動物細胞血涂片的制備

1、動物細胞血涂片的制備、瑞氏染液及細胞觀察一、 實驗目的a) 學習涂片制備的一般方法b) 學習瑞氏染色的方法c) 學習辨認各種血細胞二、實驗原理a) 血涂片的簡介血涂片的顯微檢查是血液細胞學檢查的基本方法，臨床上應用極廣泛，特別是對于各血液病的診斷具有重要的價值。血涂片制備時手工推片法用血量少、操作簡單，是最廣泛應用的方法。血涂片制備是血液學檢查的重要基本技術之一。一張良好的血片，厚薄要適宜，頭體尾要明顯，細胞分布要均勻，膜的邊緣要整齊，并留有一定的空隙。b) 血涂片的制備及瑞氏染液的配制用推片法將血液制成薄的血涂片，使血細胞成單層排列。瑞氏染料是由堿性染料天青（ Methvlem blue ）

2、和酸性染料伊紅（ Eostm Y ）合稱伊紅天青 染料即瑞氏 （天青伊紅Y）染料 。甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。（注：甲醇具有強大的脫水力，可將細胞固定在一定形態(tài)及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應。）c) 細胞染色的原理細胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用，各種細胞成分化學性質不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩。例如：嗜酸性顆粒為堿性蛋白質，與酸性染料伊紅結果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質；細胞核蛋白為酸性，與堿性染料天青結合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質；中性顆粒呈等電狀

3、態(tài)與伊紅和天青均不易結合，染淡紫色，稱為中性物質。d) 哺乳動物各類血細胞特點i. 紅細胞：圓餅狀無核，中間薄，周圍厚；數(shù)量最多。ii. 淋巴細胞：基本為圓形，比紅細胞稍大；核幾乎占據整個細胞，一側常有小凹陷，染色呈很深的紫色；胞質很少，僅在細胞核外有一薄圈，幾乎無色。iii. 單核細胞：最大、少、胞體為圓形或橢圓形；胞核形態(tài)多樣，有卵圓形、腎形、馬蹄形等，常偏位，著色比淋巴細胞核淺；核質比小于淋巴細胞。iv. 嗜中性粒細胞：基本為圓形，比紅細胞和淋巴細胞大，但比單核細胞?。缓碎L，為臘腸狀或分葉狀（2-5葉），經常很難分辨。v. 嗜酸性粒細胞：胞體為圓形，有一個大而染成淡紫色的核；胞質充滿粗大

4、的嗜酸性顆粒（紅色）；由于核占據了細胞的很大一部分，使顆粒在整個細胞內的分布并不均勻。vi. 嗜堿性粒細胞：細胞呈圓形，胞質內有大量小的嗜堿性顆粒，呈藍紫色，分布于整個細胞，覆蓋核。vii. 血小板：最小，多角形聚集成群。e) 牛蛙各類血細胞特點i. 紅細胞：橢圓形，有核，最大。ii. 淋巴細胞：特征同哺乳動物的淋巴細胞，但是為血細胞中最小的一種。iii. 單核細胞：細胞形態(tài)不規(guī)則；核偏位，占整個細胞的1/2-2/3。iv. 嗜酸性粒細胞：細胞呈圓形或卵圓形，大小差別比較大，有的比紅細胞還大，有的與其他兩種粒細胞大小接近；核很大，位于細胞中央或一側，呈腎形或卵圓形，也有分葉狀、環(huán)狀，染色為淡紫

5、紅色；胞漿充滿紅色圓形顆粒，排列緊密。v. 嗜堿性粒細胞：數(shù)量極少，細胞為圓形；胞質中充滿藍色或深紫色圓形顆粒，顆粒大小不一，常掩蓋核。vi. 嗜中性粒細胞：細胞為圓形或卵圓形；核偏位，形狀不規(guī)則，具有多樣性，有腎形、帶狀、彎月狀或分成兩葉至多葉，胞核染色為紫紅色；胞質著色較淺，其中有淡藍色顆粒狀物質不均勻地分布在胞質內，有時顆粒狀物質不十分明顯。三、 實驗材料及試劑a) 材料新鮮采集的牛蛙血（采集時加入肝素鈉溶液抗凝）。（由老師完成）b) 試劑i. 肝素鈉溶液：用生理鹽水配成180IU/mL。（由老師配制）ii. 瑞氏染液：瑞氏染料粉末0.1g和甲醇60mL。配法：把染料放在研缽內，加入少量

6、甲醇研磨，使染料溶解，然后把溶解的染料倒入干凈的棕色的玻璃瓶當中，并至用完甲醇為止。（由老師配制）iii. pH6.4的PBS：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸二氫鈉（無水）0.2g，加入少量蒸餾水溶解并定容至1000mL。（由老師配制）c) 用品普通光學顯微鏡、酒精棉、蠟筆、載玻片等。四、實驗步驟流程：清潔加樣推片干片選區(qū)染色洗片a)清潔載玻片：載玻片在使用之前用酒精棉清潔晾干。 b)加樣：在干凈的載玻片長軸一端離邊緣約1cm處的中央用膠頭滴管滴1/5滴血。取另一張干凈的載玻片作為推片，讓推片的一端先出于血滴推片方向的前側，并與血滴玻片成3545夾角。c)推片：先將推片向后拉至血滴處，待血液

7、沿著兩塊載玻片接觸線向兩邊擴散后，將推片保持夾角，向血玻片左側均速推進，血液隨推片而行，在血玻片上形成一層血膜，即為血涂片d)干片：推好的血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。e)選區(qū)：在顯微鏡下觀察，尋找涂片中均勻分散良好的血膜，用蠟筆在四周畫線（多畫幾圈），作為提防。f)染色：滴加適量的瑞氏染液覆蓋選定區(qū)域，染1分鐘；在滴加等量的PH6.4的PBS緩沖液稀釋染液，輕搖混勻，液面浮現(xiàn)一層金黃色金屬物質，然后靜置染色15-20min。g)洗去多余染液：用流水或滴加蒸餾水直接洗去浮液。（不要先將染液倒掉）將載玻片自然晾干，用于觀察。h)觀察辨認各種細胞。五、實驗結果a)上圖中的1框內的細胞形狀不規(guī)則

8、，且核偏位，占整個細胞的2/3左右。所以，我認為它是單核細胞。上圖中的2框內的細胞圓餅狀、有核，且與其他細胞相比最大，而且在視野當中的數(shù)量明顯比其他細胞多。所以，我認為它是牛蛙的紅細胞。b）上圖中的1框內的細胞中有大量的深紫色堿性顆粒。所以，老師認為它是嗜堿性粒細胞。（但是，因為細胞中的顆粒狀物質并沒有掩蓋核，所以我開始的時候以為這個細胞是嗜中性粒細胞。由上可知，嗜中性粒細胞與嗜堿性粒細胞之間的分界線并不是非常的明顯。）上圖中的2框內的細胞首先比周圍其他的細胞都小，基本為圓形，核幾乎占據整個細胞，而且細胞質很少，且基本無色。所以，我認為它是淋巴細胞。C）上圖中的1框內細胞為卵圓形，核偏位且分為

9、兩葉，細胞核染色為紫紅色，且細胞質著色比周圍的細胞著色都淺。所以我認為它是嗜中性粒細胞。d)上圖中的1框內的細胞呈卵圓形，細胞的左上部分為染成淡紫紅色的腎形細胞核，右下部分為排列緊密的紅色顆粒狀物質。所以我認為它是嗜酸性粒細胞。上圖中的2框內的細胞，我認為是嗜中性粒細胞（但是我不知道是不是正確）。六、實驗結論及分析實驗中我并沒有真的找到嗜中性粒細胞。是在實驗后查看所拍的圖片的時候覺得上圖細胞有一些像嗜中性粒細胞而已。我覺得，自己的推片還是有一定問題，有些載玻片細胞的細胞分布非常不均勻，根本就不能用。有一些可能是推片太厚了，所以晾干比較慢，所以在最后觀察時很多紅細胞都已經皺縮了。另外，我覺得染色

10、的效果也不是非常理想，紅色和紫色的區(qū)分并不是非常的明顯。七、實驗注意事項a)血量不能多，標本過厚，細胞重疊不便觀察，并且造成細胞皺縮變形。b)染液PH值是6.4-6.8，染色偏酸或偏堿都會使染色反應異常。PH對細胞染色有影響。由于蛋白質系兩性電解質，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下在正電荷增多，易與伊紅結合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與天青結合，染色偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液時必須用優(yōu)質甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應近中性，否則可導致各種細胞染色反應異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。c)沖洗時不能先倒掉染液，以防染料沉著在血涂片上；沖洗時間不能過久，以防脫色。如血涂片上有染料顆粒沉積就，可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗。