Bruker InVivo Xtreme小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、Bruker In-Vivo Xtreme小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程【目的】通過制定本操作規(guī)程，規(guī)范小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)使用?！緶?zhǔn)備】1、 實(shí)驗(yàn)試劑（藥物、染料、麻醉劑、水、脫毛膏等）；2、 實(shí)驗(yàn)對(duì)象（小鼠、大鼠、黑鼠、裸鼠等）；3、 如需要?dú)怏w麻醉則要進(jìn)行氧氣準(zhǔn)備，將麻醉劑倒入麻醉機(jī)中，并檢查麻醉機(jī)檢查窗中液位位于“min”和“Max”之間；氣體麻醉前根據(jù)室內(nèi)溫度情況酌情打開動(dòng)物空氣加熱器?！鹃_機(jī)】主機(jī)部分：1、打開X-Ray光源，將開關(guān)鑰匙打到“ON”的位置；2、打開主機(jī)，將主機(jī)右后方的電源開關(guān)打到“ON”的位置。接著打開電腦，等待網(wǎng)線圖標(biāo)出現(xiàn)一個(gè)黃色三角嘆號(hào)后，將MI軟件打開。注意：儀

2、器開機(jī)以后，需要大約20分鐘的預(yù)冷時(shí)間。附屬部分：1、 如需要進(jìn)行氣體麻醉，則需要打開麻醉機(jī)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行預(yù)麻醉；2、 如果需要進(jìn)行三維旋轉(zhuǎn)拍攝，則需準(zhǔn)備動(dòng)物旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)（MARS），動(dòng)物旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)的準(zhǔn)備需要在不開拍攝軟件和MARS控制器按鈕打到manual的情況下，先按要求將旋轉(zhuǎn)器安裝到暗箱中，然后將按鈕打到auto，完成之后即可打開MI軟件【拍照】1、將實(shí)驗(yàn)對(duì)象擺放到托盤中，拍照部位朝下，如拍攝腹部影像，需將實(shí)驗(yàn)對(duì)象腹部朝下，并將四肢伸展開，然后將托盤放入暗箱拍攝位置，放置是托盤缺口朝右側(cè)擺放；2、雙擊桌面MI圖標(biāo)，打開MI軟件，單擊“Capture”按鈕，打開拍攝參數(shù)設(shè)置界面；1）：拍攝界

3、面頂部顯示儀器型號(hào)。MI軟件提供同時(shí)拍攝兩張圖像的功能，即第一張圖像是Foreground，主圖像，第二張圖像是Background，背景圖像。點(diǎn)擊Foreground和Background按鈕進(jìn)行切換，對(duì)兩張圖像的拍攝程序分別進(jìn)行編輯。2）：左邊第一部分File里可以執(zhí)行和創(chuàng)建、編輯修改一個(gè)Protocol，同時(shí)，Protocol還可以通過點(diǎn)擊軟件頂部的工具欄中Protocol按鈕打開。3）：第二部分是選擇拍攝模式，共有5種，分別為Fluorescence熒光，Luminescence化學(xué)發(fā)光，Radioisotopix同位素，X-Ray X光，Reflectance反射光，另外可以Cust

4、om定制程序。點(diǎn)擊Setting的下拉菜單，可以選擇我們已經(jīng)設(shè)定好的拍攝程序，或者選擇Default Session默認(rèn)設(shè)置，和Current Session來新建一個(gè)拍攝程序。每個(gè)拍攝模式都有一個(gè)默認(rèn)設(shè)置，具體拍攝條件如下（In Vivo Xtreme ENG，42頁(yè)）：右邊的save保存程序，save as另存為和重命名，Delete刪除程序。點(diǎn)擊Unlock和Lock鍵，可以對(duì)鎖定的程序解鎖或?yàn)殒i定的程序設(shè)置密碼鎖定。在Annotation框中輸入文字，可以對(duì)該程序拍攝的圖片進(jìn)行至多48個(gè)字符的注釋。在Accumulation Path欄里選擇圖像的保存路徑。 4）：第三部分是選擇或者不

5、選背景圖像，Background Image的下拉菜單里可以不選背景圖像或者選擇某個(gè)拍攝程序生成背景圖像。軟件預(yù)設(shè)了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的X光拍攝程序，一個(gè)高分辨率的X光拍攝程序和一個(gè)反射光的拍攝程序，具體拍攝條件可以在Background中查看。如果我們?cè)贐ackground中編輯保存了自己的程序，在這里也可以選用。5）：第四部分中可以查看設(shè)備的IP地址，相機(jī)的序列號(hào)和CCD是否已經(jīng)準(zhǔn)備好，如果方塊變成綠色就表示CCD已經(jīng)降到預(yù)設(shè)溫度，儀器已經(jīng)可以正常使用。6）：右邊第一部分是光源設(shè)定，在光源的下拉菜單中，生物發(fā)光和同位素拍攝選擇Luminescence，反射光拍攝選擇Reflectance RGB，

6、熒光和白光拍攝選擇Muti-wavelength，X光拍攝選擇X-ray。在Apply Reference File中選擇是否應(yīng)用校正文件，None是不應(yīng)用校正文件，Auto是當(dāng)已經(jīng)設(shè)置了合適的校正文件時(shí)，軟件自動(dòng)選擇匹配的校正文件，選擇Manual后先進(jìn)行正常的圖像拍攝，拍完后移除樣品和托盤，再進(jìn)行校正文件的拍攝。為了保證圖像質(zhì)量，凡是涉及到運(yùn)用光源的實(shí)驗(yàn)，例如熒光，白光，反射光和X光成像，都必須設(shè)置合適的校正文件。熒光、白光和反射光的校正文件跟光圈大小、成像視野、焦距和激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)相關(guān)；X光的校正文件跟光圈大小、成像視野、焦距和鋁膜相關(guān)；當(dāng)改變拍攝程序中的以上參數(shù)時(shí)，必須重新拍攝和設(shè)置校正

7、文件。以下是校正文件的推薦參數(shù)設(shè)置：當(dāng)選擇多重曝光時(shí)，應(yīng)用Fina Accumulation最終只生成一張圖片，All Accumulations 每次曝光的最終結(jié)果都是與之前的圖片疊加后的結(jié)果，保存每次曝光所產(chǎn)生的圖片，但在軟件中只打開最后一張。All Image是指保存每次疊加的圖片以及單張圖片。Separate Images是指只保存單次曝光的結(jié)果圖片。 7）右邊的第二部分是選擇濾光片，當(dāng)進(jìn)行X光拍攝時(shí)，可以選擇不同厚度的鋁膜，鋁膜越厚，過濾掉低能量的X射線就越多，骨骼和肌肉軟組織的對(duì)比度越高，圖像越清晰。因此大鼠X光成像，對(duì)骨骼清晰度要求高的圖像，或者需要進(jìn)行骨密度分析的圖像，建議選擇

8、0.8mm厚度的鋁膜。 這里可以選擇X光機(jī)的能量，有20、25、30、35、40、45幾檔可選，高清晰度的X光成像需要高能量，一般大鼠或小鼠的全身骨骼成像選擇45KVP. 在熒光拍攝時(shí)需要選擇激發(fā)和發(fā)射濾光片，熒光成像中根據(jù)熒光物質(zhì)的特性來選擇相應(yīng)的濾光片，需要注意的是激發(fā)和發(fā)射濾光片之間波長(zhǎng)間隔必須至少在50nm以上，否則會(huì)帶來強(qiáng)烈的背景干擾。白光、反射光、生物發(fā)光、同位素和X光成像，濾光片都選擇0和0。 8）：右邊的第三部分是相機(jī)設(shè)置。包括Exposure Type曝光方式，這里可選Standard標(biāo)準(zhǔn)曝光，Time Lapse間隔曝光和做校正文件時(shí)應(yīng)用的Illumination Refe

9、rence曝光模式。 曝光時(shí)間可以以秒和分鐘為單位任意選擇，X光的最小曝光時(shí)間是1.2秒，其它拍攝模式的曝光時(shí)間最小是0.1秒（Xtreme FI是0.2秒），最長(zhǎng)是10分鐘。 曝光次數(shù)最大可選擇32次，但過多的曝光次數(shù)是不合適的，可隨機(jī)調(diào)整。當(dāng)在曝光方式中選擇Time Lapse時(shí)，這里可以選擇拍攝間隔和在多長(zhǎng)時(shí)間或者幾幀以后拍攝停止。 Mode（選擇CCD在采集圖像時(shí)的讀取速度）里有High Speed和High Sensitivity兩個(gè)選項(xiàng)，建議熒光、反射光和X光選擇High Speed，化學(xué)發(fā)光和同位素選擇High Sensitivity。 Predict Exposure Time

10、是預(yù)測(cè)曝光按鈕，用此按鈕可以估計(jì)生物發(fā)光和同位素的曝光時(shí)間。選中以后彈出對(duì)話框，輸入曝光所需的灰度級(jí)，點(diǎn)擊計(jì)算按鈕，Xtreme會(huì)自動(dòng)計(jì)算所需要的最佳曝光時(shí)間。Binning是指像素合并，Xtreme BI最高到32x32，Xtreme FI最高到64x64，像素合并是指將CCD的相鄰幾個(gè)像素合并成一個(gè)像素在圖像中呈現(xiàn)，提高CCD的拍攝靈敏度和響應(yīng)速度。當(dāng)拍攝弱信號(hào)比如化學(xué)發(fā)光或者同位素時(shí)，可能需要用到4x4以上的像素合并。Instant DCR是指CCD的即時(shí)暗電荷修正設(shè)置，對(duì)大多數(shù)的圖像來說，0.5-1之間的值比較合適。當(dāng)用到小樣品臺(tái)進(jìn)行小視野的X光成像時(shí)，必須勾上Mag Stage這個(gè)選

11、項(xiàng)，小樣品臺(tái)提供放大倍數(shù)為3.3倍的X光成像，特別適合拍攝爪子、關(guān)節(jié)、頭顱等部位。FOV中調(diào)節(jié)成像面積，Xtreme BI分別有，10x10cm，12x12cm，15x15cm，18x18cm和19x19cm的6個(gè)成像視野可選擇。fStop是選擇光圈的大小，光圈數(shù)值越小通光量越大，成像的信號(hào)強(qiáng)度越高。Focal Plane是選擇成像的焦距，熒光、白光和反射光等所有在托盤上的成像選擇Tray，X光和同位素等在磷屏上的成像選擇X-Ray。 9）：右邊的最下方可以切換拍攝界面的Standard和Advanced模式。 Preferences按鈕可對(duì)儀器硬件進(jìn)行設(shè)置和調(diào)試。 點(diǎn)擊Preview進(jìn)入預(yù)覽

12、界面，預(yù)覽界面中可以調(diào)節(jié)拍攝時(shí)間和焦距，打開反射和白光光源等。點(diǎn)擊Capture按鈕直接進(jìn)行拍攝。3、新建不同模式的拍攝程序1）：以新建一個(gè)熒光拍攝程序?yàn)槔?，首先在Modality中選擇Fluorescence，Setting中選擇Current Sesion，Apply Refernce File中選擇None，然后設(shè)置合適的激發(fā)和發(fā)射濾光片，這里以綠色熒光蛋白GFP的激發(fā)和發(fā)射光480,535為例，Exposure Type選擇Standard，曝光時(shí)間、Bin、FOV、fStop和Focal Plane根據(jù)需要選擇，下面是不同拍攝模式的推薦拍攝程序：選好之后點(diǎn)擊Save as為程序命名并

13、保存程序。由于熒光、白光、反射光和X光需要做背景校正，所以接下來我們做一個(gè)背景校正文件，在Exposure Type中選擇Illumination Reference，把動(dòng)物倉(cāng)中的樣品和樣品托盤取出，正確放置EPI屏（做X光背景校正文件需正確安裝X光磷屏，做反射光校正文件需放置Backdrop屏），關(guān)閉倉(cāng)門點(diǎn)擊Capture按鈕，軟件進(jìn)行校正文件的拍攝。拍完之后校正文件自動(dòng)在MI軟件中打開，此時(shí)將拍攝模式改回Standard，校正文件應(yīng)用中選擇Auto，點(diǎn)擊Save保存程序，這樣一個(gè)完整的熒光拍攝程序就建好了。2）：設(shè)置Background在拍攝界面上方點(diǎn)擊Background按鈕切換到背景圖

14、像編輯界面。與Foreground的設(shè)置相似，Background也可以選擇熒光、生物發(fā)光、同位素、X光和反射光的拍攝模式，具體程序的設(shè)置請(qǐng)參考Foreground的設(shè)置，需要注意的是，軟件設(shè)置了2個(gè)X光和一個(gè)反射光的默認(rèn)程序供用戶選擇，用戶可根據(jù)具體需求設(shè)置。當(dāng)一個(gè)設(shè)置了Background的程序點(diǎn)擊Capture拍攝時(shí)，軟件會(huì)要求提供保存路徑，拍完之后兩張圖像直接存儲(chǔ)且在MI軟件中打開，Background疊加Foreground后顯示，F(xiàn)oreground圖像除了以拍攝日期、時(shí)間、拍攝模式、激發(fā)和發(fā)射濾光片的標(biāo)準(zhǔn)方式命名外，后綴還會(huì)加上Frgrnd的字樣，而Background圖像的后綴

15、會(huì)加上Bckgrnd字樣。大家可以看到這種圖片的文件名最后還帶有一個(gè)星號(hào)，這表示經(jīng)過調(diào)節(jié)之后的圖像還未被保存，將圖像保存后，星號(hào)消失?！緢D像調(diào)整】1、 MI軟件簡(jiǎn)介雙擊桌面圖標(biāo)Bruker MI SE打開MI軟件，最上方的菜單欄中有File、Edit、Mode、Shou、Window和Help幾個(gè)選項(xiàng)。File可以打開，搜索，關(guān)閉，保存和輸出圖像、數(shù)據(jù)等。Help中可以找到各個(gè)軟件和硬件的說明書。Navigation里的工具可以對(duì)圖像進(jìn)行編輯，打開Image Display菜單欄對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)節(jié)，Protocol按鈕用于打開Protocol。Multiplex打開以后，可以對(duì)最多4色圖像，或者4個(gè)不同模式成像的圖像進(jìn)行疊加。Intansity Scale用于打開或收起Scale。2、 圖像的打開與編輯打開一張圖像，點(diǎn)擊I