董曉明畢業(yè)設(shè)計(jì)

1、SHANDONG畢業(yè)論文赤霉素（GA3）蛋白核小球藻油脂積累的影響研究 學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院專 業(yè)：生物技術(shù)學(xué)生姓名：董曉明 學(xué) 號：1011073006指導(dǎo)教師：孟春曉老師 2014年6月摘要論文初步研究了一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻生長和總脂積累的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了6個質(zhì)量濃度梯度的GA3 (0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L)對蛋白核小球藻誘導(dǎo)處理后進(jìn)行培養(yǎng)。在此階段中，定期取樣進(jìn)行吸光度值測定，然后繪制生長曲線來觀察每個濃度梯度下小球藻的生長情況。當(dāng)藻生長至一定濃度時(shí)用氯仿-甲醇提取法進(jìn)行總脂含量的測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：濃

2、度為10mg/L和15mg/L的赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻總脂含量的積累有促進(jìn)作用；20mg/L的赤霉素（GA3）實(shí)驗(yàn)組的總脂含量積累有抑制作用，油脂產(chǎn)量明顯低于未添加赤霉素的藻液。赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻總脂含量的積累有促進(jìn)作用；且隨實(shí)驗(yàn)組添加赤霉素（GA3）濃度的增加，其對蛋白核小球藻總脂含量積累的促進(jìn)作用在減小。其中，15mg/L實(shí)驗(yàn)組的總脂含量最高，比對照組提高了12.60%，是對照組的1.40倍。綜合分析得出在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的激素濃度梯度內(nèi)誘導(dǎo)濃度為15mg/L的赤霉素（GA3）的實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)作用最大，總脂含量最高，最適合作為產(chǎn)油藻進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：生物質(zhì)能，蛋白核小球藻，

3、GA3，油脂含量Abstract：The paper preliminary studied on the impact of the GA3 within a certain range of concentration on the chlorella pyrenoidosa growth and total oil accumulation. The experiment set (0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L) 6 ranges of GA3 gradient of chlorella pyrenoidosa induced, the

4、n cultured. And regularly sampling for determination of the absorbance value. When the algae growth reached to a certain concentration to determined total lipid content by chloroform - methanol extraction method. The results: Concentration of 15 mg / L (GA3) role in promoting the chlorella pyrenoido

5、sa accumulation of the total lipid content; inhibited the accumulation of the total lipid content of 20 mg / L (GA3), the experimental group, and the inhibitory effect is obvious lower than the blank control groups. GA3 can promote the accumulation of the total lipid content of chlorella p

6、yrenoidosa. Increase of the concentration of GA3 and added with the experimental group, in reducing its role in promoting the accumulation Chlorella pyrenoidosa total lipid content.15 mg / L total lipid content of the experimental group, 12.6% higher than the control group, 1.40 times that of the co

7、ntrol group. Comprehensive analysis of the hormone concentration gradient in the experimental set-induced concentration of 15 mg / L of GA3, the experimental group to promote the role of the largest, highest total lipid content, the most suitable for industrial production as the oil-producing a

8、lgae.Key words: biomass chlorella pyrenoidosa GA3 grease content目 錄摘要IAbstract：II目 錄1第一章 引言11.1課題的背景和意義1能源危機(jī)和生物質(zhì)能1微藻產(chǎn)油技術(shù)與生物柴油2研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景21.2 蛋白核小球藻及其應(yīng)用31.3 赤霉素（GA3）及其作用機(jī)理4赤霉素（GA3）41.3.2 GA3作用機(jī)理4第二章 材料與方法52.1 蛋白核小球藻的培養(yǎng)52.1.1 藻種52.1.2 藻種培養(yǎng)52.2 實(shí)驗(yàn)材料62.2.1 藥品與試劑62.2.2 儀器和實(shí)驗(yàn)用具62.3 實(shí)驗(yàn)方法62.3.1 蛋白核小球藻的激素誘導(dǎo)62

9、.3.2 實(shí)驗(yàn)藻的培養(yǎng)及培養(yǎng)條件62.3.3 蛋白核小球藻細(xì)胞生長標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定72.3.4 蛋白核小球藻生物量的測定72.3.5 蛋白核小球藻細(xì)胞的富集收集72.3.6 蛋白核小球藻總脂含量的測定7第三章 結(jié)果與討論93.1 GA3對蛋白核小球藻總脂含量積累的影響93.2 進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的選擇參考分析9第四章 結(jié)論104.1 赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻總脂含量的累影響：104.2對工業(yè)化生產(chǎn)提供的參考：10參考文獻(xiàn)：10致謝12附錄13總脂含量測定數(shù)據(jù)13第一章 引言1.1課題的背景和意義能源危機(jī)和生物質(zhì)能近年來,由于工業(yè)的迅猛發(fā)展和人口數(shù)量的不斷增長,各種化石燃料的使用量迅速增長,導(dǎo)致

10、大氣被污染得更加嚴(yán)重。而全球范圍內(nèi)的化石能源儲備正在迅速減少，石油需求量則以每年1%的速度增長。根據(jù)國際能源機(jī)構(gòu)的預(yù)測，到2050年，世界人口將增至101108，一次能源需要量將會達(dá)到821012MJ,并且其中對于石油的需求將占到30%，即2.461012MJ。全球的天然氣需求量則以每年1.8%的速度遞增，占總能源需求量的22%。從21世紀(jì)初到現(xiàn)在，在世界范圍內(nèi)爆發(fā)了第三次以石油、煤炭為主的“能源危機(jī)”。地球上最豐富的碳源來源渠道就是來源于化石燃料燃燒和排放的煙氣,即便只有10%的二氧化碳經(jīng)過多重途徑回收和利用,它所提供的碳源將是非常巨大的。煤炭的需求增長量則是最高的，以每年2%的速度增長。然

11、而，地球上貯存的化石能源是有限的，總會有消耗殆盡的時(shí)候，在這種情況下，新型能源的推廣顯得尤為重要。生物質(zhì)能作為一種新型的清潔能源，其本身的開發(fā)利用得到了更為廣泛的關(guān)注。生物質(zhì)能即為生物能源。而生物質(zhì)本事指通過光合作用而形成的各種有機(jī)體，大部分為動植物和微生物。生物質(zhì)能是太陽能以化學(xué)能形式貯存在生物質(zhì)中的能量形式，以生物質(zhì)為載體能量。生物質(zhì)能具有以下優(yōu)點(diǎn)：生物質(zhì)原料可再生，具有多樣性和廣泛性的特點(diǎn)，資源開發(fā)潛力十分巨大；生物質(zhì)的揮發(fā)成份含量高，易燃燒，能量利用率高；生物質(zhì)是低碳燃料，燃用時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳，可被等量生長的植物光合作用所吸收，實(shí)現(xiàn)溫室氣體的“零”排放可以緩解日益嚴(yán)重的“溫室效應(yīng)”；生

12、物質(zhì)的S、N含量少，供能時(shí)可大幅減少對環(huán)境造成的污染；生物質(zhì)燃燒后灰分少，并且不易黏結(jié)。生物質(zhì)能是世界上最為廣泛的可再生能源，也是未來最重要的替代能源之一。藻類作為數(shù)量群龐大的生物質(zhì)，成為了生物能源載體的研究熱點(diǎn)。而利用微藻生產(chǎn)生物能源具有以下獨(dú)特的優(yōu)勢：微藻數(shù)量龐大，光照下能有效地利用太陽能，通過光合作用固定C02，同時(shí)能將無機(jī)物轉(zhuǎn)化為油脂、高不飽和烷烴、氫等能源物質(zhì)：同時(shí)微藻所需要的能量要求低，投資小，不占耕地，易于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)：微藻生物能源為可再生能源，燃燒后并不會污染大氣，不會產(chǎn)生有害氣體。因此利用微藻進(jìn)行生產(chǎn)生物能源具有很高的潛在應(yīng)用價(jià)值。微藻產(chǎn)油技術(shù)與生物柴油海洋生物質(zhì)能3是指海

13、洋植物利用光合作用將太陽能以化學(xué)能的形式貯存于體內(nèi)的能量形式，其主要來源為海洋藻類，包括海洋微藻和大型海藻等。由于海洋微藻生物質(zhì)能開發(fā)具有生長速度快，能大量積累脂質(zhì)，具有減排效應(yīng)，可高值化綜合利用（可開發(fā)的高值產(chǎn)品包括蝦青素、活性蛋白、活性多糖、不飽和脂肪酸、天然色素、生物肥料和餌料等）等特點(diǎn)和優(yōu)勢，海洋微藻生物質(zhì)能的研究一直是國際生物質(zhì)能研究的重點(diǎn)。微藻生物柴油可以解決當(dāng)下很多問題，譬如解決目前使用植物原料發(fā)展生物柴油面臨的耕地不足，氣候變化對產(chǎn)量的影響以及農(nóng)作物價(jià)格周期性變化以及上漲等問題。綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，如果能培育出高繁殖力、短生長周期的能用于工業(yè)使用的微藻，便可比陸生植物產(chǎn)油高出幾

14、十倍。利用藻類制造生物柴油是一種可再生的新型能源，可大大提高資源的利用，也是一種對不可再生能源的一種保護(hù)，為后代造福。因此得到越來越多的關(guān)注，甚至有一些學(xué)者認(rèn)為微藻是解決能源與環(huán)境問題的終極出路。微藻生物柴油生產(chǎn)的成套技術(shù)涵蓋多個技術(shù)環(huán)節(jié), 是個復(fù)雜的系統(tǒng)工程, 主要包括: 篩選和培育生長快含油率高的優(yōu)良藻株、大規(guī)模培養(yǎng)獲得可觀的微藻生物量、將采收的微藻制成微藻生物柴油及其他產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)綜合利用等3。微藻具有光合效率高、零凈碳值、易培養(yǎng)、生長周期短、油含量高等優(yōu)點(diǎn)8、14、15，是一種極具前景的生物柴油大宗原料，近年已引起各國政府和學(xué)者的高度關(guān)注。生物柴油(脂肪酸甲酯) 是一種已經(jīng)得到證明的燃料,

15、 以其為可再生性的環(huán)保燃料能源而得到世界的廣泛關(guān)注2。目前，生物柴油是以動植物的脂肪酸為原料來生產(chǎn)的，而不是微藻，但是這并不能滿足當(dāng)下車用燃料的需求，僅僅可以代替極小一部分的化石燃料。但是利用微藻生物來制造柴油，他們的產(chǎn)油量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于最好的油料作物。于是近年來,微藻產(chǎn)油技術(shù)4開發(fā)得到了全球性的廣泛關(guān)注,成為生物技術(shù)、生物質(zhì)能研究以及能源和環(huán)境領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。微藻產(chǎn)油技術(shù)集成了微藻培養(yǎng)、微藻減排、微藻高值化產(chǎn)品以及生物柴油制備等多項(xiàng)技術(shù)。但是由于微藻的產(chǎn)油開發(fā)存在缺乏優(yōu)良產(chǎn)油藻種與高效低成本的培養(yǎng)模式、培養(yǎng)肥料和能耗過高、產(chǎn)品附加值低等關(guān)鍵技術(shù)問題，目前全世界還沒有一家企業(yè)或機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)油技術(shù)的

16、產(chǎn)業(yè)化。只有利用選育出的優(yōu)良藻種,建立改良的開放式培養(yǎng)技術(shù),通過利用廢水廢氣有效降低培養(yǎng)成本,以微藻產(chǎn)品的高值化利用為動力,才能有望突破微藻產(chǎn)油的產(chǎn)業(yè)化瓶頸。研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景全球的生物質(zhì)能源相當(dāng)豐富，每年經(jīng)光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)月1700億噸，其能量相當(dāng)于世界主要燃料貢獻(xiàn)的10倍，而作為能源的利用量卻不到總量的1%6，因此開發(fā)潛力巨大。目前我國的生物質(zhì)能產(chǎn)業(yè)起步較晚，但也已經(jīng)初具規(guī)模，積累了一些比較實(shí)用的經(jīng)驗(yàn)，但是相比于發(fā)達(dá)國家來說，還是比較欠缺。生物質(zhì)能開發(fā)利用技術(shù)成為世界重點(diǎn)研究課題之一，許多國家都制定了相應(yīng)開發(fā)研究計(jì)劃，我國在生物質(zhì)能的應(yīng)用技術(shù)方面的研究，從“六五”計(jì)劃就開始設(shè)立了研究課

17、題，進(jìn)行重點(diǎn)攻關(guān)，主要在氣化、固化、熱解和液化等方面開展研究和開發(fā)工作。而世界各國對于生物質(zhì)能源的開發(fā)和利用只會越來越關(guān)注，投入的開發(fā)力度也將會越來越大，生物質(zhì)能源在全球能源結(jié)構(gòu)中所占的比重也會越來越大，生物質(zhì)能源必將成為21世紀(jì)新型能源的主宰。1.2 蛋白核小球藻及其應(yīng)用本文論述的選用的實(shí)驗(yàn)用藻為蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa），是由澳大利亞昆山大學(xué)微藻研究所提供。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)擴(kuò)繁并培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。通過對蛋白核小球藻的誘變和培養(yǎng)：研究不同質(zhì)量濃度的GA3對蛋白核小球藻誘變，通過生長曲線以及油脂的提取、測定，從而確定GA3對蛋白核小球藻生長和產(chǎn)油的影響以及確定最佳質(zhì)

18、量濃度。小球藻(Chlorella pyrenoidosa)隸屬于綠藻門(chlorophyta)、小球藻屬(chlorella),是一種世界性分布的一種球形單細(xì)胞淡水藻類，直徑38微米，是地球上最早的生命之一，分布極廣。它是一種高效的光合自養(yǎng)型生物，其光合作用十分高效。小球藻繁殖能力極強(qiáng)，蛋白質(zhì)含量50%左右，超過很多高蛋白食物，如牛肉、大豆等。而小球藻本身蛋白質(zhì)來源則是通過光合作用利用太陽能合成的；小球藻還含有碳水化合物10%25%，不飽和脂肪酸10%30%、豐富的多種維生素，并含有8種必需氨基酸，及鐵、鋅、鈣、鉀等礦物質(zhì)。另外，在近期的研究中，生長因子（CGF）也在小球藻中被發(fā)現(xiàn)，它能促

19、進(jìn)機(jī)體，增強(qiáng)人體免疫力，特別是兒童及老年人體質(zhì)，具有極好的效果。而小球藻本身的高油脂積累量則對于研究如何將其轉(zhuǎn)為生物柴油生產(chǎn)原料具有關(guān)鍵作用。已有的研究表明: 大部分微藻細(xì)胞大量積累油脂發(fā)生在細(xì)胞分裂受阻或抑制, 而碳繼續(xù)被細(xì)胞固定同化的情況下( 如氮短缺等逆境條件) 9-12 , 此時(shí)細(xì)胞含油率迅速增長但細(xì)胞數(shù)目增長緩慢(如處于穩(wěn)定期的微藻) , 這致使總生物量增長減緩進(jìn)而制約了總油脂生產(chǎn)量的提高 5, 7, 9, 13。目前，因?yàn)樾∏蛟宓臓I養(yǎng)價(jià)值較高，關(guān)于小球藻研究多集中在保健品方面，還沒有具體實(shí)驗(yàn)將小球藻的油脂積累和工業(yè)生物柴油連接起來。因此，因此研究蛋白核小球藻生長的環(huán)境因子（不同質(zhì)量

20、濃度梯度的激素）對縮短小球藻代時(shí)、增加油脂積累量、提高生長速率、實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)十分關(guān)鍵。1.3 赤霉素（GA3）及其作用機(jī)理赤霉素（GA3）赤霉素，俗稱九二零，具有赤霉烷骨架，能刺激植物細(xì)胞分裂和伸長的一類化合物的總稱，是植物界大量存在的植物激素，廣泛分布在植物的各個部分,其中應(yīng)用最廣泛的就是GA3。赤霉素具有促進(jìn)種子萌發(fā)和植物生長的作用，能使植物細(xì)胞伸長以及分裂、葉片增大，莖伸長，可以使植物提早成熟，并且可以改變植物的品質(zhì)和增加產(chǎn)量。此外，赤霉素能刺激多種植物產(chǎn)生的單性果實(shí)，還可以促進(jìn)坐果1。赤霉素同時(shí)可以打破植物休眠，減少植物器官的脫落，提高果實(shí)的結(jié)實(shí)率，亦或者形成無籽果實(shí)，在蔬菜上應(yīng)用的

21、較多。同時(shí)赤霉素還能影響植物的開花，還能改變一些植物的雄雌比率，能使某些二年生的植物在當(dāng)年開花。 GA3作用機(jī)理GA3與植物的耐熱性、耐鹽性、發(fā)芽率、耐冷性、重金屬脅迫、生物脅迫等都有很密切的關(guān)系, 但其誘導(dǎo)抗性的高低與質(zhì)量濃度有密切關(guān)系, 由于GA3對植物具有明顯影響，而小球藻屬于低等植物，由此推測GA3對蛋白核小球藻中脂質(zhì)的積累可能具有一定的影響。目前, GA3在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用, 但關(guān)于外源GA3對蛋白核小球藻中脂質(zhì)積累的影響還未見相關(guān)報(bào)道, 筆者對此進(jìn)行了研究并取得了初步的成果。第二章 材料與方法2.1 蛋白核小球藻的培養(yǎng) 藻種本次實(shí)驗(yàn)使用的蛋白核小球藻（blank cont

22、rol group），是澳大利亞昆山大學(xué)微藻研究所提供，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)擴(kuò)繁并培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。 藻種培養(yǎng)在5L的三角瓶中加入3L的液體培養(yǎng)基，接種一定體積的原藻液。光照下培養(yǎng)，由日光燈提供光照，其中光照與黑暗比為12h:12h，光照強(qiáng)度為4000Lx，其培養(yǎng)溫度為23恒溫培養(yǎng)，每天手動搖瓶3至5次，藻種培養(yǎng)的營養(yǎng)液加鹽頻率為2周加一次1/4濃度的營養(yǎng)鹽，待培養(yǎng)至生長對數(shù)期備用。本實(shí)驗(yàn)藻種和實(shí)驗(yàn)用藻的培養(yǎng)采用BBM培養(yǎng)基，其中各營養(yǎng)成分及濃度加樣表如下：鹽標(biāo)號藥品工作液母液(g)每升藻液加營養(yǎng)鹽量200mL加營養(yǎng)鹽量（µL）AKNO3200mg2001mL200BKH2PO420mg20

23、1mL200CMgSO4 ·7H2O100mg1001mL200DCaCl2H2O80mg801mL200ENa2-EDTA9.8µg0.198100µL20FeCl3·H2O24.4µg0.244100µL20FZnCl24.1µg0.041100µL20H3BO36.1µg0.61100µL20CoCl2 ·6H2O5.1µg0.051100µL20CuSO4 ·5H2O6.0µg0.06100µL20MnCl2 ·6H2

24、O4.1µg0.041100µL20(NH) 4Mo7O244H2O3.8µg0.38100µL202.2 實(shí)驗(yàn)材料 藥品與試劑 蒸餾水、95%乙醇、丙酮、氯仿、甲醇、氮?dú)獾?儀器和實(shí)驗(yàn)用具三角瓶（250mL、5L）、飼養(yǎng)瓶（25mL）、研缽、擦鏡紙、蓋玻片、細(xì)線、封口膜、pH試紙、比色皿、量筒、膠頭滴管、玻璃棒、藥匙、試管、記號筆、移液槍、離心管（10mL、50mL）、稱量紙、燒杯等。氮吹儀（上海泉島公司QSC12T）超聲波破碎儀（美國SONICS）臺式低溫離心機(jī)（HERAEUS）電子天平（HANGPING FA1004）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGF30

25、/14IIA）可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司723型）高壓蒸汽滅菌鍋超凈工作臺（DLCJIN）旋渦混合器（MVS1）2.3 實(shí)驗(yàn)方法 蛋白核小球藻的激素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)置GA3(0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、15mg/L、20mg/L、）6個質(zhì)量濃度梯度以及不用任何激素處理的空白對照，每個質(zhì)量濃度梯度設(shè)置三個重復(fù)，空白對照設(shè)置5個重復(fù)。當(dāng)藻液培養(yǎng)到對數(shù)生長期后，在超凈工作臺上將藻液分裝至23個250mL的飼養(yǎng)瓶中( 每瓶200mL )，依次標(biāo)記好各質(zhì)量濃度梯度值，每個濃度梯度下的重復(fù)組進(jìn)行標(biāo)記。然后再分別將已裝有藻液的飼養(yǎng)瓶于超凈工作臺上，添加相應(yīng)濃度梯度的激素。添加激素GA3完畢后

26、轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室光照下培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)藻的培養(yǎng)及培養(yǎng)條件將接種好的藻液置于光照下培養(yǎng)，每天按時(shí)手動搖藻，一天3至5次；每6天向每個接種過的三角瓶裝中添加等量的蛋白核小球藻培養(yǎng)鹽。蛋白核小球藻生長的培養(yǎng)溫度為24，光照與黑暗比為12h:12h，白天光強(qiáng)約為4000Lx。藻種培養(yǎng)階段每天定時(shí)搖藻（一日3至5次），每2周加鹽一次，一次加入1/4倍數(shù)濃度的鹽藻營養(yǎng)鹽；誘導(dǎo)接種后一周加一次營養(yǎng)鹽。 蛋白核小球藻細(xì)胞生長標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 每隔三天，從每一瓶藻液中取4ml測定其吸光度值并記錄。然后根據(jù)測得數(shù)據(jù)作出生長曲線。測定時(shí)均在超凈工作臺中操作，迅速取樣，取樣之后將各實(shí)驗(yàn)組放回培養(yǎng)箱按前述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。 蛋白

27、核小球藻生物量的測定從實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻添加激素完畢后開始，每三天測定一次實(shí)驗(yàn)所設(shè)質(zhì)量濃度梯度內(nèi)各質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞的吸光度值，添加激素完畢后的測定為第一次吸光度值的測量值。具體測定方法為：在超凈工作臺上用移液槍分別從每個時(shí)間梯度的三個重復(fù)培養(yǎng)瓶中各抽取出1.5mL的藻液共4.5mL，倒入石英比色皿中在450nm的波長下用分光光度計(jì)測定其吸光度值，并記錄數(shù)據(jù)，以后每3天測定一次各組的吸光度值。測定時(shí)均在超凈工作臺中操作，迅速取樣，取樣之后將各實(shí)驗(yàn)組放回培養(yǎng)箱按前述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。本次實(shí)驗(yàn)蛋白核小球藻的培養(yǎng)和吸光度值的測定時(shí)間為12天，共測得各組的吸光度值4組數(shù)據(jù)。 蛋白核小球藻細(xì)胞的富集收

28、集按照前述培養(yǎng)條件將各組鹽藻培養(yǎng)一定的時(shí)間后（本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)了12天），在超凈工作臺上分別將各瓶藻藻液在轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，并在離心管和蓋子上做好對應(yīng)的標(biāo)記，配平后，放于低溫高速離心機(jī)中，4下8000rpm轉(zhuǎn)速離心10 min ；離心后將各離心管小心地從離心機(jī)中取出，除去上清；然后將收集得到的藻泥置于-20的冰箱中冷凍保存，以備總脂含量的測定。 蛋白核小球藻總脂含量的測定藻細(xì)胞樣品的預(yù)處理。從冰箱中取出離心收集于離心管中，用于測總脂含量的藻細(xì)胞樣品，放置到電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在100條件下干燥過夜去除多余水分；干燥后，佩戴乳膠手套在干燥樣品冷卻前迅速用分析天平分別稱量出各實(shí)驗(yàn)組干藻粉的質(zhì)量

29、m0，并記錄數(shù)據(jù)。稱量后快速將已稱量的干藻粉進(jìn)行研磨，并加入等體積的氯仿和甲醇（二者體積比1:2，現(xiàn)配現(xiàn)用）。注意：實(shí)驗(yàn)研磨過程中先加氯仿進(jìn)行研磨，最后加入甲醇，再用氯仿配制成約4mL。且藥品有毒，操作時(shí)一定要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且要戴上口罩和乳膠手套，防止吸入大量氯仿和甲醇而中毒。研磨后將研磨液連同破碎物一起倒入10 ml離心管，并做好對應(yīng)標(biāo)記，并用適量的已配好的氯仿和甲醇混合溶液沖洗殘留在研缽上的破碎物和液體，沖洗后一并倒入離心管，盡量保證沖洗干凈。超聲波破壁。對研磨后的樣品進(jìn)行超聲波破壁處理（實(shí)驗(yàn)所用超聲波細(xì)胞破碎儀是由美國SONICS公司提供的 VC605型號）。使用功率為40W，周期是

30、1min，破壁15s，間隔5s的3個循環(huán)的條件下進(jìn)行破壁16-17。在破壁過程中，注意要將離心管用冰浴作保護(hù)，以防止細(xì)胞破碎儀的探頭發(fā)出的超聲波產(chǎn)生高溫，在破壁工作中對藻細(xì)胞造成灼傷。離心。將破壁完的藻液分裝于兩個50mL離心管中，配平后，放于低溫高速離心機(jī)中，10000rpm條件下離心10min。萃取。離心完成后，將離心管小心地從離心機(jī)中取出，輕輕打開離心管的蓋子，將上清液倒入以對應(yīng)標(biāo)記好的空的50 ml離心管中，并按體積3:1（氯仿：上清液）的比例加入氯仿并渦旋混勻。之后再加入與氯仿等體積的蒸餾水并渦旋混勻，靜置待其分層（共分三層：上層水層，中層雜質(zhì)，下層有機(jī)相）。配平后，于低溫高速離心機(jī)

31、中，10000rpm條件下離心10min。用移液槍小心地抽取下層有機(jī)相轉(zhuǎn)入預(yù)先烘干并稱重(m1)的10 ml離心管中，用氮吹儀吹干有機(jī)溶劑后，將離心管烘干稱重（m2）并記錄數(shù)據(jù)，氮吹儀水浴溫度設(shè)定為60。計(jì)算。總脂含量的計(jì)算公式為：總脂含量百分比=（m2-m1)/m0×100%第三章 結(jié)果與討論3.1 GA3對蛋白核小球藻總脂含量積累的影響GA3濃度（mg/L）0.1151015200總脂含量31.18%30.61%31.10%39.00%44.00%28.00%31.40% 表3.1各組的總脂含量圖3.1各組的總脂含量柱狀圖表3.1、圖3.1是通過氯仿-甲醇法提取油脂經(jīng)吹干后測得的

32、對照組和各實(shí)驗(yàn)組的總脂含量。從表中可以看出，實(shí)驗(yàn)組（添加GA3 10mg/L和15mg/L）的總脂含量均比對照組大，說明濃度為10mg/L和15mg/L的赤霉素（GA3）實(shí)驗(yàn)組的總脂含量積累有促進(jìn)作用；而實(shí)驗(yàn)組（添加GA3 20mg/L）的總脂含量比對照組小，說明濃度為20mg/L的赤霉素（GA3）實(shí)驗(yàn)組的總脂含量積累有抑制作用；在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的濃度梯度內(nèi)，15mg/L實(shí)驗(yàn)組的總脂含量最高，是對照組的1.40倍，促進(jìn)作用最明顯，10mg/L實(shí)驗(yàn)組次之；且隨著添加赤霉素（GA3）濃度的增加其促進(jìn)作用在逐漸減小，當(dāng)達(dá)到20mg/L時(shí)，則具有一定的抑制作用。3.2 進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的選擇參考分析綜合分析

33、赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻的生長和總脂含量積累的影響，結(jié)果分別是：15mg/LGA3實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果最大說明：該濃度下的激素可以促進(jìn)蛋白核小球藻的產(chǎn)油和總脂的積累；因此，15mg/L GA3實(shí)驗(yàn)組作為進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的選擇參考。第四章 結(jié)論4.1 赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻總脂含量的累影響：赤霉素（GA3）對蛋白核小球藻總脂含量的積累有促進(jìn)作用；且隨實(shí)驗(yàn)組添加赤霉素（GA3）濃度的增加，其對蛋白核小球藻總脂含量積累的促進(jìn)作用在減小。其中，15mg/L實(shí)驗(yàn)組的總脂含量最高，比對照組提高了12.60%，是對照組的1.40倍。4.2對工業(yè)化生產(chǎn)提供的參考：在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置濃度梯度內(nèi)赤霉素（GA3）處理

34、15mg/L的實(shí)驗(yàn)組總脂含量最高，可以為微藻產(chǎn)油的工業(yè)化生產(chǎn)提供選擇參考。參考文獻(xiàn)：1Lopez-Galarza S, Pascual B. The influence of winter gibberellic acid applications on earliness, productivity and other parameters of quality in strawberry cultivation on the Spanish Mediterranean coastJ. Acta Hort, 1989, 265: 217-222.2 楊艷, 盧滇楠, 李春, 等. 面向21世

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