常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介

1、常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介公司標(biāo)準(zhǔn)化編碼QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介（一）分子中含有瘦基或可竣化的半抗原的偶聯(lián)）1、混合酸酉干法,也稱氯甲酸異丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶聯(lián)時(shí)，半抗原分子中的竣基可與氯甲酸異丁酯在有機(jī)溶劑中形成混合酸酎 （mixed acid anhydride）,然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵。氨甲喋吟（MIT）與B -半乳糖昔酶偶聯(lián)的混合好法1、5. 8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷卻至10度，加2ul氯甲酸異丁酯，10 度攪拌反應(yīng)30分鐘。2、酶用 2ml 5

2、0 m mol/L Na2c03 溶解。3、10度反應(yīng)4小時(shí)（必要時(shí)加NaOH,以維持溶液的pH為,q然后4度過夜。4、過 sephadex G-25 層析柱，柱用含 aCl 100m mol/L、MgC12 10 m mol/L、2-疏基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸緩沖液平衡和洗脫，合并含酶 的洗脫管內(nèi)液體，進(jìn)一步純化后，保存于含BSA % （w/v）、NaN3 %（w/v）的緩 沖液中。碳化二亞胺法制備3, 3, 5-三碘甲腺氨酸-血藍(lán)蛋白免疫原的操作步驟1、?flX EDC lOOmg ,用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、？?取3,

3、 3, 5-三碘甲腺原氨酸25mg ,用L NaOH溶液2ml溶解（II液）3、？取血藍(lán)蛋白（lemocyanin） 25mg,溶于 10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、？?將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液（余下）5、？?室溫下避光攪拌1小時(shí)，逐滴加入余下的I液6、？?4度攪拌12小時(shí)7、?靜置10小時(shí)（4度）8、？?有蒸謫水使之充分透析（約48小時(shí)），得免疫原。孕酮與與B -半乳糖甘酶偶聯(lián)的N-羥琥珀酰亞胺酯法1、？?用二堊烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成濃度為100m mol/L 的溶液。2、?加羥琥珀酰亞胺（N-hydroxysucci

4、nimide） 100 m mol/L 和 DCC （二環(huán)已 基碳化二亞胺），200 m mol/L, 4度反應(yīng)16小時(shí)。3、？?用簿層掃描方法純化（氯仿：水二9： 1）4、？?按孕酮/酶摩爾濃度比約為10的比例，將上述溶液加入到酶液（用，濃 度50 m mol/L的磷酸緩沖液溶解）中。5、?（二）含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)芳香胺類半抗原與蛋白質(zhì)重氮化偶聯(lián)的操作步驟1、?用mol/L HC1溶液配制4 m mol/L濃度的半抗原。2、？?滴加l%aN02（過量），4度持續(xù)攪拌。NaN02的加入量可用淀粉-碘 化物試紙或在白色磁磚上加1%淀粉和50nl mol/L KI進(jìn)行監(jiān)控。游離亞硝酸

5、可 將氧化物氧化成碘，碘再與淀粉反應(yīng)變成藍(lán)黑色。3、？?溶液變成藍(lán)黑色后，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。4、？?用、濃度為200m mol/L的硼酸或碳酸緩沖液溶解蛋白。5、？?邊攪拌，邊加入重氮化的半抗原(防止局部發(fā)生酸過量現(xiàn)象)，調(diào) 節(jié)pH到。6、？?冰箱中攪拌反應(yīng)2小時(shí)，不斷調(diào)節(jié)pH至上7、？?用PBS透析2天8、？?-20度保存(濃度為20mg/mL)雙功能的酰亞胺酯(imidate esters)可以氨基反應(yīng)，形成瞇。例如：用二 甲基已二酰亞胺酯(dimethyladipimide)將去甲基三正喋吟 (desmethylmortriptyl ine)與 B -半乳糖甘酶偶聯(lián)。應(yīng)用雙功能酰亞胺酯(

6、imidate esters)制備去甲基三正喋吟-與B 一半乳糖昔酶標(biāo)記特的操作步驟1、？?用含5% (W/V) N-乙基嗎咻的無水中醇,在室溫下溶解570ug去甲基 三正喋吟和488ug二甲基已二酰亞胺酯(dimethyladipimide) (A液)2、？?取與F-半乳糖昔酶100 ug,溶于的100 m mol/L碳酸緩沖液(含 MgC12 10m mol/L, 2-疏基乙醇 10 m mol/L (B 液)3、？?將人液倒入B液。4、？?20 度反應(yīng) 90 分鐘后，加含 NaCl 100 m mol/L, MgC12 10 m mol/L 和2-疏基乙醇10 m mol/L、的Tris

7、-醋酸緩沖液(50m mol/L) lml,終止反 應(yīng)。5、？?過sephadex G-25,去除小分子物質(zhì)，得酶標(biāo)記物(約75%的酶與 半抗原結(jié)合，但用三正喋吟代替去甲三正喋吟(demethylmortriptyline )進(jìn)行 偶聯(lián)，則只有15%的酶與之結(jié)合。(三)含疏基半抗原的偶聯(lián)可用馬來酰亞胺方法與蛋白偶聯(lián)。此外，將我體蛋白用濱乙酰胺 (bromoacetamide)激活?；?qū)⑤d體蛋白與半抗原在的醋酸緩沖液中，通過過氧 化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上。(四)含羥基的半抗原偶聯(lián)醇類羥基通過形成半琥珀酸酯轉(zhuǎn)化為竣基的操作步驟1、?15g 2, 2, 2-三氯乙醇(2

8、, 2, 2-trichloroethanol) , 12g 琥珀酸酉千 (succinic anhydride)和 三乙基胺(triethylamime)用 100 ml 乙酰乙酯溶 解。2、？?加熱回流1小時(shí)。3、？?減壓蒸飾去溶劑，殘余物用5% aHC03水溶液溶解。4、？?用乙醛洗滌兩次，然后用H2s04進(jìn)行s酸化(pH到).5、？?用水洗滌固形物(為三氯乙基半琥珀酸酯)兩次，用氯仿-已烷使其 結(jié)晶(產(chǎn)量約75%,熔點(diǎn)88-89度)6、?取 半琥珀酸酯溶于 亞硫酰氯(thionyl chloride)中,65度加熱30 分鐘。7、？?減壓蒸發(fā)，干燥1小時(shí)(高度真空條件下)。8、？?將上

9、述產(chǎn)生(2, 2, 2-三氯憶基琥珀酰氯)溶于15ml X,2二甲基- 乙酸乙酰胺（N, N-dimethylethylacetamide）中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。9、？?65度真空蒸發(fā)后，用異丙醇使結(jié)晶析出來（得鹽酸化的結(jié)晶-5- 酯約84%,熔點(diǎn)160度）。10.用溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離三氯乙酯，得f半抗原-半琥 珀酸酯，這樣引和的竣基可與蛋白質(zhì)偶聯(lián)（如用碳化二亞胺化）。半抗原用NaI04氧化其中的糖昔醇后再與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的操作步驟1、?20mg腺昔溶于lml 100m mol/L NaI04溶液中，4度避光反應(yīng)30分 鐘。2、？?加1滴乙二醇（得A液）3、?將人液加入到半乳糖昔酶

10、液（20mg/ml, ffl 150m mol/L NaCl, 10m mol/L MgC12水溶液溶解，用3%K2c03調(diào)節(jié)pH至）中4、？?4度反應(yīng)2小時(shí)，期間不斷調(diào)節(jié)5、？?力口入臨時(shí)配制的50 mg/ml N&B04溶液，用量為反應(yīng)體積的1/10。 4 度反應(yīng)過夜。6、？用含有 MgC12 10m mol/L, 2-疏基乙醇 10 m mol/L. NaCl 100 m mol/L的50 nl mol/L磷酸緩沖液透析（更換透析液數(shù)次）（五）含酮基或酮基半抗原的偶聯(lián)是將酮基經(jīng)羥胺類化合物處理變成的類化合物，再進(jìn)一步將后類化合物中 的羥基，衍變成竣基化合物，再進(jìn)一步進(jìn)行含按基半抗原的偶聯(lián)

11、操作。這類羥 胺類化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid或竣甲氧胺 carboxymethoxyl amine 或者鹽酸羥胺酮基的類固醇分子中引入竣基的操作步驟1、？?在200ml乙醇中，加入0-（按甲基）羥胺（0-（carboxyl） hydroxylamine）和酮基半抗原,使其濃度分別為10m mol/L和4nl mol/L2、？?加熱回流90分鐘3、？?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減少容積，然后加水至40ml,用乙醛抽提4、？?用水洗滌乙酸抽提物，用2s04干燥成白色粉末。（六）、其他半抗原的偶聯(lián)雖含有游離基團(tuán)，但因這些基團(tuán)對于維其生物活性十分重要，因些不能直 接用來與載體蛋白偶聯(lián)

12、。制備雌二醇-6-用的操作步驟a、？?雌二醇二醋酸鹽的制備1、?lg雌二醇溶于14ml-咤及醋酉干中2、？?加熱回流1小時(shí)，冷卻后傾入冰水中。3、？?收集白色晶體，得產(chǎn)物約（熔點(diǎn)126到127度）b、？?雌二醇-6-酮-二醋酸鹽的制備4、雌二醇二醋酸鹽，滴加冰醋酸溶解后加含Cr03的含水冰醋酸 （H20:Hac=：5、室溫?cái)嚢?小時(shí)，靜置24小時(shí)6、用水稀釋，用乙醛提取4次7、用蒸儲水洗2次8、減壓蒸馀，得結(jié)晶油狀渣物。9、用90度烘干20分鐘，得粗制品約500mg10、m 11ml無水乙醇溶解粗制品，再加冰醋酸及吉納你特T試劑(Girad T),回流1小時(shí)。11、冷卻后，用冰致冷的蒸儲水稀釋

13、，用LaOH調(diào)節(jié)pH至12、用乙醛抽提3次，棄去乙醛。13、水層用濃鹽酸酸化(鹽酸終濃度為lmol/L).14、室溫靜置2小時(shí)。15、用乙醛抽提3次。16、合并乙醛抽提液，用L碳酸鈉溶液洗1次，用蒸儲水洗3次。17、用無水硫酸鈉脫水，蒸干。18、加7ml酷酊，回流20分鐘。19、冷卻后傾入用冰致冷的蒸儲水中，然后過濾、干燥得產(chǎn)物約176mg (熔點(diǎn)為162-166度)c、？?二醇-6-酮的制備20、m 20%的氫氧化鉀-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸鹽 (176mg),在室溫下于氮?dú)庵兴?4小時(shí)。21、加蒸儲水稀釋，用乙醛抽提3次。22、在乙醛提取液中無水硫酸鈉進(jìn)行脫水，蒸發(fā)干燥，得產(chǎn)物約60mg(熔 點(diǎn)為278-282度)d、？?雌二醇-6-胎的制備23、取雌二醇-6-酮50mg