酵母靜止的細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白體是一個(gè)可立即使用的肌動(dòng)蛋白儲(chǔ)備

1、酵母靜止的細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白體:一個(gè)可立即使用的肌動(dòng)蛋白儲(chǔ)備?大多數(shù)真核細(xì)胞在其生命的大多數(shù)時(shí)間處于一個(gè)靜止的狀態(tài),準(zhǔn)備特定的增殖信號(hào)。在釀酒酵母中,進(jìn)入和退出靜止?fàn)顟B(tài)僅僅取決于環(huán)境中的可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。從靜止到增殖的轉(zhuǎn)變不僅需要?jiǎng)×业拇x變化，還需要一個(gè)完整的多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重建。在這里,我們描述了一個(gè)酵母靜止?fàn)顟B(tài)特異的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織。當(dāng)細(xì)胞停止分裂,肌動(dòng)蛋白重組為一個(gè)我們稱(chēng)為“肌動(dòng)蛋白體”的結(jié)構(gòu)。我們的研究表明肌動(dòng)蛋白體包括F-肌動(dòng)蛋白和一些肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，如絲束蛋白和成帽蛋白質(zhì)。此外,通過(guò)與肌動(dòng)蛋白斑或肌動(dòng)蛋白線的對(duì)比,我們發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白體大多是固定的,并且我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何肌動(dòng)蛋白絲的

2、轉(zhuǎn)換。最后,我們的研究表明,在細(xì)胞的再培養(yǎng)中肌動(dòng)蛋白體迅速消失, 而且在蛋白質(zhì)從頭合成缺乏的情況下肌動(dòng)蛋白線和斑可以被裝配成肌動(dòng)蛋白體。這使我們提出,肌動(dòng)蛋白體是一個(gè)肌動(dòng)蛋白的儲(chǔ)備,它可以在再次進(jìn)入一個(gè)增殖周期時(shí)為肌動(dòng)蛋白線和斑的形成而迅速動(dòng)員。介紹細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的控制是生命的一個(gè)關(guān)鍵特性。大多數(shù)原核和真核細(xì)胞其最大部分的壽命是處于一個(gè)稱(chēng)為靜止的非增殖狀態(tài)。令人驚訝的是,一個(gè)關(guān)于多種細(xì)胞過(guò)程控制細(xì)胞增殖周期的巨大的信息體是可以利用的, 而生物學(xué)上的靜止周期卻鮮為人知。靜止周期是細(xì)胞退出增殖周期的一個(gè)過(guò)程；進(jìn)入并且維持一個(gè)穩(wěn)定的,非增殖狀態(tài);最后,在特殊的環(huán)境條件下,又返回到細(xì)胞分裂周期。破解從

3、增殖到靜止的轉(zhuǎn)換機(jī)制是一個(gè)巨大而緊急的研究領(lǐng)域。在多細(xì)胞生物體,細(xì)胞增殖主要依賴(lài)于生長(zhǎng)因子和激素,也可能依賴(lài)于涉及整個(gè)生物環(huán)境的參數(shù)。因此研究這些生物中的靜止周期是非常具有挑戰(zhàn)性的。相比之下,單細(xì)胞微生物如釀酒酵母的增殖“完全”取決于環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性,因此更適合研究涉及進(jìn)入和退出靜止周期的過(guò)程。在營(yíng)養(yǎng)枯竭時(shí),增殖的酵母細(xì)胞完成細(xì)胞周期,停止成長(zhǎng),并且進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)作為不萌發(fā)的細(xì)胞。靜止?fàn)顟B(tài)的正確建立顯然涉及由一組復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào),如TOR和RAS途徑控制的活躍的過(guò)程。此外,酵母細(xì)胞進(jìn)入靜止將徹底地修改他們的新陳代謝。他們積累碳水化合物、聚磷酸鹽,并且大大降低蛋白質(zhì)的合成率。最近,DNA微陣列

4、分析表明,盡管在進(jìn)入靜止后大多數(shù)基因下調(diào),然而一些特定基因的轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo),此外,一些特殊的轉(zhuǎn)錄物在靜止細(xì)胞中富集。因而,這些研究揭示了發(fā)生在進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)特定的表達(dá)譜的“重新編程”。在細(xì)胞水平上,酵母細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)后產(chǎn)生出一個(gè)厚厚的細(xì)胞壁,它賦予了細(xì)胞一個(gè)對(duì)溫度、滲透壓或化學(xué)壓力更高的耐受性。此外,靜止的酵母細(xì)胞顯示為凝聚的染色體和點(diǎn)狀的線粒體網(wǎng)絡(luò);然而, 在進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)其其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)潛在的重塑則很少為人所知。在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是最動(dòng)態(tài)細(xì)胞裝置之一,而且對(duì)于各種不同的細(xì)胞過(guò)程如細(xì)胞形態(tài)、遷移、極化、收縮、分裂或細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷际侵陵P(guān)重要的。對(duì)于協(xié)調(diào)微絲(肌動(dòng)蛋白)快速組裝和去組裝及調(diào)節(jié)參與各種

5、結(jié)構(gòu)如應(yīng)力纖維或收縮環(huán)的形成等巨大數(shù)量的信號(hào)通路, 肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)是高度響應(yīng)的?；钴S的增殖酵母細(xì)胞顯示三個(gè)包含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu):肌動(dòng)蛋白絲,作為運(yùn)輸小泡,細(xì)胞器和信使rna的極向運(yùn)輸?shù)牡缆? 內(nèi)吞作用所需的肌動(dòng)蛋白斑;肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白細(xì)胞動(dòng)力環(huán)。一整套的保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ABPs)緊密協(xié)調(diào)這些高度動(dòng)態(tài)的包含f-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)的形成和維持。盡管許多研究描述了復(fù)雜的分子間相互作用的網(wǎng)絡(luò),這些相互作用在分裂活躍的酵母細(xì)胞中調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,但是很少有人了解它在靜止細(xì)胞中的組織作用。在這里,我們仔細(xì)地描繪了出芽酵母在進(jìn)入和退出靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重建。我們描述了一個(gè)靜止細(xì)胞特異的肌

6、動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織,我們將其命名為“肌動(dòng)蛋白體”。我們進(jìn)一步解釋了這一新結(jié)構(gòu)的構(gòu)成、定位和動(dòng)態(tài)性。最后,我們證明了當(dāng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)使細(xì)胞退出靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)肌動(dòng)蛋白體的命運(yùn)。根據(jù)我們的數(shù)據(jù),我們提出肌動(dòng)蛋白體作為肌動(dòng)蛋白儲(chǔ)備,可以立即用于細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)增殖周期。材料和方法菌株,培養(yǎng)基,和質(zhì)粒菌株。除了特定的外, 在這項(xiàng)研究中所采用的所有的釀酒酵母菌株都是對(duì)BY4742或BY4741(以s288c為背景)等基因系的，來(lái)自于Euroscarf(Frankfurt,德國(guó))并且如表1所列。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)融合物的酵母菌株來(lái)自于英杰公司(Carlsbad,CA)。培養(yǎng)基。YPDA培養(yǎng)基如前所述。SD ca

7、sa培養(yǎng)基中補(bǔ)充1.8mM尿嘧啶、0.2 mM色氨酸和0.3 mM腺嘌呤。包含2%乳酸的培養(yǎng)基在Chateaubodeau等(1976)中有描述,而含N3甘油的培養(yǎng)基在Lefebvre-Legendre 等(2001)中有描述，在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充2%的乙醇。為了測(cè)試在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)的可行性,我們使用一個(gè)含有0.1%的葡萄糖和赤蘚紅的SD casa WAV培養(yǎng)基，如Bonneu 等(1991)中所述。為了按時(shí)間順序的老化試驗(yàn)，細(xì)胞在30下在液體YPDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d，然后將其連續(xù)稀釋物種植在重復(fù)的YPDA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的百分比是經(jīng)過(guò)100%的生存的野生型菌株標(biāo)準(zhǔn)化的,并且是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。質(zhì)

8、粒。P2893是在ABP140編碼序列位點(diǎn)的3末端集成了三個(gè)串聯(lián)的GFP拷貝。P2932是在CAP2編碼序列位點(diǎn)3末端集成了三個(gè)串聯(lián)的GFP拷貝。這個(gè)CAP2-3xGFP融合蛋白是有功能的,即,不是與sac6合成致死的。P2934是在SAC6編碼序列位點(diǎn)3末端集成了三個(gè)串聯(lián)的GFP拷貝。SAC6-3xGFP融合蛋白是有功能的(即，不是與abp1合成致病的)。P3006是在ABP1編碼序列位點(diǎn)3末端集成了三個(gè)串聯(lián)的GFP拷貝。ABP1-3xGFP融合蛋白是有功能的(即,不是與sac6合成致病的)。詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和基因序列可按要求提供。顯微鏡落射熒光顯微鏡。應(yīng)用一個(gè)完全自動(dòng)化的蔡司200M倒置顯微鏡來(lái)

9、觀察細(xì)胞,該顯微鏡配有一個(gè)ms-2000載物臺(tái),一個(gè)Lambda LS 175 W氙氣光源,一個(gè)100 *1.4數(shù)值孔徑的高度消色物鏡和五個(gè)位置的過(guò)濾塔。過(guò)濾數(shù)據(jù)集如下:對(duì)于 Alexa-phalloidin 568:Cy3(例:HQ535/50-Em:HQ610/75-BS:Q565lp),對(duì)于活細(xì)胞GFP:具有GFP 長(zhǎng)通性(例:HQ470/40-Em:HQ500lp-BS:Q495lp),而對(duì)于固定細(xì)胞GFP 共區(qū)域化HQ異硫氰酸熒光素窄帶 (例:HQ487/25-Em:HQ535/40-BS:Q505lp)。圖像使用CoolSnap HQ相機(jī)拍攝。顯微鏡、相機(jī)和快門(mén)用SlideBook

10、軟件處理。光漂白(FRAP)后的熒光恢復(fù)都使用了附加到顯微鏡的照明器部分的微點(diǎn)波長(zhǎng)可調(diào)節(jié)激光系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用了一個(gè)由光纖電纜耦合到顯微鏡的氮?dú)饷}沖激光器。非相干光使用香豆素藍(lán)化學(xué)室進(jìn)行同步化和放大,在440 nm波長(zhǎng)下發(fā)出。同時(shí)的光漂白和熒光照明是通過(guò)使用一個(gè)分光鏡(50%白光/ 50%激光)由熒光燈和激光束直接照射到顯微鏡的熒光器實(shí)現(xiàn)的。激光的XY定位是由兩個(gè)計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的以電流計(jì)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)向鏡頭控制的。一個(gè)12像素區(qū)域的熒光強(qiáng)度是在z-stacks最大投射的情況下測(cè)量的。熒光強(qiáng)度In按如下公式計(jì)算: In=(I感興趣的區(qū)域-I背景)/(I對(duì)照區(qū)域-I背景)。熒光比率為I0/In?？蓞⒖糒ue

11、deke 等(2005)。為了綠色熒光蛋白成像，酵母細(xì)胞種植在30°C下的有適當(dāng)補(bǔ)充SD casa培養(yǎng)基中。為了延時(shí)生長(zhǎng)細(xì)胞的顯微,取2-2.5l的培養(yǎng)物于玻片上，并立即在室溫(22)成像。使用Alexa-phalloidin 568(表達(dá)載體)的鬼筆環(huán)肽染色如先前描述。所有的照片(除了指定的以外) 都是通過(guò)0.3M 的Z步驟在Z-stacks的最大投射下獲得的。電子顯微鏡。酵母細(xì)胞在30下于50毫升YPDA培養(yǎng)基中220 rpm搖床培養(yǎng)3d。細(xì)胞球被放置在電子顯微鏡銅網(wǎng)格(400網(wǎng)) 的表面，其上已涂有聚醋酸甲基乙烯脂。每個(gè)循環(huán)非常迅速地浸沒(méi)在預(yù)冷的液體丙烷中，并且儲(chǔ)存于-180液

12、氮中。然后循環(huán)被轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的0.1%戊二醛干燥的丙酮溶液中，在-82保存3 d。樣品在-20用丙酮漂洗并逐步嵌入在LR Gold樹(shù)脂中。樹(shù)脂聚合物在-20經(jīng)紫外光照射7 d。超薄LR Gold部分聚有涂鎳的網(wǎng)格線。該部分首先在1mg/ml甘氨酸中溫育5分鐘，然后在胎牛血清(1:20)中溫育5分鐘。網(wǎng)格在室溫下用稀釋1/200的鼠抗肌動(dòng)蛋白單克隆抗體溫育45分鐘,然后用Tris-緩沖液生理鹽水漂洗:0.1%牛血清白蛋白，并且在室溫下用連接于10nm金顆粒的抗小鼠免疫球蛋白IgG溫育45分鐘。這個(gè)部分是用蒸餾水漂洗,與2%醋酸雙氧鈾水溶液漂洗5分鐘形成對(duì)比,緊接著用1%檸檬酸鉛漂洗1分鐘。標(biāo)本用飛

13、利浦Tecnai 12 Biotwin(120千伏)電子顯微鏡觀察。免疫印跡總蛋白提取物使用三氯乙酸及Reid和Schatz(1982)中描述的玻璃珠方法預(yù)處理。抗體是B·Goode送的。雞的抗酵母肌動(dòng)蛋白抗體使用1/5000的;雞的抗酵母Abp1p抗體使用1/5000的;雞的抗酵母Cap1/2p抗體使用1/2500的;雞的抗酵母絲束蛋白(Sac6p)抗體使用1/5000的;鼠的抗Scp1p抗體使用1/1000的。連接有HRP的抗雞和抗鼠的二級(jí)抗體使用1/10000的。雜項(xiàng)葡萄糖濃度是使用葡萄糖/果糖紫外線測(cè)試組件測(cè)定的。Latrunculin-A是B·Goode送的,且使

14、用濃度為200 m。放線菌酮使用的最終濃度是100 g/ml。結(jié)果靜止的酵母細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在身體內(nèi)是有秩序的在這項(xiàng)研究中,我們選擇遵循現(xiàn)行的Gray等(2004)提出的靜止細(xì)胞的定義。并且以前用于轉(zhuǎn)錄組研究,也就是說(shuō),靜止細(xì)胞是在30固定培養(yǎng)于富含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中獲得的。我們?cè)谂囵B(yǎng)于富含葡萄糖的培養(yǎng)基的野生型酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段，模擬了酵母肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組。如前面廣泛描述的一樣,活躍增殖的酵母細(xì)胞顯示的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架由三個(gè)含有F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)組成:肌動(dòng)蛋白絲、肌動(dòng)蛋圖1. 在進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組。(A)野生型酵母細(xì)胞生長(zhǎng)在30下YPDA中。細(xì)胞密度使用OD

15、600nm進(jìn)行測(cè)量 (灰色線)。在不同的生長(zhǎng)階段,取樣, 測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖濃度 (灰色三角形),細(xì)胞用Alexa-phalloidin染色。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn),具有極化肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的細(xì)胞 (黑色虛線),具有去極化的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的細(xì)胞(空心方框),或具有肌動(dòng)蛋白體的細(xì)胞(黑色曲線)都被計(jì)數(shù)(對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n200)。萌芽指數(shù)(出芽細(xì)胞的比例)用黑色的圓圈顯示(對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n200)。(B)左側(cè)的圖片,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(在A中時(shí)間點(diǎn)為3 h時(shí))極化細(xì)胞的例子。中間的圖片, 在兩個(gè)階段相互轉(zhuǎn)變時(shí)(在A中時(shí)間點(diǎn)為6.5 h時(shí))去極化細(xì)胞的例子。右側(cè)的圖片, 具有肌動(dòng)蛋白體處于靜止?fàn)顟B(tài)(在A中時(shí)間點(diǎn)

16、為72 h時(shí))的細(xì)胞的例子。圖像是二維的(2 d)三維(3d)圖像疊加物的最大投影。比例尺,2m。(C)細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)Abp1p,Act1p和Cap1/2p穩(wěn)態(tài)水平的免疫印跡分析。時(shí)間點(diǎn)和與A中時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD值。白斑和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞動(dòng)力環(huán)。肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑的活動(dòng)增長(zhǎng)位點(diǎn)是被極化的 (處于胞質(zhì)分裂的芽頂和芽頸;圖1B，左)。在兩階段生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變中,對(duì)應(yīng)于葡萄糖匱乏,肌動(dòng)蛋白絲變得紊亂和肌動(dòng)蛋白斑在細(xì)胞內(nèi)去極化。然后, 肌動(dòng)蛋白絲消失了,結(jié)構(gòu)重建的肌動(dòng)蛋白斑仍然是去極化的(圖1 B，中)。最后,肌動(dòng)蛋白斑消失了,然而一個(gè)我們稱(chēng)為肌動(dòng)蛋白體的新的肌動(dòng)蛋白組織出現(xiàn)了(圖1B,右)。幾小時(shí)內(nèi),我

17、們?cè)诖蠖鄶?shù)的細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白體(圖1A,黑色的曲線)。因?yàn)樗麄兛梢员还砉P環(huán)肽染色,所以肌動(dòng)蛋白體包含真實(shí)的F-肌動(dòng)蛋白。肌動(dòng)蛋白體沒(méi)有一個(gè)特定的形狀,他們可以是球形的或拉長(zhǎng)的。當(dāng)處于細(xì)長(zhǎng)狀態(tài)時(shí),肌動(dòng)蛋白體顯示為多變的厚度和曲率。此外,每個(gè)細(xì)胞可以擁有一個(gè)或多個(gè)肌動(dòng)蛋白體。典型的例子如圖1B(右)所示。在整個(gè)穩(wěn)定時(shí)期肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架仍然組織于肌動(dòng)蛋白體內(nèi),而且我們能夠在只生長(zhǎng)2個(gè)月的細(xì)胞中觀察到肌動(dòng)蛋白體 (未發(fā)表過(guò)的數(shù)據(jù))?；谶@些觀察,很明顯在靜止細(xì)胞中仍然存在巨大數(shù)量的F-肌動(dòng)蛋白。穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下總細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的水平始終不影響細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)(圖1C)。值得注意的是, 在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組

18、的不同階段Abp1p ABPs和Cap1/2的數(shù)量并沒(méi)有顯著改變(圖1C)。如圖1A所示,肌動(dòng)蛋白體產(chǎn)生于兩個(gè)生長(zhǎng)階段相互轉(zhuǎn)變后,當(dāng)葡萄糖用盡時(shí)。因此我們提出這個(gè)特殊的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織是否存在于細(xì)胞生長(zhǎng)碳源缺乏時(shí)。如表2所示, 在含有乳酸或丙三醇/乙醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了7d的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有肌動(dòng)蛋白體。最后, 在單倍體和二倍體細(xì)胞中都觀察到了肌動(dòng)蛋白體,并且是在多種壓力背景下觀察的(表3)。因此,肌動(dòng)蛋白體定義為一個(gè)新的特異地發(fā)現(xiàn)于不增殖的酵母細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織。肌動(dòng)蛋白體不能定位到一個(gè)特定的細(xì)胞區(qū)域然后,我們解釋了肌動(dòng)蛋白體可能位于一個(gè)特定的亞細(xì)胞區(qū)的可能性。因此我們分別使用Ilv3

19、p-GFP、4,6-雙脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和Pho88p-GFP比較了肌動(dòng)蛋白體與線粒體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的位置關(guān)系。如圖2 A所示,肌動(dòng)蛋白體與線粒體和細(xì)胞核并不共區(qū)域，并且與任何特定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)地區(qū)都是不相關(guān)的?；趯?duì)生長(zhǎng)于營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中3 d的細(xì)胞的抗肌動(dòng)蛋白抗體免疫膠體金染色的電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些結(jié)果。如圖2B所示,抗肌動(dòng)蛋白抗體聚集于電子輕度致密的結(jié)構(gòu)。重要的是, 在指數(shù)增長(zhǎng)的細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些肌動(dòng)蛋白抗體聚集物 (我們未發(fā)表過(guò)的數(shù)據(jù))?；谒鼈兇笮　⑿螤詈臀恢玫南嗨贫?我們可以合理地得出這樣的結(jié)論: 聚集的抗肌動(dòng)蛋白抗體的結(jié)構(gòu)是通過(guò)Alexa-鬼筆環(huán)肽染色由熒光顯微鏡觀

20、察到的肌動(dòng)蛋白體。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí),即使在超微結(jié)構(gòu)水平，肌動(dòng)蛋白體也不會(huì)定位于細(xì)胞質(zhì)的特定區(qū)域。此外,我們可以觀察到肌動(dòng)蛋白體和細(xì)胞膜沒(méi)有緊密的聯(lián)系。圖2. 肌動(dòng)蛋白體的定位。(A)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白體的定位。野生型酵母細(xì)胞表達(dá)的分別用Ilv3p-GFP(左)或Pho88p-GFP(右)標(biāo)記的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),該細(xì)胞在30下的SD casa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d,然后固定,再分別用DAPI和Alexa-phalloidin染色。在合并后的底部圖片,綠色是GFP -,藍(lán)色是DAPI -,紅色是Alexa-phalloidin染色的F-肌動(dòng)蛋白。圖像是二維的(2 d)三維(3d)圖像疊加物的最大投影。比例尺,2

21、m。(B) 在生長(zhǎng)在30下YPDA培養(yǎng)基中3 d的野生型酵母細(xì)胞中的連接于10nm金顆粒的抗肌動(dòng)蛋白抗體的免疫膠體金定位。箭頭指向金顆粒聚集物。在圖像的右上角, 一個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有三個(gè)金顆粒聚集物，已被圈出。比例尺,500nm(頂部);200nm(底部)。一些肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白與肌動(dòng)蛋白體共區(qū)域在活躍增殖的細(xì)胞中,大量肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ABPs) 與包含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)共區(qū)域。因此我們懷疑在靜止細(xì)胞中一些ABPs是否定位于肌動(dòng)蛋白體。29個(gè)融合有GFP的ABPs被檢測(cè)了其在靜止細(xì)胞中的位置(補(bǔ)充表1)。在它們中間，有6個(gè)顯示與肌動(dòng)蛋白體(Arc15p,Arc18p,Arc35p,Arp2p,Crn

22、1p,Srv2p)共處一個(gè)特殊的區(qū)域,5個(gè)與肌動(dòng)蛋白體(Abp1p,Abp140p,Cap1p,Cap2p,Sac6p)完全地共處一個(gè)區(qū)域。Abp1p和Cap1p / Cap2p是只發(fā)現(xiàn)于肌動(dòng)蛋白斑的ABPs, Abp140p是優(yōu)先發(fā)現(xiàn)于肌動(dòng)蛋白絲的一種蛋白質(zhì),而Sac6p在肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑中都檢測(cè)到了。為了證實(shí)這些結(jié)果以及增加靜止細(xì)胞中所需的GFP信號(hào) ,我們構(gòu)建了3倍的GFP融合蛋白并且顯示為有功能的(見(jiàn)材料與方法)。如圖3A所示，們個(gè), Abp1p-3xGFP, Abp140p-3xGFP,Cap1p-GFP和Cap2p-3xGFP與肌動(dòng)蛋白體共區(qū)域。Sac6p結(jié)果與之類(lèi)似 (圖3

23、 E)。因此, 在不增殖細(xì)胞中，我們?cè)诩?dòng)蛋白絲和/或肌動(dòng)蛋白斑中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)與肌動(dòng)蛋白體共區(qū)域。肌動(dòng)蛋白體作為緊密的包含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu),因此可能是由肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白維持的。Scp1p和Sac6p是兩種酵母肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,它們一起調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性和組織過(guò)程。因此我們問(wèn)這兩種蛋白是否也參與組織了靜止細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。活躍增殖的scp1細(xì)胞顯示一個(gè)野生型肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織，并且92±2%的scp1靜止細(xì)胞在培養(yǎng)3 d后顯示肌動(dòng)蛋白體(圖3B)。相比之下,sac6細(xì)胞在指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期都存在一個(gè)強(qiáng)烈改變的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織 (圖3B)。重要的是,s

24、ac6細(xì)胞在衰退期和穩(wěn)定期顯示為生存能力降低(圖3 C)。要注意的是, SCP1的刪除沒(méi)有顯著加劇sac6的表型(見(jiàn)補(bǔ)充圖1)。因此,很容易推測(cè)絲束蛋白/ Sac6p結(jié)合肌動(dòng)蛋白的活躍性是維持穩(wěn)定期肌動(dòng)蛋白體所必須的,而鈣調(diào)蛋白同系物Scp1p的活躍性則圖3.(A) 肌動(dòng)蛋白體與不同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的共區(qū)域化。野生型酵母細(xì)胞表達(dá)的不同的融合有三個(gè)串聯(lián)的GFP拷貝的ABPs在自然水平下在30下的SD casa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2 d。細(xì)胞用Alexa-phalloidin固定染色。在合并后的底部圖片中,GFP顯示為綠色,紅色顯示的是染有Alexa-phalloidin的F -肌動(dòng)蛋白。圖像是二維的(2

25、 d)三維(3d)圖像疊加物的最大投影。 (B)在兩個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白突變體:sac6和scp1中肌動(dòng)蛋白體的形成。野生型(左),scp1(中)和sac6(右)細(xì)胞在YPDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3d，然后用Alexa-phalloidin固定染色。比例尺,2m。 (C)肌動(dòng)蛋白結(jié)合的突變體生存于衰退期和穩(wěn)定期。連續(xù)的稀釋物生長(zhǎng)于常規(guī)的SD casa WAU培養(yǎng)基或含有casa WUA,0.1%葡萄糖和赤蘚紅的合成培養(yǎng)基，赤蘚紅是一種將死細(xì)胞染成粉紅色的染料。顯示了菌株在30下的YPDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d后的可育性。對(duì)可育性的檢測(cè)如材料和方法中描述的一樣。(D) Sac6p和Scp1p在不同生長(zhǎng)階段的穩(wěn)

26、態(tài)水平。樣本取于在30下的YPDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d（3d）或7d(7 d)后的指數(shù)階段的野生型細(xì)胞。(E)Scp1p 和Sac6p在穩(wěn)定期的定位。表達(dá)Sac6p-GFP或Scp1p-GFP的酵母細(xì)胞被培養(yǎng)在30下的SD casa培養(yǎng)基中。左邊的圖顯示生活在指數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞中的GFP熒光。在其后的圖片中顯示, 在30下生長(zhǎng)3d的細(xì)胞用Alexa-phalloidin固定染色。在合并的圖片中,GFP顯示為綠色, Alexa-phalloidin染色的F-肌動(dòng)蛋白顯示為紅色。圖像是二維的(2 d)三維(3d)圖像疊加物的最大投影。比例尺,2m。不是必須的。與此一致的是,Sac6p在穩(wěn)定期的穩(wěn)態(tài)水平保

27、持穩(wěn)定,而Scp1p在衰退期的穩(wěn)態(tài)水平強(qiáng)烈降低(圖3D)。最后,而在指數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞中Scp1-GFP和Sac6p-GFP都能被檢測(cè)到,在不增殖的細(xì)胞,Sac6p-GFP與肌動(dòng)蛋白體共區(qū)域，但檢測(cè)不到Scp1-GFP信號(hào),這與根據(jù)這種蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平所預(yù)期的一樣(圖3E)。肌動(dòng)蛋白體是穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)在酵母中，在增殖細(xì)胞中觀察到的包含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)是高度動(dòng)態(tài)的。在這些結(jié)構(gòu)內(nèi)部,蛋白質(zhì)交換非常動(dòng)態(tài),并且在形成肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑的單纖維中肌動(dòng)蛋白的轉(zhuǎn)換是非常快速的。事實(shí)上,肌動(dòng)蛋白斑是非常短暫的結(jié)構(gòu),其半衰期估計(jì)是20-40秒。與此一致的是,在活細(xì)胞中, 在latruculin A(lat-A)

28、處理下肌動(dòng)蛋白單纖維迅速消失, lat-A是一種可以防止G-肌動(dòng)蛋白聚合的藥物。因此,我們使用lat-A來(lái)估計(jì)肌動(dòng)蛋白單纖維在體內(nèi)的轉(zhuǎn)換。正如所料,在活躍增殖的細(xì)胞中,一個(gè)200Mlat-A的處理引起所有含有F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)(肌圖4.包含穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白單纖維的肌動(dòng)蛋白體。(A)肌動(dòng)蛋白體對(duì)latrunculinA(A)存在抗性。野生型細(xì)胞生長(zhǎng)在30下的YPDA培養(yǎng)基中。在指數(shù)增長(zhǎng)(上部)或者培養(yǎng)3d(底部)期間,細(xì)胞在200M lat-A或二甲亞砜中溫育5分鐘或2 h作為對(duì)照。然后細(xì)胞用Alexa-phalloidin固定染色。(B)在具有單個(gè)肌動(dòng)蛋白體的細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白體的Abp1p-3xGF

29、P信號(hào)激光燒蝕后的熒光恢復(fù)。表達(dá)Abp1p-3xGFP的野生型細(xì)胞在30下的SD casa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d。左邊的圖像是三維圖像延時(shí)系列最大的二維投影。時(shí)間顯示在左上角。白色的小圓圈標(biāo)出了漂白區(qū)域。右邊的圖表顯示了從10個(gè)不同的細(xì)胞獲得的熒光動(dòng)力學(xué)過(guò)程。同樣的曲線是從32個(gè)細(xì)胞中獲得的。(C) 在具有兩個(gè)肌動(dòng)蛋白體的細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白體的Abp1p-3xGFP信號(hào)激光燒蝕后的熒光恢復(fù)。表達(dá)Abp1p-3xGFP的野生型細(xì)胞在30下的SD casa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d。左邊的圖像是三維圖像延時(shí)系列最大的二維投影。時(shí)間顯示在左上角。白色的小圓圈標(biāo)出了漂白區(qū)域；虛線框表示相同細(xì)胞中未漂白的肌動(dòng)蛋白體。右

30、邊的圖顯示了測(cè)量漂白(黑點(diǎn))和未漂白(打開(kāi)的方框)區(qū)域的熒光動(dòng)力學(xué)過(guò)程。同樣的曲線是從12個(gè)不同的細(xì)胞中獲得的。(D) 半個(gè)肌動(dòng)蛋白體的Abp1p-3xGFP信號(hào)激光燒蝕后的熒光恢復(fù)。表達(dá)Abp1p-3xGFP的野生型細(xì)胞在30下的SD casa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d。左邊的圖像是三維圖像延時(shí)系列最大的二維投影。時(shí)間顯示在左上角。白色的小圓圈標(biāo)出了漂白區(qū)域；虛線框表示相同肌動(dòng)蛋白體的未漂白區(qū)域。右邊的圖顯示了測(cè)量漂白(黑點(diǎn))和未漂白(打開(kāi)的方框)區(qū)域的熒光動(dòng)力學(xué)過(guò)程。同樣的曲線是從14個(gè)不同的細(xì)胞中獲得的。比例尺,2m。動(dòng)蛋白絲、肌動(dòng)蛋白斑和胞內(nèi)動(dòng)力環(huán))在5分鐘內(nèi)都消失(圖4A,頂部)。相比之下,

31、對(duì)生長(zhǎng)了3或7 d的細(xì)胞,同樣的處理并不影響肌動(dòng)蛋白體,即使是在存在長(zhǎng)時(shí)間的潛伏藥物處理后(圖4A,頂部，及補(bǔ)充圖2)。因此,對(duì)于lat-A處理肌動(dòng)蛋白體比酵母中其他任何已知的包含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)更具有耐受性。然后,我們想知道定位于肌動(dòng)蛋白體的ABPs池是否是動(dòng)態(tài)的。為了這個(gè)目的,我們使用FRAP研究了Abp1p-3xGFP在肌動(dòng)蛋白體中的轉(zhuǎn)換。因?yàn)锳bp1-3xGFP的恢復(fù)反映了Abp1p-3xGFP在肌動(dòng)蛋白體內(nèi)或與Abp1p-3xGFP胞質(zhì)池的交換,這揭示了肌動(dòng)蛋白體動(dòng)態(tài)性。對(duì)生長(zhǎng)3d的細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白體進(jìn)行光學(xué)漂白,甚至在30分鐘后,都沒(méi)有明顯的Abp1-3xGFP恢復(fù)被檢測(cè)到。這是

32、真實(shí)的,不僅當(dāng)一個(gè)肌動(dòng)蛋白體完全漂白時(shí),在細(xì)胞中顯示一個(gè)或兩個(gè)分開(kāi)的肌動(dòng)蛋白體(分別為0/32和0/12個(gè)細(xì)胞;圖4,B和C),而且當(dāng)一個(gè)肌動(dòng)蛋白體部分漂白時(shí),情況也相同(0/14;圖4D)?？傊?沒(méi)有檢測(cè)到Abp1-3xGFP交換,這強(qiáng)烈說(shuō)明沒(méi)有明顯的Abp1-3xGFP胞質(zhì)池和/或Abp1p-3xGFP在一個(gè)肌動(dòng)蛋白體是不移動(dòng)的。我們使用Sac6p-3xGFP也得到了類(lèi)似結(jié)果(我們的未發(fā)表過(guò)的數(shù)據(jù))。此外, 在圖4B-D中可以觀察到,肌動(dòng)蛋白體在細(xì)胞中一般是不移動(dòng)的。這些數(shù)據(jù)表明,肌動(dòng)蛋白體是穩(wěn)定的和不移動(dòng)的結(jié)構(gòu),在此結(jié)構(gòu)中肌動(dòng)蛋白單纖維和ABPs間的轉(zhuǎn)換是非常緩慢的。細(xì)胞再飼養(yǎng)時(shí)肌動(dòng)蛋白

33、體迅速消失在不增殖的細(xì)胞中,肌動(dòng)蛋白體表現(xiàn)為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。因此我們想知道當(dāng)細(xì)胞退出靜止?fàn)顟B(tài)并再次進(jìn)入增殖細(xì)胞周期時(shí),肌動(dòng)蛋白體是怎樣重組的。為了解決這個(gè)問(wèn)題, 在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了一個(gè)生長(zhǎng)到穩(wěn)定期(7d)的野生型酵母細(xì)胞,然后細(xì)胞被稀釋到新鮮的培養(yǎng)基中,并且通過(guò)肌動(dòng)蛋白鬼筆環(huán)肽染色來(lái)觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組。如圖5A所示, 細(xì)胞再飼養(yǎng)后5分鐘內(nèi),大于50%的肌動(dòng)蛋白體消失了,而去極化的肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑重新出現(xiàn)。細(xì)胞再飼養(yǎng)2 h后,這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)全極化和芽萌發(fā)。為了更精確的觀察肌動(dòng)蛋白體的消失,我們使用野生型酵母細(xì)胞表達(dá)Abp1p-3xGFP,該細(xì)胞生長(zhǎng)2 d,然后在短暫離心后稀釋到新

34、鮮培養(yǎng)基中,并且立即成像。如圖5B和補(bǔ)充圖片S1和S2所示, 再飼養(yǎng)4分鐘后, 產(chǎn)生了高度能動(dòng)的Abp1-3xGFP小點(diǎn)，同時(shí)在大多數(shù)細(xì)胞中,肌動(dòng)蛋白體也隨之消失了。表達(dá)Sac6p-3xGFP的細(xì)胞中也得到了相似的結(jié)果 (圖5 B，底部，及補(bǔ)充圖片S3),并且當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到水中而不是新鮮培養(yǎng)基時(shí)，我們沒(méi)有觀察到肌動(dòng)蛋白體組織中的改變(我們的未發(fā)表過(guò)的數(shù)據(jù))。當(dāng)在再飼養(yǎng)之前細(xì)胞用200M的lat-A處理時(shí),大多數(shù)肌動(dòng)蛋白體在15分鐘內(nèi)消失了。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比,沒(méi)有肌動(dòng)蛋白斑隨之出現(xiàn)(圖5C,補(bǔ)充圖片S4和補(bǔ)充表3)。我們的結(jié)論是,肌動(dòng)蛋白體在沒(méi)有任何肌動(dòng)蛋白單纖維轉(zhuǎn)換的情況下不能直接引起肌動(dòng)

35、蛋白斑產(chǎn)生。圖5. 在退出穩(wěn)定期時(shí)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組。(A)野生型細(xì)胞在30下的YPDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7d。然后，細(xì)胞在新鮮的YPDA培養(yǎng)基中清洗重懸，并且在30下生長(zhǎng)。通過(guò)測(cè)量OD600nm(灰色線)來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn),細(xì)胞用Alexa-phalloidin染色。具有極化的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(深灰色柱)、 去極化的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(淺灰色柱)和肌動(dòng)蛋白體(灰色柱)的細(xì)胞被計(jì)數(shù)(n200;SD5%)。萌芽指數(shù)(出芽細(xì)胞的比例) 用黑點(diǎn)顯示 (n200;SD5%)。(B) 生長(zhǎng)于30下SD casa培養(yǎng)基中2d的野生型酵母細(xì)胞表達(dá)的Abp1p-3xGFP(上部)和Sac6-3xGFP

36、(下部)。經(jīng)短暫離心后,細(xì)胞顆粒在新鮮培養(yǎng)基中重懸并立即成像。圖像是三維圖像延時(shí)系列最大的二維投影。培養(yǎng)基更新后時(shí)間以分鐘計(jì)，顯示在左邊角落。比例尺,2m。(C) 表達(dá)Abp1p-3xGFP的野生型酵母細(xì)胞在30下的SD casa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d。細(xì)胞集中培養(yǎng)并且在最后濃度為200M時(shí)添加Lat-A。這一集中培養(yǎng)在30下溫育30分鐘。在溫育后,20l的細(xì)胞懸液混合于含有200MLat-A(上部)的20l的水中或含有200MLat-A的20l2倍的新鮮SD casa培養(yǎng)基中,并立即成像(底部的兩個(gè)圖片)。圖像是三維圖像延時(shí)系列最大的二維投影。加入包含lat-A的水或新鮮培養(yǎng)基后時(shí)間以分鐘計(jì)，顯

37、示在左邊角落。比例尺,2m。肌動(dòng)蛋白體消失及肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑的形成可以發(fā)生在蛋白質(zhì)合成匱乏時(shí)期為了進(jìn)一步洞察肌動(dòng)蛋白斑和肌動(dòng)蛋白絲在肌動(dòng)蛋白體分解時(shí)的再發(fā)生的機(jī)理,我們觀察了在存在放線菌酮的細(xì)胞再飼養(yǎng)時(shí)的肌動(dòng)蛋白體重組, 放線菌酮是一種防止蛋白質(zhì)合成的藥物。細(xì)胞生長(zhǎng)7 d,然后轉(zhuǎn)移到包含100g/ml放線菌酮的水、YPDA或YDPA。這個(gè)濃度的放線菌酮抑制蛋白質(zhì)合成甚至在生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的細(xì)胞中也有效果。然而,為了進(jìn)一步確定放線菌酮的效果，在包含放線菌酮的YPDA再飼養(yǎng)之前，處理的細(xì)胞用藥物預(yù)培養(yǎng)1h。如圖6A所示,然而肌動(dòng)蛋白體沒(méi)有受到將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到水中的影響,當(dāng)這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含有或不含放

38、線菌酮的YPDA中,肌動(dòng)蛋白體迅速消失，并且去極化的肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑也出現(xiàn)了(例如,見(jiàn)圖6B)。然而,這些結(jié)構(gòu)的極化完全被放線菌酮抑制 (圖6,A和B)。總之,肌動(dòng)蛋白體重組為肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑可以在缺乏蛋白質(zhì)從頭合成途徑的細(xì)胞中發(fā)生。討論在特定信號(hào)下肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組是細(xì)胞生命的重要方面的基礎(chǔ),如極化的胞內(nèi)運(yùn)輸,細(xì)胞遷移或細(xì)胞分裂。在這里,我們已經(jīng)描述了一個(gè)新的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織,肌動(dòng)蛋白體,特別是出現(xiàn)在酵母細(xì)胞進(jìn)入靜止周期時(shí)。在靜止過(guò)程中這些結(jié)構(gòu)一直保持，并且在細(xì)胞再次進(jìn)入增殖周期時(shí)這些結(jié)構(gòu)快速分解。肌動(dòng)蛋白體必須與在一些酵母突變株中描述的肌動(dòng)蛋白帶區(qū)分開(kāi),這些突變株顯示為肌

39、動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織缺陷。肌動(dòng)蛋白帶只能使用抗肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)。相比之下,肌動(dòng)蛋白體可以被熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色,表明這些結(jié)構(gòu)包含真實(shí)的F-肌動(dòng)蛋白單纖維。此外,在此前的一項(xiàng)研究中, 培養(yǎng)了28 d的靜止的酵母細(xì)胞有一個(gè)肌動(dòng)蛋白“塊”的表型, 并且突變體，如prs3,whi2, end3,sla1報(bào)道顯示在穩(wěn)定期早期有肌動(dòng)蛋白“團(tuán)”。盡管如此,這些結(jié)構(gòu)沒(méi)有被進(jìn)一步研究,并且到目前為止,沒(méi)有在進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)的酵母中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組的精確描述(組成、動(dòng)力學(xué)等)被發(fā)表。在此,我們的研究顯示, 當(dāng)野生型細(xì)胞停止增殖時(shí)肌動(dòng)蛋白體大規(guī)模地產(chǎn)生,而與此同時(shí)肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑消失。嵌入肌動(dòng)蛋白體的F-肌

40、動(dòng)蛋白單纖維既可以是“老”的“回收”于肌動(dòng)蛋白絲和/或肌動(dòng)蛋白斑的肌動(dòng)蛋白單纖維，也可以由肌動(dòng)蛋白成核劑從頭合成。這種成核劑可能是一個(gè)特定的和但不確定的肌動(dòng)蛋白體單纖維成核劑?；蛘?它可能是一個(gè)以前描述過(guò)的酵母肌動(dòng)蛋白成核劑,如Arp2/3復(fù)合物或形成素,這些成核肌動(dòng)蛋白單纖維分別組裝成絲或斑。因?yàn)檫@種成核劑的失活防止了酵母增殖,解決了有這些分子機(jī)制參與的肌動(dòng)蛋白體的形成是重要的。與肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白斑相比,肌動(dòng)蛋白體單纖維轉(zhuǎn)換似乎非常緩慢(圖4A)。是什么導(dǎo)致這種運(yùn)動(dòng)的觀察的缺陷?這個(gè)問(wèn)題也就是說(shuō)肌動(dòng)蛋白體是如何維持的?兩個(gè)不相互排斥的可能性可以設(shè)想為:要么單纖維的轉(zhuǎn)換是通過(guò)肌動(dòng)蛋白本身(

41、或其相關(guān)的核苷酸)的修改減少的,要么單纖維是由ABPs嚴(yán)格維持的。這些ABPs或者是肌動(dòng)蛋白體特異的，或者是基本的ABPs, 在穩(wěn)定期它們將被特異的修改以防止F-肌動(dòng)蛋白的轉(zhuǎn)換。我們這里顯示,在靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞中,一些肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白與肌動(dòng)蛋白體共區(qū)域。在這些ABPs間,成帽蛋白已被證明可以阻止肌動(dòng)蛋白單纖維帶刺的末端以及減小單纖維的分解率。同樣,肌動(dòng)蛋白單纖維結(jié)合蛋白Sac6p(絲束蛋白同源物)也與肌動(dòng)蛋白體共區(qū)域。此外,Sac6p似乎是形成和/或維持肌動(dòng)蛋白體所需要的(圖3 B)。因此,至少有兩個(gè)減少肌動(dòng)蛋白單纖維轉(zhuǎn)換的蛋白可能是肌動(dòng)蛋白體形成和/或維持過(guò)程所涉及的。事實(shí)上,肌動(dòng)蛋白單纖維轉(zhuǎn)

42、換在穩(wěn)定期是特異減少的，這可能是肌動(dòng)蛋白體活躍形成的結(jié)果。相比之下,我們也可以設(shè)想, 單纖維轉(zhuǎn)換的減少特異地誘導(dǎo)被動(dòng)進(jìn)入穩(wěn)定期，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白體的形成。的確,之前就有報(bào)道稱(chēng)當(dāng)生長(zhǎng)到穩(wěn)定期早期時(shí)act1-157細(xì)胞(一種具有增加肌動(dòng)蛋白動(dòng)力特性的肌動(dòng)蛋白等位基因)顯示比對(duì)應(yīng)的野生型細(xì)胞中具有更少的肌動(dòng)蛋白塊。在分子水平上,穩(wěn)定期肌動(dòng)蛋白體形成和/或維護(hù)的解釋等待這些過(guò)程特異受損的突變體的發(fā)現(xiàn)。我們的試圖發(fā)現(xiàn)這種突變體的研究揭示,在23個(gè)可用的ABP的缺失突變體中,只有arc18和sac6在穩(wěn)定期表現(xiàn)出明顯的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變 (補(bǔ)充表2)。然而,事實(shí)上,這些突變體已經(jīng)顯示在活躍增殖的細(xì)胞中一個(gè)改變了的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織使在進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)他們對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組的特定影響的解釋相當(dāng)微妙。此外,進(jìn)入穩(wěn)定期是一個(gè)緩慢的過(guò)程,到目前為止,盡管我們的研究取得了很大的進(jìn)展,但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何其他實(shí)驗(yàn)方法用以誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白體的形成。這種高度復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的解碼導(dǎo)致在進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組。因?yàn)樵诩?xì)胞再飼養(yǎng)時(shí)肌動(dòng)蛋白體迅速并且同步地消失 (圖5),所以研究導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白體分解的信號(hào)可能是一