微生物病理技能訓練教程

1、目 錄第一部分第一部分 微生物病理基礎知識微生物病理基礎知識.111 鞭毛菌亞門及其所致病害的特點.112 接合菌亞門及其所致病害的特點.313 子囊菌亞門及其所致病害的特點.414 擔子菌亞門及其所致病害的特點.715 半知菌亞門及其所致病害的特點.8第二部分第二部分 微生物病理實驗基本操作微生物病理實驗基本操作.921 植物病理徒手制片技術.922 培養(yǎng)基的配制和滅菌.1123 植物病原菌的分離和培養(yǎng).1524 真菌孢子的萌發(fā).1825 植物病原物的接種.2026 植物病原生物繪圖技術.21第三部分微生物病理技能訓練第三部分微生物病理技能訓練.23實訓一 植物病原細菌觀察.23實訓二鞭毛菌

2、亞門真菌及其所致病害癥狀觀察.25實訓三接合菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察.29實訓四子囊菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀.30實訓五 擔子菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察.35實訓六 半知菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察.38微生物病理技能訓練教程微生物病理技能訓練教程第一部分第一部分 微生物病理基礎知識微生物病理基礎知識11 鞭毛菌亞門及其所致病害的特點鞭毛菌亞門及其所致病害的特點1、鞭毛菌亞門的主要特點(1)鞭毛菌亞門真菌的共同特征是無性產生具 1-2 根鞭毛的游動孢子，因此通常稱作鞭毛菌。(2)鞭毛菌有性產生休眠孢子囊和卵孢子。(3)鞭毛菌營養(yǎng)體從原質團到無隔菌絲體，屬低等真菌。(4)鞭毛菌大

3、多具有水生習性，因此只有在高濕、多雨、低洼積水和通風透光不好的條件下，侵染植物導致病害。(5)鞭毛菌繁殖時，有的整個營養(yǎng)體全部轉變?yōu)榉敝丑w，稱為整體產果，如壺菌；有的只是營養(yǎng)體的一部分轉變?yōu)闋I養(yǎng)體，稱為分體產果。(6)游動孢子囊形態(tài)多樣，均可釋放游動孢子。(7)游動孢子具 1-2 根鞭毛。鞭毛有茸鞭和尾鞭兩種。每個游動孢子具單鞭或雙鞭兩種類型。(8)鞭毛(Flagellum)的結構是 9+2 型。既鞭桿是由 9 根纖絲組成一個圓筒型體，圓筒型體中心還有 2 根纖絲。纖絲之間填充有膠質鞘。共 31 條亞纖絲。2、鞭毛菌亞門的致病特點(1)常見癥狀：腐爛、斑點、猝倒、流膠。(2)果實上腐爛使果變褐

4、色、呈軟腐狀，病部長出白色綿毛狀或灰白色霜狀霉層。(3)莖基和根部被害使皮層變褐色腐爛。(4)葉上斑點，若由疫霉引起，病斑較大，暗褐色圓形水漬病斑；若由霜霉引起，病斑較小，黃色至褐色，邊緣不明顯，病斑受葉脈限制呈多角形，后期在病斑上長出白色至灰白色霜狀霉層。(5)病菌以卵孢子越冬，由孢子囊和游動孢子引起初侵染和再侵染，借雨水和氣流傳播。(6)潛伏期短，可多次再侵染，一般在低溫多雨潮濕多霧、晝夜溫差大的氣候條件下，病害容易發(fā)生。3、與園藝植物有關的鞭毛菌(1)根腫菌屬（Plasmodiophora）由根腫菌屬的病菌引起的，在病組織內這些呈魚卵狀排列的是病菌的休眠孢子囊。休眠孢子囊在寄主細胞內分散

5、呈魚卵塊狀，萌發(fā)時產生前端有 2 根鞭毛長短不一的游動孢子。休眠孢子囊對不適宜的環(huán)境適應性強，能在土中存活多年，是病菌的初侵染源。（2）腐霉屬（Pythium）腐霉是低等的鞭毛菌，無性繁殖在菌絲頂端形成孢子囊，孢子囊近球形或不規(guī)則形，成熟后一般不脫落，萌發(fā)時產生游動孢子。有性繁殖在藏卵器內形成一個卵孢子。如引起黃瓜、茄子等幼苗瘁倒病的病菌，都屬于腐霉屬。(3)疫霉屬（Phytophthora）孢子囊在孢囊梗上，孢囊梗無限生長。孢子囊卵圓形，成熟時脫落，萌發(fā)時產生游動孢子，或直接萌發(fā)長出芽管。有性生殖在藏卵器內形成一個卵孢子。(4)霜霉科（Peronosporaaceae） 高等的鞭毛菌，都是植

6、物體上的活體寄生菌，菌絲蔓延在寄生的細胞間，以吸器伸入寄主的細胞內吸收養(yǎng)分。孢囊梗有限生長，呈樹枝狀分枝。孢子囊在孢囊梗上形成，孢子囊卵圓形，頂端乳頭狀突起，萌發(fā)產生游動孢子，或直接長出芽管。有性生殖形成卵孢子。(5)白銹菌屬(Albugo)活體寄生物，菌絲在寄主細胞間蔓延，以吸器伸入寄主細胞內吸收營養(yǎng)。孢囊梗 不分枝，短棍棒狀，密集在寄主表下，排列成柵欄狀，每一孢囊梗 頂端串生孢子囊。孢子囊橢圓形，成熟后寄主表皮散出如白銹粉。卵孢子壁厚，表面有瘤狀突起。12 接合菌亞門及其所致病害的特點接合菌亞門及其所致病害的特點1、接合菌亞門的主要特點（1）菌絲體無隔多核，細胞壁由甲殼質組成。（2）無性生

7、殖形成孢子囊，產生不能游動的孢囊孢子。（3）有性生殖形成接合孢子。2、接合菌亞門的致病特點其多為腐生菌，廣泛分布于土壤和糞肥中，少數(shù)為弱寄生菌，可引起果實貯藏期腐爛。已知接合菌亞門分 2 個綱、7 個目、約 600 個種。與園藝植物病害有關的是接合菌綱、毛霉目、根霉屬。3、與園藝植物有關的接合菌根霉菌（Rhizopus）（1）菌絲發(fā)達，分布在基物上和基物內，有匍匐絲和假根。（2）孢囊梗從匍匐絲上長出，頂端形成孢子囊，內生孢囊孢子，孢子囊壁破散出孢囊孢子。（3）有性生殖形成接合孢子（不常見）。（4）黑根霉引起貯藏甘薯軟腐病。13 子囊菌亞門及其所致病害的特點子囊菌亞門及其所致病害的特點1、 子囊

8、菌亞門的主要特點（1）營養(yǎng)體全世界發(fā)現(xiàn) 32,000 種，占真菌的 1/3，都是高等真菌，寄生，形態(tài)千差萬別，但共同點是形成子囊。子囊(Ascus)，子囊孢子(Ascospore)。簡單的僅為單細胞，但大多數(shù)有發(fā)達的菌絲體，菌絲有隔，每個細胞有一個、二個、多個核，壁以幾丁質為主，營養(yǎng)體可以形成厚垣孢子。有的菌絲可以直接形成粉孢子，芽孢子。很多可以形成營養(yǎng)菌絲的組織體。（2）子囊菌的無性繁殖產生分生孢子或孢子器，非常發(fā)達，形狀多樣，圓形，卵形，棒形，絲狀，鐮刀形(新月形)，蠟腸形，有單孢，雙孢，多孢。有的有色，有的無色。分生孢子梗：可以分枝或不分枝，散生，叢生，束生，(孢梗束 Coremium)

9、，有的分生孢子梗著生在簡單的分生孢子痤上(Sporodochium)，有的形成在分生孢子盤上(Acervulus)，有的形成分生孢子器上(Pycnidium)。分生孢子作用：在一個生長季可以反復發(fā)生，是再侵染的來源，“可以遠距離傳播”，有的高等子囊菌在一生中僅發(fā)生無性，無有性。（3）子囊菌的有性繁殖子囊：子囊形狀有圓形，橢圓形或棒狀。子囊壁有的單層壁，有的雙層壁,有的囊壁成熟后溶解，有的不溶，有的子囊頂有孔口，有的無孔口。子囊有的單個散生，有的多個并列，有的叢生。子囊之間的有的有側絲。子囊孢子（Ascospore）：形態(tài)多種多樣，圓形，橢圓形，絲狀，單胞，雙胞，多胞，無色或有色。在子囊內排列的

10、有散生，單列，雙列，并列，螺旋形排列。子囊果（Ascocarp）：在子囊外部具一菌組織包被的殼，這種類型的子實體稱子囊果。子囊果的類型A、 閉囊殼完全封閉呈球形。B、子囊殼球形或瓶狀，頂端有孔口。C、子囊盤盤狀或杯狀，頂端開口大。D、子囊座子囊著生在子座的空腔內。2、 與園藝植物有關的子囊菌(1)外囊菌屬（Taphrina）無子囊果，子囊平行排列在寄主表面呈柵狀。無性繁殖是子囊孢子在子囊內芽殖產生芽孢子，芽孢子還可繼續(xù)芽殖。常見病狀：畸形，葉片皺縮、果實膨大等。(2)白粉菌目 (Eryshiphales) 白粉菌目的真菌一般稱作白粉菌，引致各種植物白粉病(Powdery mildew)。 菌絲

11、白色，大都表生，產生吸器吸取植物營養(yǎng)。 主要寄生在葉片上，有的發(fā)生在新梢或芽上。在病部形成白粉或小黑點。 無性世代：非常發(fā)達，由菌絲形成分生孢子梗和分生孢子。分生孢子鏈生或單生，不斷產生。形成白粉。 有性世代：寄生后期在菌絲的上部形成閉囊殼(小黑點)，有附屬絲，便于傳播。閉囊殼內有一個或多個子囊，子囊內有 2-8 個子囊孢子，子囊孢子單孢無色。 寄生專化性：專性寄生，有生理小種，寄主有 8435 種。有的白粉菌只有一種寄主，而一種寄主可寄生多種白粉菌。如：桑樹有桑表白粉，桑里白粉。柞樹有七種白粉病。白粉病發(fā)生的條件：對溫度要求不嚴格，干旱地區(qū)、潮濕地區(qū)都可發(fā)生，白粉菌的孢子在水中反而不易發(fā)芽或

12、破裂，在潮濕的空氣中易發(fā)芽，該孢子滲透壓很高，36-68 個大氣壓，因此很易吸收周圍的空氣中的水分。白粉菌分屬依據(jù)：閉囊殼附屬絲的形狀和殼內子囊的數(shù)目。白粉菌（閉殼菌）：菌絲以吸器吸收營養(yǎng)；子囊著生在閉囊殼內，外部有附著絲；菌絲分化成分生孢子梗，頂端串生分生孢子，呈白粉狀故名白粉菌。(3)核菌主要特點A、這類真菌種類多，形態(tài)變化大，子囊著生在具有孔口的子囊殼內。B、子囊殼散生或聚生在寄主的組織中，子囊內具 8 個子囊孢子。C、病害流行是分生孢子多次再侵染。D、病害癥狀：引起樹皮腐爛、潰瘍、瘤腫和枝枯；侵害果實引起腐爛和輪紋等癥狀。主要種類A、小叢殼屬 Glomerella子囊殼小，球形，半埋生

13、在子座內；子囊棍棒狀，無側絲；子囊孢子單孢無色，長橢圓形，稍彎曲。有性世代在自然界很少發(fā)生，無性世代為炭疽菌屬(Colletotrichum)。如棉花炭疽病 G.gossypii，蘋果梨炭疽病 G.cingulata。B、黑腐皮殼屬 （Valsa）子囊殼埋生子座基部，有長頸伸出子座；子囊孢子臘腸狀，單胞無色或暗色。無性世代是殼囊孢屬(Cytospora)。只能為害樹皮，不能為害綠色部分。蘋果樹腐爛病。C、囊孢殼屬（Physalospora）無子座。子囊殼黑色，埋生于寄主組織內。子囊較大，棍棒狀，子囊孢子單胞，無色，長度一般大于 20um.引起園藝病害如梨輪紋病等。D、間座殼屬（Diaporth

14、e）子囊殼埋生在子座基部，梨形或球形，黑色，頂端有短喙狀突起。子囊圓柱形，有頂環(huán)。子囊孢子線形多胞。無性世代不發(fā)生。如引起茄褐紋病。（4）腔菌主要特點A、子囊著生在子座的空腔內，子囊間無側絲，子囊具雙層壁 。B、無性生殖發(fā)達，可形成各種形態(tài)的分生孢子，對植物危害主要是分生孢子侵染。C、病害癥狀：斑點、瘡痂和腐爛。主要種類A、痂囊腔菌屬 Elsinoe子囊在子囊腔中不規(guī)則散生，每個子囊腔只有一個球形子囊，子囊孢子長圓筒形，3隔 4 胞、無色。為害植物主要是無性世代，在分生孢子盤上產生分生孢子。(痂圓孢屬Sphaceloma)我國有性世代未發(fā)現(xiàn)，主要無性。代表：葡萄黑痘病。球座菌屬 Guignar

15、diaB、球座菌屬 Guignardia本屬與上屬形態(tài)基本一致，本屬子囊孢子單胞（假雙孢）。無性世代很發(fā)達，包括在葉點菌屬和莖點菌屬。葡萄黑腐病菌 G.biwellii，葡萄房枯病菌 G.baccae。C、球腔菌屬 Mycosphaerella子囊座著生在寄主葉片表皮層下；假囊殼為埋生、球形，或扁圓形，孔口扁平或呈乳頭狀突起。子囊孢子橢圓形、無色，雙胞大小相等。無性世代包括許多屬，如葉點菌屬Phyllosticta，莖點菌屬 Phoma，尾孢屬 Cercospora。代表：禾本科植物黑霉病D、黑星菌屬 Venturia假子囊殼很小，表面生有剛毛，埋生或表生。子囊孢子橢圓形，雙胞大小不等，淡色，

16、個別褐色，可為害植物葉片和果實。無性黑星孢 Fusicladium代表病害：梨黑星病 V.pirina 蘋果黑星病 V.inaequelis（5）盤菌子囊果呈盤狀或杯狀，內生子囊。子囊盤有些從菌核或假根菌核上長出，盤菌一般很多不產生分生孢子。盤菌引起植物病害大多腐生，少數(shù)寄生。核盤菌屬 Sclerotinia菌絲體可以形成菌核（真菌核和假菌核），菌核萌發(fā)后可形成長柄子囊盤，子囊棍棒狀，平行排列，有擬側絲。子囊孢子橢圓形或仿綞形，單胞無色。無性世代不發(fā)生。寄主范圍很廣，可侵染 32 科 160 多種植物。代表：油菜、向日葵菌核病14 擔子菌亞門及其所致病害的特點擔子菌亞門及其所致病害的特點 1

17、銹菌膠銹菌屬（Gymnosporangium）冬孢子雙細胞，有可以膠化的長柄。沒有夏孢子階段。梨銹病（G. haraeanum ）冬孢子階段在檜柏上，性孢子和銹孢子在梨樹上引起梨銹病。柄銹菌屬(Puccinia)孢子雙細胞、有柄，夏孢子單細胞，小麥銹?。盒←湺掍P病( P. graminis )；小麥條銹病(P. striiformis )；小麥葉銹病( P. recondite f.sp tritici)。層銹菌屬（Phakopsora）冬孢子單細胞，無柄，不整齊地排列成數(shù)層；夏孢子表面有刺。棗層銹菌（P. ziziphi-vulgaris ）引起棗樹銹病。多胞銹菌屬（Phragmidium

18、）冬孢子 3 至多細胞，壁厚，表面光滑或有瘤狀突起，柄的基部膨大。玫瑰多胞銹菌（P. rosae-multiflorae ）引起玫瑰銹病。單胞銹菌屬（Uromyces ）冬孢子單細胞，有柄，頂壁較厚；夏孢子單細胞，有刺或瘤狀突起。瘤頂單胞銹菌（U.appendiculatus）引起菜豆銹病。柵銹菌屬（Melampsora）冬孢子單細胞，無柄，排列成整齊的一層；夏孢子表面有疣或刺。亞麻柵銹菌（M.lini）引起亞麻銹菌病。（2）黑粉菌目（Ustilaginales）以雙核菌絲在寄主的細胞間寄生，有吸器伸入寄主細胞內。典型特征是形成黑色粉狀的冬孢子。黑粉菌分類主要以冬孢子的形狀、大小、有無不孕細胞

19、、萌發(fā)的方式及冬孢子球的形態(tài)等。引起園藝植物的病害有：茭白黑粉病、慈。（3）層菌病原菌特征：具較發(fā)達的擔子果，大多腐生，少數(shù)是植物病原菌。擔子果如膏藥狀、馬蹄狀、傘狀。層菌常產生有性孢子，很少產生無性孢子。病害主要通過土壤中的菌核、菌絲或菌索進行傳播和蔓延。層菌是弱寄生菌，經傷口侵入到果樹的根部或枝干的維管束，主要破壞木質部，造成根腐或木腐。15 半知菌亞門及其所致病害的特點半知菌亞門及其所致病害的特點1、半知菌亞門的主要特點常見的有 4 種：（1）分生孢子梗束（synnema）：呈束狀，基部聚生在一起，頂部分散，著生孢子。（2）分生孢子座（sporodochium）：很短的分生孢子梗聚集而成

20、，墊狀或瘤狀，其上產生分生孢子。（3）分生孢子器（pycnidium）：分生孢子器（pycnidium）：球形、近球形、瓶狀或不規(guī)則形的子實體，具孔口，孢子梗聚生其內。（4）分生孢子盤（acervulus）：菌絲糾結形成盤狀的子實體，有的分生孢子盤中央或四周具深褐色的剛毛。3、 與園藝植物有關的半知菌(1)叢梗孢菌粉孢屬(Oidium)分生孢子梗直立。頂部產生菌鍵型的分生節(jié)孢子(粉孢子)。分生孢子串生，單胞無色。引起白粉病，為白粉菌的無性階段 橡膠粉孢(O.heveae )引起三葉橡膠樹的白粉病。輪枝孢屬(Verticillium)分生孢子梗輪狀分枝，產孢細胞基部略膨大；分生孢子為內生芽殖型，

21、單細胞，卵圓形至橢圓形，單生或聚生。黃萎輪枝孢(棉黃萎病菌 V.albo-atrum )引起棉花黃萎病。青霉屬(Penicillium )分生孢子梗直立，頂端一至多次分枝，形成掃帚狀。分枝頂端產生瓶狀小梗，小梗頂端產生成串的分生孢子，分生孢子球形、單孢。指狀青霉病菌（P.digitatum ）引起柑桔綠霉病。葡萄孢屬(Botrytis )分生孢子梗無色，頂端細胞膨大成球形，上面有許多小梗；分生孢子單胞，無色，橢圓形，著生小梗上聚集成葡萄穗狀?；移咸焰?B.cinerea)引起多種植物灰霉病。褐孢屬(Fulvia )分生孢子梗黑色，頂端或中部形成分枝，分生孢子黑褐色，卵圓形、圓筒形或不規(guī)則形。引

22、起的病害如番茄葉霉病、黃瓜黑星病等。 尾孢屬（Cercospora）分生孢子梗屈膝狀，青褐色至黑褐色，分生孢子多細胞，線形、鞭形至蠕蟲形。如花生褐斑病、菜豆紅斑病、豇豆煤霉病等。 鏈格孢屬(Alternaria )分生孢子梗深色，頂端單生或串生淡褐色至深褐色、磚隔狀的分生孢子。分生孢子倒棍棒形、橢圓形或卵圓形，頂端有喙狀細胞。大孢鏈格孢(A. macrospora )引起棉花輪紋斑病。鐮孢霉屬(Fusarium )大型分生孢子多細胞，鐮刀型；小型分生孢子單細胞，橢圓形至卵圓形。麥類赤霉病，瓜類枯萎病。（2）黑盤孢菌黑盤孢目真菌的分生孢子梗產生在分生孢子盤上。有的分生孢子盤四周或分生孢子梗之間具

23、有黑色的剛毛。黑盤孢目真菌引起的病害如蘋果褐斑病、蘋果、辣椒、茄子、黃瓜棉花等的炭疽病等。（3）球殼孢菌分生孢子器球形，暗褐色，分生孢子單胞，無色，圓柱形至紡錘形。分生孢子著生在分生孢子器內。引起的病害如蘋果樹腐爛病、梨干腐病、蘋果及梨輪紋病、棉花褐斑病、芹菜斑枯病、茄子褐紋病等。（4）無孢菌:除產生厚垣孢子外，不產生任何其它孢子。只有菌絲體，有時可形成菌核。第二部分第二部分 微生物病理實驗基本操作微生物病理實驗基本操作21 植物病理徒手制片技術植物病理徒手制片技術一、實驗目的一、實驗目的 觀察植物病害病原物的形態(tài)，進行病原物的分類鑒定，研究受病組織的組織結構病變，受病植物組織與病原物的解剖學

24、關系以及對于難得一見病原物的保存?zhèn)溆玫?，都需將材料制成適當?shù)娘@微玻片標本。因此，徒手制片技術也是植物病理學研究的重要手段之一。通過本次實驗系統(tǒng)學習實踐常用的徒手制片技術，為普通植物病理學和農業(yè)植物病理學的深入學習以及以后開展病理學的有關研究工作奠定堅實的制片技術基礎。二、內容、材料和方法二、內容、材料和方法 徒手制片的方法有整體封藏法、徒手切片法、組織透明制片法和涂抹制片法等多種。限于時間本實驗實踐最為常用的整體封藏法和徒手切片法兩種。( (一一) )整體封藏法整體封藏法 對于生長在植物病部表面或培基上的菌絲體、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及線蟲等，可直接擇取少許封藏在適當?shù)母≥d劑中，

25、在顯微鏡下觀察，根據(jù)材料的特點和觀察的目的可采用不同的方法封藏制片。常用的方法的概括為挑、刮、撥、撕四種。 1挑：對于在植物受病部位或基質表面生長繁茂的霉狀病原體(如霜霉菌)粉狀病原體(如銹菌、白粉菌)以及培養(yǎng)基上的許多培養(yǎng)菌，可用尖細的解剖針等直接挑取封埋制片，挑取病原體的量，在保證選材典型的前提下，越少越好，以免互相重疊，分辯不清。 取黃瓜霜霉病葉，小麥白粉病葉分別挑取霉狀物和粉狀物鏡檢病原菌的形態(tài)特點。 2刮：對病部病原體稀少，或用放大鏡也難辯認霉層的病害標本，可采用兩側具刀的三角刮針(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮針的一刃，蘸浮載劑少許，在病部順同一個方向刮取 23

26、次，將刮得的病原蘸在載玻片的浮載劑中封片鏡檢。浮載劑在保證浮載質量的前提下要盡量少，否則少量的病原體在大滴的浮載劑中極易分散漂流，在顯微鏡下難以尋找。取玉米小斑病葉，在病斑背面刮制片，鏡檢分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)。 3撥：對于產生在植物表皮下或半埋生于基物內的病原體孢子器官。如子囊殼、分生孢子器、閉囊殼等，可將病原體連同寄主組織一同撥下，放入浮載劑中，用兩支解剖針，一支穩(wěn)定材料，另一支撥出植物組織，使病原體外露制片。取小麥全蝕病或白粉病標本，撥小黑點制片，鏡檢子囊果的形態(tài)。 4撕：對于寄生在植物表皮細胞上的病原真菌，也可以將此有病原物的表皮撕下來制片鏡檢，這種方法不僅能看到病原物形態(tài)，而且可

27、以觀察病原物與寄主的解剖學關系。 在毛毛雨天自田間取回感染白粉病的麥苗(或在保溫箱中取接種染病的麥苗)。用刀片割破葉背表皮再用小鑷子輕輕撕下，放在浮載劑中制片鏡檢白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形態(tài)。( (二二) )徒手切片法徒手切片法 欲觀察受病組織病變，病菌侵入和寄主體內擴展過程，以及埋生在基物內真菌子實體的形態(tài)結構等，都需將有關材料切成薄片，進行鏡檢，徒手切片是最常用的簡便易行的方法，不需要特殊的設備，而且節(jié)省時間，切成的片子不僅可作臨時觀察，也可進一步制成永久性玻片標本。 徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。切片時先選取材料并作適當?shù)男拚?，以左手的食指和姆指捏住材料，中指頂住材料下端，?/p>

28、材料上端突出于手指以上 23 毫米。右手握穩(wěn)刀，從左向右后方斜向切割。注意刀口必須以材料面垂直。否則所得切面不正。同時雙手不應緊靠身體，而是要活動自如。用臂力均勻地沿刀口后部起拉向前方，連續(xù)切割 45 片后，用毛筆蘸水輕輕沿刀口取下，放入盛有水的淺玻皿中，在此過程中左手握著的材料不要放下，否則再切時難按原位置拿材料，此外，在切片過程中，必須常用毛筆蘸水濕潤材料，以免材料干涸不便切割。 對于過于柔軟或較薄的材料，可以夾在“夾持物”中，進行切片更為方便。新鮮胡鮮卜和馬鈴薯塊都可作“夾持物”用。實驗室中通常將通草、接骨木或向日葵的莖髓，剪成適當大小，浸于 70%酒精中備用。 切割一定數(shù)量的薄片后，用

29、移置環(huán)在淺玻皿中選取合用的材料薄片，放在載玻片的水滴中，鏡檢合格者即酒精燈上將水烘干并擺正材料，然后加一滴乳酚油或其浮載劑；放在展片臺上略加熱，鏡檢如無氣泡，即可小心加蓋片，用吸水紙吸除多余的浮載劑，最后貼好標簽，平放于切片板上，待干燥適宜時封固。 徒手切片的缺點是對于微小或過大，柔軟、多汁、肉質及堅硬的材料不易切取，也難制成連續(xù)切片，此外切片的厚薄也難一致。切片機切片即可克服這些缺點。三、作業(yè)和思考題三、作業(yè)和思考題 1 每人交兩片符合質量要求的玻片標本。 2 整體封藏法和徒手切片法兩種基本徒手制片技術都在什么情況下使用? 徒手切法制片有什么優(yōu)缺點? 怎樣解決這種方法本身存在的問題?22 培

30、養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基的配制和滅菌一、一、 實驗目的實驗目的 微生物的生長發(fā)育都有一定的營養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)的基質。培養(yǎng)基配好后必須經過滅菌方能用于分離培養(yǎng)微生物試驗，因此培養(yǎng)基的配制和滅菌是植物病理實驗室中最基本的工作，通過本次實驗學習植病實驗室中常用培養(yǎng)基的配制方法和高壓滅菌鍋的使用方法。二、內容、材料和方法二、內容、材料和方法 (一)培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基按組成成分及對這些成分了解的程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基和組合培養(yǎng)基三類，從物理性質上又分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩類，培養(yǎng)基的種類不同，配制方法也有差異，限于時間，本次實驗僅配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基

31、和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA） 這是植病實驗室最常用的培養(yǎng)基(簡稱 PSA)，主要用于植物病原真菌的分離和培養(yǎng)，有時也用于植物病原細菌。 成分：馬鈴薯 200 克 蔗 糖 10 克 瓊 脂 20 克 加水至 1000 毫升 方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時，用雙層紗布濾去薯塊，補足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基略帶酸性，培養(yǎng)真菌無需調節(jié) pH，培養(yǎng)細菌則調節(jié) pH 至中性，此培養(yǎng)基留作下次實驗分離培養(yǎng)病原真菌用，故不必調節(jié) pH。 5 人分作一組，1、2 組各作此培養(yǎng)基 500 毫

32、升，其中 200 毫升分裝試管，每管約 10 毫升，滅菌后擺成斜面；其余 300 毫升，分裝在 3 個 250300 毫升的三角瓶中，每瓶裝 100毫升左右，滅菌后妥善保存，留待下次實驗使用。2牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA） 這種培養(yǎng)基主要用于細菌的分離和培養(yǎng) 成分：牛肉浸膏 3 克 蛋白胨 10 克 蔗糖 10 克 酵母浸膏 1 克 瓊脂 20 克 加水至 1000 毫升 方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開加入，調節(jié) pH至 7，趁熱用雙層紗布過濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。 牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，

33、再開始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。 調節(jié)培養(yǎng)基 pH 至中性的方法如下：配成 1N 的 HCl 和 NaOH，并另分別稀釋配成 1/20 N 的 HCl 和 NaOH。取培養(yǎng)基 2 毫升，加蒸餾水 7.5 毫升，加指示劑溴百里酚藍指示劑 5 滴，這時如培養(yǎng)基的測樣呈黃色則用有刻度吸管加入 1/20 N 的 NaOH 若呈藍色則加入 1/2O N的 HCl，使培養(yǎng)基最后呈草綠色即調節(jié)到中性，此刻所加酸或堿的毫升數(shù)的 25 倍即等于在1000 毫升培養(yǎng)基中所需要加入 lN 的 NaOH 或 HCl 的毫升數(shù)(注意這次是作 500 毫升培養(yǎng)基)，加蒸餾水稀釋的目的防止調節(jié)過程中

34、培養(yǎng)基凝固。調節(jié) pH 至中性的簡便方法是用石蕊示紙。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍或其它指示劑 12 滴，根據(jù)顏色反應，在所配的培養(yǎng)液中加入少量 lN的 NaOH 或 HCl，然后再取樣測定，如此反復多次，達到所需求的反應為止。 5 人分為一組，3、4 兩組各作此培養(yǎng)基 500 毫升，其中 200 毫升分裝試管，每管約100 毫升，滅菌后擺成斜面，其余 300 毫升分裝在 3 個 250300 毫升的三角瓶中，每瓶裝100 毫升左右，滅菌后妥善存放，留待下次實驗使用。 圖： 培養(yǎng)基的分裝裝置與棉塞。A. 培養(yǎng)基的分裝 1.正確 2.管內太短，外部太松B. 棉塞的做法 3

35、.整個棉塞太松 4.管內太緊，外部太短松此外，1、2、3、4 各組均制備 15 管試管裝和 2 瓶三角瓶裝的無菌水。 (二)培養(yǎng)基的滅菌 為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，配好的培養(yǎng)基必須經過滅菌才能使用，滅菌是指用物理或化學方法完全殺死器物表面及其內部的所有微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指消滅器物或植物組織表面的某些微生物(能常稱雜菌)，而不是消滅所有的微生物。 滅菌的方法很多，植病實驗室常用的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培養(yǎng)皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進行滅菌。而培養(yǎng)基和實驗用的土壤，則用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌，具體滅菌方法和步驟如下： 1 干熱滅菌法 (1)將培養(yǎng)皿、吸管等

36、玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個吸管用紙包好后裝入鐵筒)，包紙時應將吸取的一端放在取時先折開的一端，以便取用時手勿觸及要求滅菌的一端。 (2)將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。 (3)關緊箱門，打開排氣孔接上電源。 (4)待箱內空氣排出到一定程度時，閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，用定溫固定溫度，滅菌溫度一般 165175保持 1 小時即可。 (5)待自然降溫冷卻后(60以下)才能開門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。 2 高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來提高蒸汽的溫度，達到滅菌的

37、目的，其操作步驟如下： (1)關好排水閥門放入清水至標度為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。 (2)將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關上器蓋，旋緊螺旋時，先將每個螺旋旋轉到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對的兩個螺旋，以達到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達不到徹底滅菌的目的。 (3)通電加溫，同時打開排氣活門，排盡鍋內的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時則表示徹底，此時可關閉排氣活門，如果過早關閉活門，排氣不徹底，也達不到徹底滅菌的目的。通常當壓力表指針升至 5 磅時，打開排氣活門放氣，降至零點，再關閉活門。 (4)壓力表的指針上升時，鍋內溫度也逐漸升高

38、，當壓力表指針升至 15 磅時，蒸氣溫度相當于 120121(等于一個大氣壓)，此時開始計算滅菌時間，控制熱源，使處于 15磅壓力保持 30 分鐘，即能達到完全滅菌的目的，然后停止加溫。 (5)稍微打開一點排氣活門，使鍋內蒸氣緩慢排除，然后逐漸開大活門，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過快，否則會使鍋內的培養(yǎng)基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培養(yǎng)基在鍋內，受高溫處理時間過長，這樣對培養(yǎng)基也是不利的。一般從排氣到打開鍋蓋以10 分鐘左右為好。 (6)當壓力表指針降到零、鍋內蒸氣完全排盡時，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基，如需制備固體斜面培養(yǎng)基時，則應趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報紙以免落灰塵，冷卻后便可收

39、起。 (7)最后將高壓滅菌器內的剩余水排出。 (8)抽取上述滅菌的培養(yǎng)基，放入 25溫箱中，48 小時后不見雜菌生出，便證明培養(yǎng)基已達到滅菌目的，可以使用。 此外，有些培養(yǎng)基在經高壓滅菌后，其營養(yǎng)成分容易分解而失去使用價值，此時可采用間歇蒸氣滅菌法，即將培養(yǎng)基放入高壓滅菌器內，加熱至 100，保持 1 小時，每天滅菌一次，連續(xù)進行三次，即可達到滅菌的目的，又不至使營養(yǎng)物質分解。三、思考題三、思考題 1 培養(yǎng)基有哪幾種類別? 各有什么特點和用途? 2 干熱滅菌和高壓蒸汽法適用范圍如何? 電熱烘箱和高壓鍋如何操作? 各有哪些使用注意事項? 3 怎樣檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?23 植物病原菌的分離和培

40、養(yǎng)植物病原菌的分離和培養(yǎng) 一、實驗目的一、實驗目的 在研究病原菌的形態(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對寄主植物的致病性等多種試驗中，常常需要病原菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨分選出來，叫作分離。分離和培養(yǎng)是植病實驗室最基本的操作技術之一。通過本次實驗學習植物病原菌分離培養(yǎng)的原理和常用的方法。二、內容、材料和方法二、內容、材料和方法 ( (一一) )分離材料的選擇分離材料的選擇 分離材料的選擇對分離培養(yǎng)的成敗有著決定的影響，因為在感病植物受害部位的內外，要有多種腐生菌，為減少腐生菌的污染，分離所用的病害材料應盡可能新鮮，并且最好在

41、病、健交接處選材取樣。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強、比較活躍，容易分離成功。 ( (二二) )分離方法分離方法 病原菌分離的方法因材料不同而異，植病實驗室最常見的方法有組織分離法和稀釋分離法兩種。 1.1.組織分離法組織分離法：這種方法適用于大部分病菌的分離，此法又分為小塊組織分離和大塊組織分離兩種方法。分別以玉米大斑病、小麥根腐病和梨褐腐病為試材進行。 (1)葉斑病類病原菌的分離（玉米大斑病病菌的分離） 取玉米大斑病病葉，在病、健交界處剪取 23 毫米長的病組織。用 10%漂白粉（次氯酸鈣）溶液消毒（漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）3-5min，時間長短依病組織不同而異，

42、然后直接移至 PSA 平板培養(yǎng)基上(為防止細菌污染，可在培養(yǎng)基中加入 1000ppm 鏈霉素 10 毫升)，倒置于 2025室溫下，待菌落長出后挑取前緣菌絲，回接于 PSA 斜面培養(yǎng)基上，在 25溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉至斜面培養(yǎng)基上進行純化，直至獲得純培養(yǎng)。 (2)種子內部病原菌的分離（小麥根腐病菌的分離） 選擇典型的小麥黑胚粒 34 個，在 70%的酒精中浸 23 秒鐘后，以鑷子夾住投入 0.1%升汞溶液中表面消毒 23 分鐘（處理時間可自 30 秒至 30 分鐘不等），然后取出小麥

43、粒，以滅菌水沖洗 3 次，再移至已倒好的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，注意要以小麥的黑胚部位著靠在培養(yǎng)基上，倒置在 25溫箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取前緣菌絲于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng) 3-4 天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。 (3)病組織內部病原菌的分離（梨褐腐病菌的分離） 取梨褐腐病病果沾取 95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在燈焰滅過菌的解剖刀在果面病、健交界處切開，挑取豆粒大小的病組織放到馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，每皿放34 塊，倒置于 25溫箱中培養(yǎng) 23 天。菌絲長出后轉至馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 3-4 天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。 2.2.稀釋分離法稀釋分離法：稀

44、釋分離法適用于細菌、土壤菌及產生孢子多的真菌等病原菌的分離，本次實驗以白菜軟腐病作為材料進行分類離。 白菜軟腐病最易伴生腐生細菌，分離時需以病組織接種健康菜幫上，經數(shù)次轉種予以純化，其純化方法是將菜幫經多次換水沖洗后，再用無菌水洗三次，切成適當大小，放在15 厘米直徑的培養(yǎng)皿中，菜幫下襯以吸水紙保溫。用無菌解剖刀挑取病組織少許抹在菜幫的人為傷口上，培養(yǎng)在 2025下，經 1 天左右呈現(xiàn)腐爛，如此反復轉種幾次，至病斑純凈為止。 分離時，在新的水爛斑邊緣挑取少量病組織在無菌水試管中配成菌懸液，取滅菌培養(yǎng)皿 3 付，標好次序，其內各置無菌水 1 毫升，用移置環(huán)移取菌懸液一環(huán)，放在第 1 皿水中混合均

45、勻，從中挑取一環(huán)稀釋液至第 2 皿，再以同法稀釋成第 3 皿，取熔化后冷至 45左右的(一般將化好的培養(yǎng)基瓶靠近鼻尖，以不燙為度)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每皿倒約 15 毫升，沿著桌面輕輕搖勻，凝固后倒置于 2628的溫箱中培養(yǎng)，12 日后可見白色，圓形或近圓形直徑為 12 毫米的菌落，從中選典型菌落用移植環(huán)（劃線法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每組轉 45 管，注意過早出現(xiàn)的大型菌落多為腐生細菌。 以上分離實驗也可以劃線法進行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿，每皿倒入約 15 毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻，制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個培養(yǎng)皿平面培養(yǎng)基的左

46、方長方形區(qū)內劃平行線 57 條，再以此移置環(huán)繼續(xù)向右(和左方小區(qū)內的幾條平行線成一定角度)劃 57 條平行線，依此法劃兩皿，倒置于2628溫箱中培養(yǎng)，12 日后挑單個典型菌落移到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)待用。 如果因季節(jié)關系難得白菜軟腐病試材，則可用黃瓜細菌性角斑病、棉花角斑病、水稻白葉枯病病葉作試材進行分離培養(yǎng)實驗。方法是取新鮮病葉，在病、健交接處取幾小塊病組織，以無菌水經多次換洗表面消毒后，放在比色板或凹玻片的凹窩內(凹窩要經兩次酒精火焰消毒)，以吸管吸取無菌水滴入窩，并以滅菌的玻璃棒搗碎病組織，靜置幾分鐘可得菌懸液，之后以上述劃線法進行分離，注意葡萄糖對稻白葉枯病菌有抑制作用，故分離稻白葉枯病

47、菌不能用葡萄糖配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。平板劃線操作示意圖三、實驗準備三、實驗準備 ( (一一) )清潔環(huán)境清潔環(huán)境：分離工作嚴格說應在無菌條下進行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設施。若限于條件實驗只能在普通房間進行時，必須對房間進行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內塵埃，分離開始前準備好一切用品，避免工作過程中頻繁走動，以破壞環(huán)境帶來雜菌，工作臺上鋪好濕毛巾，點燃酒精燈。 ( (二二) )實驗材料及用品準備實驗材料及用品準備 本次實驗 3-5 人一組，請認真檢查好下試材和用品是否齊備。 11病組織材料病組織材料 小麥根腐病黑胚粒 5 粒。 玉米大斑病病葉 1 片。 白菜軟

48、腐病病幫 3 塊(相鄰兩組共用)； 梨褐腐病病果 1 個(相鄰兩組共用)。 22用品準備用品準備 0.1%升汞溶液(廣口瓶盛裝)； 95%酒精(廣口瓶盛裝)； 1000ppm 鏈霉素； 瓶裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基； 瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基； 此外，還有以下備品，無菌水 1 瓶，滅菌培養(yǎng)皿 6 付，滅菌 1 毫升吸管 2 支，解剖剪、解剖刀和鑷子各 1 把，移植環(huán)，移植鉤、酒精燈、琺瑯盤和試管架各 1 個，毛巾 1 條，玻璃鉛筆 1 支及火柴等。四、思考題四、思考題 1 分離植物病原菌常用的方法有幾種? 這些方法適用于分離哪類病原菌? 怎樣分離? 2 分離植物病原物時，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病

49、健交界處取樣? 沒有新鮮病材料怎么辦? 3 試分析分離工作成敗的原因。24 真菌孢子的萌發(fā)真菌孢子的萌發(fā) 一、實驗目的一、實驗目的 欲了解病菌生活力的強弱，生存期的長短，有效傳播距離，抗藥性的大小，生活史，環(huán)境與發(fā)病的關系以及有些病菌的種類鑒定等，都必須進行孢子萌發(fā)試驗。孢子能否萌發(fā)，萌發(fā)率的高低，萌發(fā)勢的強弱以及萌發(fā)的方式等既受病菌自身內在的因素影響，也受外界環(huán)境條件制約，因此要達到萌發(fā)試驗的目的，必須充分掌握萌發(fā)所需的各種條件，本次實驗主要學習孢子萌發(fā)常用的方法，同時通過實驗理解各種孢子萌發(fā)所需條件不同。二、內容、材料和方法二、內容、材料和方法 孢子萌發(fā)的方法很多，有些真菌的孢子須用特殊的

50、方法才能萌發(fā)，以下僅實驗常用的方法。 ( (一一) )懸滴法懸滴法 1材料：玉米大斑病菌斜面菌種。 2方法：在潔凈的蓋玻片中央滴玉米大斑病菌孢子懸浮液一滴，注意滴成圓形，大小適當，菌懸液濃度以顯微鏡低倍鏡頭每個視野約 20 個孢子為宜。然后翻轉蓋片制成懸滴，并封閉在特制的玻環(huán)內，再將玻環(huán)放在底部盛少許水的培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，放置在 2628溫箱中培養(yǎng)，45 小時后檢查萌發(fā)結果。 此法也可改用直接用培養(yǎng)皿蓋的里面作懸滴進行，即用玻璃筆在皿蓋里面劃方格，在方格中央滴孢子懸液，然后慢慢轉皿蓋。蓋在盛有少量蒸餾水的皿底上，保溫保濕培養(yǎng)，此法的優(yōu)點是簡便，而且適用于大量孢子萌發(fā)測定。 ( (二二) )液

51、滴法液滴法 1.材料：小麥根腐病菌斜面菌種。 2.方法：在培養(yǎng)皿內放一“井”字或“U”形玻璃棒，皿底加蒸餾水少許或襯上吸水紙或加幾個脫脂棉球吸水保濕，玻璃棒上放載玻片，其上分別滴 2 或 3 滴小麥根腐病菌孢子懸浮液濃度同(一)，蓋好皿蓋，置于 2628溫箱中培養(yǎng)，45 小時后，鏡檢萌發(fā)結果。 此法也可發(fā)展為將配好的孢子懸液直接加在培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)，一般一個培養(yǎng)皿中加10 毫升左右，不能太多，然后直接鏡檢萌發(fā)結果，優(yōu)點是一次可測定大量孢子。 ( (三三) )瓊脂培養(yǎng)基法瓊脂培養(yǎng)基法 對于某些不適于直接在水滴中萌發(fā)的真菌可采用此法。 1.材料：新采集的帶有夏孢子堆的小麥稈銹病病葉或小麥白粉病病葉

52、。 2.方法：取潔凈的載玻片，在熔化并冷至 50左右的 2%水瓊脂培養(yǎng)基中沾一下，待凝成薄層后，去掉一面瓊脂培養(yǎng)基，將有瓊脂培養(yǎng)基的一面朝上，平放在培養(yǎng)皿的“U”形玻棒上，再將稈銹菌夏孢子或白粉菌的分生孢子輕輕彈落或涂抹在瓊脂平面上。保溫培養(yǎng)，麥稈銹菌夏孢子培養(yǎng)在 20溫度下，麥白粉病分生孢子培養(yǎng)在 1012下，24 小時后鏡檢萌發(fā)結果。 此法也可以直接在培養(yǎng)皿中做成的水瓊脂平板上進行。 ( (四四) )載片引濕法載片引濕法 此法用于不適于直接在水滴中萌發(fā)的某些真菌。 1.材料：玉米瘤黑粉病菌的黑粉孢子。 2.方法：在培養(yǎng)皿中放一“V”或“U”形玻璃棒，其上放一載玻片，再取寬 1 厘米，長 4

53、 厘米的濾紙條一個放在皿內。滅菌后皿底加少許滅菌水，將濾紙條橫放在載玻片上，崩緊，兩端拖入水中，吸滴水，再在紙上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，在 25溫箱中培養(yǎng)，逐日檢查萌發(fā)的結果。三、孢子萌發(fā)的記載方法三、孢子萌發(fā)的記載方法孢子萌發(fā)是先吸水膨脹，然后長出芽管，通常以芽管長度超過孢子直徑一半(不是正圓形的孢子以短徑為準)作為萌發(fā)標準，記載萌發(fā)的方法有以下幾種。 ( (一一) )萌發(fā)率萌發(fā)率 即萌發(fā)一定時間后，隨機取一定數(shù)目(至少 500 個)的孢子，檢查萌發(fā)的孢子數(shù)，求出萌發(fā)百分率，如果用該法記錄兩種或幾種不同處理時，要注意嚴格掌握檢查時間。 ( (二二) )萌發(fā)時間萌發(fā)時間

54、即測定孢子萌發(fā)達到一定萌發(fā)率所需時間。 ( (三三) )芽管平均長度芽管平均長度 即測定一定數(shù)目已萌發(fā)孢子的芽管長度，求其平均值。 此外，有些萌發(fā)試驗，如藥效測定等，還需注意記錄芽管的寬度形狀變化以及是否有分枝等。 四、思考題四、思考題 1 孢子萌發(fā)在植病研究工作中有什么重要意義? 在作萌發(fā)試驗時，特別要注意哪些問題? 2 幾種孢子萌發(fā)方法各自適用于哪些真菌? 記載孢子萌發(fā)的方法有幾種? 各種什么優(yōu)缺點。25 植物病原物的接種植物病原物的接種 一、實驗目的一、實驗目的 人工使病原物與寄主植物感病部位接觸，創(chuàng)造條件使病原物侵入并誘致寄主發(fā)病叫接種，接種是證病過程的重要步驟，在研究寄生現(xiàn)象發(fā)病規(guī)律

55、，測定品種抗病性，藥劑防病效果時都需要接種。因此，接種是植病工作者必須掌握的基本技術環(huán)節(jié)。 植物病害人工接種方法，是根據(jù)病害的傳染方式和侵染途徑設計的，植物病害的種類很多、其傳染方式和侵染途徑各異。因此接種方法也不相同。本次實驗以玉米大斑病，小麥根腐病，小麥稈銹病，梨褐腐病等為內容學習常用的接種方法。二、內容、材料和方法二、內容、材料和方法 ( (一一) )拌土法拌土法( (小麥根腐病小麥根腐病) ) 拌土法適于土壤傳染的病害，方法是將消毒的土壤分別裝入兩個小花盆中，其中一盆表層覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培養(yǎng)菌 1 份加消毒土 5 份混合而成，另一盆不接種(不覆菌土)作為對照。將經 0

56、.1%升汞表面消毒 3 分鐘并用無菌水洗 3 次的小麥種子，分別播種在兩個花盆內，插上標牌，注明接種日期，方法病害名稱及接種人姓名，花盆放在室溫下，澆水保濕，遮陰管理，待幼苗出土展開葉子后(大約一周)，觀察并記載根腐病發(fā)生情況。 ( (二二) )噴霧法噴霧法( (玉米大斑病玉米大斑病) )氣流及雨水傳播的病害常用此法接種，將培養(yǎng)好的玉米大斑病的斜面菌種一支，用移植鉤刮于裝有 100 毫升無菌水的三角瓶中，用力振蕩，待孢子洗下后，以紗布過濾，并于濾液中加入 0.1 克中性肥皂，即成孢子菌絲懸液，用衛(wèi)生噴霧器均勻噴布在麥苗上。同時設一不噴菌液而噴無菌水的作對照，用塑料罩保濕 48 小時，揭布后正常

57、管理，7 天后作發(fā)病調查。( (三三) )涂抹法涂抹法( (小麥稈銹病小麥稈銹病) ) 這也是氣流傳播的病害常用的接種方法，用于禾本科銹病接種。方法是用姆指沾銹菌夏孢子懸液自下向上輕輕涂欲接種的小麥葉片，也可先用手指沾水摩擦葉片，使葉表有一層水膜，然后將夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子懸液或孢子粉的作為對照。塑料罩保濕48 小時后揭布，正常管理，7 天后作發(fā)病調查。( (四四) )創(chuàng)傷接種法創(chuàng)傷接種法( (白菜軟腐病及梨褐腐病白菜軟腐病及梨褐腐病) ) 創(chuàng)傷接種法是傷口侵入的弱寄生菌常用的接種方法。 1.白菜軟腐病：取切成適當大小的白菜幫兩塊、經水洗，待水稍干后，以 10%漂白粉溶液作表面消毒，

58、分放在兩個滅過菌的上下鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用酒精擦過的玻璃棒順著白菜幫打三排不穿透的孔穴。將培養(yǎng)好的白菜軟腐病菌斜面菌種的菌苔以無菌水洗下作成菌懸液。然后，先以滅過菌的獸用注射器吸取無菌水滴于菜幫的第一排內孔作為對照，再用該注射器吸菌液滴于第二、三排孔內。注意無論無菌水、還是菌液都不要滴的過多。以免流出孔穴，另一培養(yǎng)皿的菜幫以同法處理作為重復。蓋好皿蓋，置于 2628的溫箱中，24 小時后檢查發(fā)病情況。 2.梨褐腐?。喝“桌嬉跃凭鹧姹砻嫦竞?，用熾熱的解剖刀，在其上切成小手指粗的孔穴 35 個。取經分離純化的梨褐腐病菌菌落填抹在已切好的孔穴中，再復以飽含無菌水的脫脂棉或紗布，放在密封的干燥

59、器或標本瓶中，干燥器或標本瓶底部裝些水，再將干燥器或標本瓶放于 25的溫箱中，以未接菌的作為對照，3 天后作發(fā)病調查。三、接種試驗的觀察和記載三、接種試驗的觀察和記載 認真觀察和記錄是做好接種試驗的重要環(huán)節(jié)，為了及時正確地分析總結試驗結果，必須認真觀察并做詳盡的記錄，如記錄接種時間，接種植物、品種、接種方法、部位、接種用的病菌名稱(包括菌系和生理小種)、來源、繁殖和培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間)、接種體濃度、接種的方法和步驟及接種后的管理等。 四、思考題四、思考題 植物接種常用的方法有哪些? 舉例說明如何根據(jù)病害特點選擇接種方法?26 植物病原生物繪圖技術植物病原生物繪圖技術一、實訓目

60、標一、實訓目標 提高生物繪圖技術水平，為今后開展病理學有關工作奠定較好的基礎。二、繪圖內容、材料和方法二、繪圖內容、材料和方法(一)病原菌形態(tài)圖的繪制以點線法繪制黑白圖的步驟和方法1.初稿的描繪用普通白紙、鉛筆(1H)起稿，先確定圖幅大小，一般要比制版尺寸大一些，但不能超過一倍，制版時再縮小，有提高原圖質量的效果，當然如能精良繪制，亦可原圖制版，如在一張圖上繪出幾個內容，如分生孢子梗和分生孢子子囊殼，子囊和子囊孢子，則應按圖幅大小求出初稿上各部比例尺寸，其比例大小需按顯微測微尺度量算出。有的目測描繪，有的用顯微繪圖儀描繪(見附錄阿培式繪圖儀的用法)輪廓、形成初稿。2.原稿的形成將硫酸紙蒙于初稿