第三章 環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法

1、第三章 環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：物種選擇：選擇對(duì)外液化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點(diǎn)與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長(zhǎng)的物種；選擇易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；選擇經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。品系選擇： 近交系動(dòng)物 采用連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配而培育的純品系動(dòng)物。如津白、津白、615， BALBC， C3H、C57B6J小鼠等。突變系動(dòng)物 動(dòng)物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，通過(guò)自然突變或人工定向突變的辦法，使其某基因發(fā)生突變，并喪失了原有的正常功能。這種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動(dòng)物。 雜交群動(dòng)物 兩個(gè)不同近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物， 亦稱雜交一代動(dòng)物。封閉

2、群動(dòng)物 一個(gè)動(dòng)物種群，在5年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動(dòng)物在固定場(chǎng)所保存繁殖的動(dòng)物群如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、Wistar大鼠SD大鼠、青紫藍(lán)兔、新西蘭兔等。微生物控制的選擇：無(wú)菌動(dòng)物 體內(nèi)外均無(wú)任何微生物和寄生蟲(chóng)的動(dòng)物無(wú)特定病原體動(dòng)物（SPF）體內(nèi)無(wú)特定的微生物和寄生蟲(chóng)存在的動(dòng)物。實(shí)際上是無(wú)傳染病的動(dòng)物，容許攜帶非特定微生物。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)中。清潔動(dòng)物 有程最低限度疾病動(dòng)物，動(dòng)物體內(nèi)外不攜帶人畜共患的病原體或動(dòng)物傳染病病原體，與SPF動(dòng)物不同的是，抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應(yīng)有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)第一節(jié) 急性毒性

3、試驗(yàn)一、急性毒性試驗(yàn)的目的：概念：研究化學(xué)物大劑量一次染毒或24小時(shí)內(nèi)多次染毒動(dòng)物后所引起的毒作用試驗(yàn)。主要根據(jù)人體可能的暴露途徑，選擇經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道的染毒途徑進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，獲得 LD50或LC50。農(nóng)藥等有可能與皮膚或眼接觸的化學(xué)物需進(jìn)行皮膚刺激試驗(yàn)、眼刺激試驗(yàn)和皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。對(duì)呼吸道有刺激作用的化學(xué)物還應(yīng)進(jìn)行吸入刺激閾濃度試驗(yàn)。通過(guò)急性毒性試驗(yàn)，可對(duì)化學(xué)物的毒性作出初步的估計(jì)并確定其急性毒作用特征，為急性毒性定級(jí)、進(jìn)一步試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和毒性判定指標(biāo)的選擇提供依據(jù)。目的：在短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點(diǎn)，并為進(jìn)一步開(kāi)展其他毒性試驗(yàn)提供設(shè)計(jì)依據(jù)。1、確定供試化學(xué)物急性毒性的劑量

4、反應(yīng)關(guān)系和中毒特征；2、求LD50或LE50,為急性毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。3、研究毒物的毒動(dòng)學(xué)和毒效學(xué)過(guò)程。用來(lái)表示急性毒性大小的是LD50:對(duì)受試物的個(gè)體感受性影響較小，有更高的重現(xiàn)性；從劑量反應(yīng)曲線上看它處于曲線的中段，是死亡率對(duì)劑量敏感的部位，有60一70死亡動(dòng)物集中在LD50附近。見(jiàn)p505表22-5，22-6二、試驗(yàn)程序與評(píng)價(jià) 1動(dòng)物選擇 首先選擇受試物在體內(nèi)代謝情況與人體內(nèi)相近的或?qū)κ茉囄镒蠲舾械钠废怠?嚙齒類：大鼠、小鼠； 兔、豬、狗。應(yīng)對(duì)兩種性別、成年和幼年動(dòng)物進(jìn)行測(cè)定。2染毒途徑與方式： 一般應(yīng)與人的接觸途徑相同。常用的有以下幾種： (1)經(jīng)口染毒 常用灌胃法，也可將受試物放在飲

5、水中由動(dòng)物自由攝取。將化學(xué)物與飼料混和具有劑量不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，而且常會(huì)影響吸收，降低化學(xué)物的毒性。 為了便于染毒常需用溶劑來(lái)溶解受試物或?qū)⑵渑涑苫鞈乙海軇┍旧響?yīng)無(wú)毒，且不與受試物起反應(yīng)。溜胃容積一般大鼠不超過(guò)3m1，小鼠不超過(guò)o5m1，當(dāng)染毒劑量過(guò)大時(shí)，可分幾次給藥。 (2)經(jīng)呼吸道染毒 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內(nèi)進(jìn)行染毒。急性吸入染毒采用靜式染毒瓶(2025L)或染毒拒(2550L)，加入定量受試物形成所需濃度的空氣環(huán)境，讓動(dòng)物自由吸入，染毒24h。 (3)經(jīng)皮膚染毒 本法主要用于化學(xué)物如化妝品農(nóng)藥經(jīng)皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。常用動(dòng)物是成年家免或脈鼠，有時(shí)也用大鼠和小鼠。在

6、正式給藥前24h，給動(dòng)物背部脫毛，注意勿傷皮膚。將受試物均勻涂布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。 3試驗(yàn)程序： （1）劑量與分組 首先應(yīng)根據(jù)受試物的結(jié)構(gòu)對(duì)比文獻(xiàn)中類似化學(xué)物的致死量作初步估計(jì)，然后進(jìn)行預(yù)試以找出粗略的LD50或LD0。正式試驗(yàn)可在LD100與LD0之間設(shè)57個(gè)劑量組。 （2）癥狀觀察 時(shí)間：24h或兩周內(nèi)的反應(yīng)。觀察內(nèi)容：表現(xiàn)癥狀和解剖觀察p504表22-4三、 LD50的計(jì)算與結(jié)果評(píng)價(jià)計(jì)算LD50及其標(biāo)準(zhǔn)誤的方法：.通常采用概率單位法和寇氏法。見(jiàn)p506。根據(jù)所得結(jié)果，按前述急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)定其毒性大小。LD50值愈小，毒性愈大。各種化學(xué)物之間的毒性有明顯的差異。概率

7、單位法用正態(tài)曲線下的面積來(lái)表示死亡率的大小，其均數(shù)左右邊的面積各為50%。將正態(tài)曲線橫軸上的單位，用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)差為單位來(lái)計(jì)算：d=(x-)/為消去負(fù)號(hào)，將其值一律加5，稱為概率單位。死亡率為50%時(shí)，概率單位為5，以此類推。從表17-1百分率-概率單位換算表，可以任一死亡率換算為相應(yīng)的概率單位。經(jīng)此換算，劑量對(duì)數(shù)與概率單位(即表示死亡率)，已不是S狀曲線(A)而成為直線關(guān)系(B)。LC50計(jì)算步驟如下：a根據(jù)各組死亡率從表17-1百分率-概率單位換算表中查到各組的概率單位，如第一組 死亡率為80，查得概率單位為5.84，余此類推。死亡率為100或0者，不列入計(jì)算。b 用方格紙繪相關(guān)線，橫軸表示濃

8、度對(duì)數(shù)（x），縱軸表示概率單位（y），各級(jí)數(shù)值點(diǎn)在圖上（圖 177）。C順著各點(diǎn)的分布趨勢(shì)，用直尺繪出一條最適合于各點(diǎn)的直線，此線應(yīng)盡量靠近概率單位為5及附近的點(diǎn)子。畫(huà)線前可用透明尺或用一根黑線進(jìn)行測(cè)試，為直線通過(guò)各點(diǎn)中間。d求概率單位與處的濃度對(duì)數(shù)（m），其反對(duì)數(shù)即為L(zhǎng)C50e.劑量-反應(yīng)關(guān)系的回歸方程的計(jì)算：可選兩個(gè)相距較遠(yuǎn)的概率單位點(diǎn)y和y2,求回歸系數(shù)b。代入回歸方程式中：b為直線斜率x為的劑量對(duì)數(shù)為概率單位5的劑量對(duì)數(shù) f.求LC50的可信限先求LC50的標(biāo)準(zhǔn)誤差(Sm)：=4平均致死量法（又名寇氏法） 此法計(jì)算LD50較為簡(jiǎn)便，但試驗(yàn)時(shí)要符合下列要求：每個(gè)試驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)要相同；各組劑

9、量要按等比級(jí)數(shù)分組；最大劑量的死亡率最好為100或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0或與之接近。計(jì)算公式如下：式中，Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)值；i為相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)；為各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）。例小鼠腹腔注射致百蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如表 174所示，求 LD50式中，p為一個(gè)組死亡率；q為一個(gè)組存活率；i為相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)；h為各組動(dòng)物數(shù)。第二節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗(yàn) 了解長(zhǎng)期反復(fù)接觸低劑量化學(xué)物質(zhì)可能引起的毒性效應(yīng)。 需進(jìn)行蓄積試驗(yàn)和亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)。一、蓄積試驗(yàn)及其方法： 環(huán)境化學(xué)物的蓄積作用是慢性中毒的基礎(chǔ)。（一）蓄積作用：某些物質(zhì)以較小劑量反復(fù)作用于機(jī)體，可使機(jī)體對(duì)該物質(zhì)的反應(yīng)

10、性增強(qiáng)，即一次染毒不引起明顯中毒反應(yīng)或死亡的劑量，經(jīng)分次重復(fù)染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)?？煞謨煞N：物質(zhì)蓄積，即毒物在體內(nèi)的排出量小于進(jìn)入量，以致毒物在體內(nèi)的貯留量增多為物質(zhì)蓄積；功能蓄積：是毒物進(jìn)入機(jī)體后，并末發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)明顯貯留，但可引起機(jī)體功能改變的逐漸累積，導(dǎo)致對(duì)該毒物的反應(yīng)性增強(qiáng)，此種現(xiàn)象稱為功能蓄積。但兩者的劃分是相對(duì)的，既有差別，又互有聯(lián)系。功能蓄積可能是由于貯存于體內(nèi)的化合物或代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，目前分析方法尚不能檢出的一種物質(zhì)蓄積，或是由于每次機(jī)體接觸化合物之后所引起的損害累積所致。耐受性(tolerance)是機(jī)體多次接觸化學(xué)

11、物質(zhì)后對(duì)該物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。（二）蓄積作用的測(cè)定方法 有多種，常用蓄積系數(shù)法。蓄積系數(shù)是指多次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)某種效應(yīng)的總劑量(ED50(n)與一次染毒引起同一效應(yīng)的劑量，即半數(shù)效量(ED50(1)的比值。若以死亡為毒效應(yīng)指標(biāo)，上式為蓄積系數(shù)的測(cè)定：1固定劑量法 由Kagan和s帕nkevic(I 954)提出，該法固定每天染毒劑量為1201/5 LD50，連續(xù)染毒，直至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡。如果染毒劑量累計(jì)已達(dá)5個(gè)LD50 動(dòng)物死亡仍末達(dá)半數(shù)，實(shí)驗(yàn)均可告結(jié)束，計(jì)算蓄積系數(shù)，作出評(píng)價(jià)。2遞增劑量法 由Lim等(1961)提出，先測(cè)定LD50（1），然后對(duì)另一組動(dòng)物每

12、天染毒，以4天為一期，開(kāi)始給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動(dòng)物半數(shù)死亡，或?qū)嶒?yàn)已達(dá)24天，可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，計(jì)算系數(shù)。3. 二十天試驗(yàn)法 本法是我國(guó)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序(1984)針對(duì)上述兩法的利弊而提出的。選用大鼠或小鼠每個(gè)劑量組雌雄各10只，以12、l5、110、120 LD50。分別對(duì)每組進(jìn)行染毒，每日1次，共20天。如l20LD50組動(dòng)物有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則有較強(qiáng)蓄積作用；如120 LD50組無(wú)死亡，則為弱蓄積。二、亞慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法：1、目的：確定化學(xué)物亞慢性毒性的閾劑量 和NOEL(最大無(wú)作用劑量或未觀察到作用劑量)。2、試驗(yàn)期限：無(wú)完全統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，

13、一般認(rèn)為3-6月；現(xiàn)有學(xué)者主張喂飼：90天，因有報(bào)道認(rèn)為3個(gè)月毒性效應(yīng)與更長(zhǎng)時(shí)間基本相同。 呼吸道吸收：30或90天，每天6小時(shí)，每周5天。 皮膚毒性：30天。3、試驗(yàn)動(dòng)物的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境及染毒途徑： 選擇：急性毒性實(shí)驗(yàn)證明對(duì)受試化學(xué)物敏感的物種或品系； 環(huán)境：營(yíng)養(yǎng)合理，飲水清潔、充足、溫、光、濕適宜； 染毒途徑：盡量模擬人類在環(huán)境中接觸受試化學(xué)物的途徑，與急性毒性試驗(yàn)相似。4、劑量選擇與分組 劑量：120I5LD50，對(duì)于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當(dāng)加大劑量，反之則可減少劑量。 設(shè)34個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組要求：要求在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，最低劑量組的動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)

14、，相當(dāng)于亞慢性的最大無(wú)作用劑量；最高劑量組要求能引起動(dòng)物明顯的毒性反應(yīng)，但又不引起動(dòng)物死亡；中間劑量組應(yīng)產(chǎn)生輕微的毒性反應(yīng)，相當(dāng)于亞慢性的閾劑量。另設(shè)一對(duì)照組。劑量選擇可參照急性毒性和蓄積毒性的資料。如：以急性非致死性試驗(yàn)的閾劑量作為亞慢性試驗(yàn)的最高劑量。5、癥狀觀察(1)一般性指標(biāo)：如動(dòng)物體重增長(zhǎng)率、食物消耗率、活動(dòng)能力等。為整體反應(yīng)指標(biāo)。體重明顯下降常常是中毒或疾病的信號(hào)，也是一項(xiàng)比較敏感的指標(biāo)。(2) 化驗(yàn)指標(biāo)： 特異指標(biāo)：用以測(cè)定化學(xué)物作用于機(jī)體后所引起的特異性反應(yīng)。因此，它能更確切地闡明該物質(zhì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生有害影響的聞劑量(濃度)及無(wú)作用劑量(濃度)。例如： 有機(jī)磷農(nóng)藥：測(cè)定血中膽堿酯酶

15、活性； 芳香族硝基化學(xué)物：可測(cè)定高鐵血紅蛋白；無(wú)機(jī)F：可檢查斑釉發(fā)生率及牙齒和骨氟含量。功能指標(biāo)：血、肝、腎功能指標(biāo)：一些酶的測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)的，目前常用的有谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(吻)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)及其同功酶、r谷氨酰轉(zhuǎn)耽酶(rGTP)等活性測(cè)定。有害物質(zhì)在體內(nèi)的分布、代謝及排泄指標(biāo)：生物材料(血、尿、毛發(fā)等)中有害物質(zhì)(汞、鎘、鉛、砷、氟等)含量測(cè)定。三、慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法：慢性毒性試驗(yàn)是檢測(cè)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，以小劑量反復(fù)染毒后所引起損害作用的試驗(yàn)。1、目的：評(píng)價(jià)化學(xué)物在長(zhǎng)期小劑量作用的條件下對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損害及其特點(diǎn)確定其慢性毒作用閾劑量和最大無(wú)作用劑量

16、。2、試驗(yàn)方法：（1） 動(dòng)物選擇、染毒方法、觀察指標(biāo)等與亞慢性毒性試驗(yàn)相似；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組： 3個(gè)染毒組和一個(gè)對(duì)照組。 高劑量組：1/51/2亞慢性試驗(yàn)閾值； 中間劑量：1/501/10； 低劑量組：1/100。第四節(jié) 致突變實(shí)驗(yàn)一般包括原核細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)，如Ames試驗(yàn)或大腸桿菌試驗(yàn)或枯草桿菌試驗(yàn)；真核細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)，如微核試驗(yàn)或骨髓細(xì)胞染色體畸變分析；如實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，可在DNA修復(fù)合成試驗(yàn)、顯性致死試驗(yàn)、果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)中再選兩項(xiàng)進(jìn)行最后的綜合評(píng)價(jià)。通過(guò)致突變?cè)囼?yàn)，可對(duì)受試物的潛在遺傳危害性作出評(píng)價(jià)并預(yù)測(cè)其

17、致癌性。一、目的 確定外源化學(xué)物對(duì)生物體是否具有致突變作用。 基因點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、DNA損傷試驗(yàn)。二、供試生物： 微生物、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)、動(dòng)物或植物三、試驗(yàn)方法 體外基因突變?cè)囼?yàn)、細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)、體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)、DNA損傷試驗(yàn)（一）體外基因突變?cè)囼?yàn)1、Ames試驗(yàn)（鼠傷寒沙門(mén)氏菌/動(dòng)物肝細(xì)胞微粒體試驗(yàn)）（1）方法原理：利用一種突變微生物菌株與被檢測(cè)化學(xué)物接觸，使突變型微生物回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。突變型微生物不具備合成組氨酸的能力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。（2）方法： 將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),以其生長(zhǎng)狀況作為指標(biāo)。 在培養(yǎng)基中

18、加入哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞微粒體：提高靈敏度。（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)便、靈敏、快速（48h）、費(fèi)用低； 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)動(dòng)物的致癌性的相符率達(dá)約90%。 缺點(diǎn)： 利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動(dòng)物的遺傳信息，僅1/6； 微生物的DNA修復(fù)系統(tǒng)與動(dòng)物有差異； 微生物無(wú)免疫功能。 2、哺乳動(dòng)物體細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)（1）方法原理與微生物突變類似。常用的細(xì)胞株：中國(guó)地鼠肺細(xì)胞V79、中國(guó)地鼠肺卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞株。V79、CHO細(xì)胞株：缺乏利用嘌呤堿的一種酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）。在培養(yǎng)基中加入某些類似嘌呤堿類物質(zhì)：6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、8-N雜鳥(niǎo)嘌呤，這些物質(zhì)對(duì)正常細(xì)胞有毒性，不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；而突變細(xì)胞株可利用類似嘌