹膜內(nèi)施用顯著降低糖尿病大鼠中的血糖（圖7A）。 包封的胰島素的效果類似于游離胰島素，并且發(fā)生在相同的時(shí)間范圍內(nèi)，在輸注后30分鐘檢測(cè)到血糖降低。 （圖 7B）使用曲線下面積（AUC）證實(shí)了這些結(jié)果，揭示了腹膜內(nèi)

32、施用后，游離胰島素和包封的胰島素具有相同的效果。圖7.腹膜內(nèi)施用負(fù)載胰島素的殼聚糖顆粒。給予單劑量的2UI游離胰島素或顆粒，并在定義的點(diǎn)測(cè)量大鼠血糖。（A）是血糖進(jìn)展的表示，（B）是曲線下面積的表示。模式(; )代表鹽水溶液給藥（n = 5），( ;) 代表游離胰島素給藥 (n = 5), (; )代表冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒（n = 7），（ ; ）代表冷凍干燥交聯(lián)的顆粒（n = 7），( ; )代表有D-甘露醇的冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒（n = 8）和(; )代表有D-甘露醇冷凍干燥交聯(lián)的顆粒（n = 7）。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤方差分析（單因素）（重復(fù)測(cè)量（A）表示。應(yīng)用Tukey比較所有組，與

33、陰性對(duì)照p <0.001。 3.7. 納米顆粒的十二指腸內(nèi)給藥 顆粒的十二指腸內(nèi)給藥誘導(dǎo)血糖顯著降低，而鹽溶液和游離胰島素沒有作用（圖8A）。曲線下面積的分析顯示，與游離胰島素相比，僅冷凍干燥的標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒通過十二指腸內(nèi)給藥具有降血糖作用（圖8B）。圖8.胰島素負(fù)載的殼聚糖顆粒的十二指腸內(nèi)給藥。施用單劑量的10UI游離胰島素或顆粒，并在定義的點(diǎn)測(cè)量大鼠血糖。（A）是血糖進(jìn)展的表示，（B）是曲線下面積的表示。模式(; )代表鹽水溶液給藥（n = 4）, ( ;) 代表游離胰島素給藥 (n = 3), (; )代表冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒（n = 6），（ ; ）代表冷凍干燥交聯(lián)的顆粒（n = 6）

34、，( ; )代表有D-甘露醇的冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)顆粒（n = 5）和(; )代表有D-甘露醇的冷凍干燥交聯(lián)顆粒（n = 6）。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤方差分析表示（重復(fù)測(cè)量（A）應(yīng)用Tukey法以比較所有組，與游離胰島素和標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒相比，ap <0.01，bp <0.01，與陰性對(duì)照相比，cp <0.05。4.討論 自組裝的納米顆粒是有效的藥物載體，但不能用于口服胰島素遞送。在本研究中，制備穩(wěn)定的自組裝的裝載胰島素的殼聚糖納米顆粒，通過交聯(lián)和冷凍干燥穩(wěn)定，并表征。我們進(jìn)一步證明了穩(wěn)定的納米顆粒在體外和體內(nèi)的生物效應(yīng)。冷凍干燥可以穩(wěn)定固有的不穩(wěn)定的膠體，但是誘導(dǎo)納米顆粒聚集，

35、因此增加納米顆粒尺寸，添加表面活性分子以減少表面能和效價(jià)仍然受歡迎。蔗糖已被用于在冷凍干燥期間抑制甲氧基聚（環(huán)氧乙烷）-聚（乳酸）納米顆粒的聚集（Zambaux et al., 1999）。在這項(xiàng)研究中，甘露醇被用作冷凍保護(hù)劑。甘露醇在納米顆粒周圍形成包膜，由此保持形態(tài)并在冷凍干燥過程中抑制聚集。鑒于甘露醇在負(fù)荷方面是中性的，其存在不改變納米顆粒的全局負(fù)荷，其保持高度陽性。甘露醇在冷凍干燥過程中可能會(huì)產(chǎn)生電荷，從而避免納米顆粒聚集。甘露醇是水溶性的，并且可以在分散過程中溶解以顯示納米顆粒表面負(fù)荷。軟化冷凍干燥過程的存在避免了顆粒不穩(wěn)定并且減少了爆裂釋放現(xiàn)象。三聚磷酸鈉溶液用于通過增加靜電相互作用質(zhì)量來提高納米顆粒穩(wěn)定性。選擇三聚磷酸鈉溶液作為聚陰離子交聯(lián)劑，因?yàn)樗菬o毒的并且在與殼聚糖接觸時(shí)立即凝膠（De Moura e