ChIP實驗的原理與實踐(共3頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一、原理轉(zhuǎn)錄從基因的啟動子區(qū)開始，由一系列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到基因的啟動子區(qū)，通用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在基本啟動子區(qū)起始轉(zhuǎn)錄，而這個過程對基因的轉(zhuǎn)錄是必需的，但不是充分的，通常需要一些特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在上游調(diào)節(jié)序列，使基因特異表達并維持的合適水平，ChIP主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子（個人認為主要是特異轉(zhuǎn)錄因子的作用，因為這些因子的表達才有時空特異性）與下游基因的結(jié)合，如果ChIP發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子能與目的基因結(jié)合，那么這說明該基因可能是其下游基因，要想進一步證明，還要做高低表達和熒光素酶等實驗。二、目的基因的篩選1，如果做ChIP-seq那就不需要在實驗前篩選目的基因了，理論上芯片會分析出

2、樣本中該轉(zhuǎn)錄因子所有的下游基因，我們根據(jù)這個分析結(jié)果進行篩選就可以了。2、如果是做普通的ChIP，那么在實驗前要進行初步的篩選，選擇自己感興趣的目的基因，設(shè)計PCR引物，進行驗證，所以，這樣考慮的話，ChIP實驗是對你的早期數(shù)據(jù)的驗證。個人認為，篩選目的基因的方法有一下幾種：a，查文獻，看轉(zhuǎn)錄因子和哪些基因在表達時間，空間，及功能相關(guān)。b，你的課題設(shè)計中涉及到的基因，比如說你課題中設(shè)計到c-myb基因，你就想看一下轉(zhuǎn)錄因子和c-myb的關(guān)系（這個純屬碰運氣）。c，根據(jù)自己早期的實驗結(jié)果，比如，你做高、低表達后，發(fā)現(xiàn)你的轉(zhuǎn)錄因子表大變化后，一些基因的表達也發(fā)生了變化，那么這些基因可以作為候選基因

3、。3、另外篩選完自己感興趣的基因后，可以用一些分析工具進行初步的預測，這個網(wǎng)上也可以搜到，就不羅嗦了，如果有戰(zhàn)友需要，可以再討論。三、實驗設(shè)計這里只說說實驗各組的作用1.input：樣本經(jīng)過超聲，但是沒有進行ChIP，包含樣本超聲后總DNA，可以進行電泳，檢測超聲效果，同時，可以與最后ChIP樣本進行比較，看ChIP的效率（如果用同一引物進行PCR，ChIP組和input組亮度差不多，說明ChIP效率高，基本上，樣本中所有的目的基因片段都被ChIP下來了，反之，說明效率低，實驗條件有待改進）2、陽性對照：一般用anti-RNA Polymerase II抗體，因為RNA Polymerase

4、II是通用轉(zhuǎn)錄因子，在所有細胞中都能結(jié)合基因（當然是在該細胞中表達的基因，所以為了保證陽性對照有效，一般選擇陽性對照的引物是根據(jù)管家基因設(shè)計的）的核心啟動子區(qū)，因此，理論上ChIP后PCR都會有條帶3、陰性對照：用普通的IgG做為抗體，理論上不會ChIP下來任何DNA片段，因此作為陽性對照，但是由于非特異結(jié)合，或者實驗過程中，沒發(fā)生結(jié)合的DNA清除不完全，可能也會出現(xiàn)條帶，個人認為這組最理想的結(jié)果當然是沒有條帶，但是如果有一條淡淡的條帶（與陽性對照和目的基因組相比），也是不妨礙的。4、實驗組，這個就不多說了就是用自己感興趣的轉(zhuǎn)錄因子去檢測感興趣的基因四、引物設(shè)計1、ChIP檢測的是轉(zhuǎn)錄因子與基

5、因啟動子區(qū)的結(jié)合情況，因此引物設(shè)計要選擇目的基因啟動子區(qū)，ChIP試驗中啟動子區(qū)一般選在轉(zhuǎn)錄起始位點上游1000bp的DNA片段（或者為了保險些選在2000bp），因為一般情況下，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在這個區(qū)域，當然也有結(jié)合在更上游，或者有的文獻報道在轉(zhuǎn)錄起始位點下游也有結(jié)合，我們就不能一一考慮這些有點特殊的情況了，我實驗的時候選擇的是轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp的片段2、引物設(shè)計原則跟普通的引物相同，但是，超聲后DNA被打斷，所以PCR產(chǎn)物要盡量短一些，100多bp就足夠了，因為產(chǎn)物長度越長，這段DNA被打斷的可能性就越大，P出來的可能性就越小五、固定與超聲個人認為雖然固定和超聲只是樣本的準備，但這步是實驗成功的關(guān)鍵，也是出來漂亮結(jié)果的關(guān)鍵。不同的儀器，超聲的條件差別很大，所以不能單純的按照說明書來做，要根據(jù)自己的儀器，摸索適當?shù)臈l件，另外，個人感覺超聲時樣本的體積不宜過大，體積過大超聲容易不均勻，效果不理想，400ul左右就完全可以（這個跟超聲儀探頭的直徑也有關(guān)系）六、ChIP這是實驗的主體