寄生蟲學實驗診斷技術(1)

1、第五篇實驗技術第二十一章寄生蟲學實驗技術第一節(jié)寄生蟲學實驗診斷技術一、病原檢查（一）糞便檢查糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準確的結果，糞便必須新鮮，送檢時間一般不宜超過24小時。如檢查腸內(nèi)原蟲滋養(yǎng)體，最好立即檢查。盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結果。1.直接涂片法用以檢查蠕蟲卵、原蟲的包囊和滋養(yǎng)體。方法簡便，連續(xù)作3次涂片，可提高檢出率。蠕蟲卵檢查：滴一滴生理鹽水于潔凈的載玻片，用棉簽棍或牙簽挑取綠豆大小的糞便塊，在生理鹽水中涂抹均勻；涂片的厚度以透過涂片約可辨認書上的字跡為宜。一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應注意蟲卵與糞便中異

2、物的鑒別。蟲卵都具有一定形狀和大?。宦褮け砻婀饣R，具固有色澤；卵內(nèi)含卵細胞或幼蟲。原蟲檢查：1）活滋養(yǎng)體檢查：涂片應較薄，方法同查蠕蟲卵。氣溫愈接近體溫，滋養(yǎng)體的活動愈明顯。必要時可用保溫臺保持溫度。2）包囊的碘液染色檢查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水。如碘液過多，可用吸水紙從蓋片邊緣吸去過多的液體。若同時需檢查活滋養(yǎng)體，可在用生理鹽水涂勻的糞滴附近滴一滴碘液，取少許糞便在碘液中涂勻，再蓋上蓋片（圖211）。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋養(yǎng)體。圖211原蟲包囊碘液染色操作方法碘液配方：碘化鉀4g，碘2g，蒸餾水100ml.3）隱孢子蟲卵囊染色檢查：目前較佳的方法為金胺

3、酚改良抗酸染色法。對于新鮮糞便或經(jīng)10福爾馬林固定保存（41個月內(nèi)）的含卵囊糞便都可用此法染色。染色過程是先用金胺酚染色，再用改良抗酸染色法復染。方法步驟如下：金胺酚染色法：染液配制：1gL金胺酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石碳酸5.0g，蒸餾水100ml；3鹽酸酒精（第二液）：鹽酸3ml，95酒精100ml；5gL高錳酸鉀液（第三液）：高錳酸鉀0.5g，蒸餾水100ml.染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，1015分鐘后水洗；滴加第二液，1分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置熒光顯微鏡檢查。低倍熒光鏡下，可見卵囊為一圓形小亮點，發(fā)現(xiàn)乳白色熒光。高倍鏡下卵囊呈乳白或略帶綠色，卵囊

4、壁為一薄層，多數(shù)卵囊周圍深染，中央淡染，似環(huán)狀，或深染結構偏位，有些卵囊全部為深染。但有些標本可出現(xiàn)非特異的熒光顆粒，應注意鑒別。改良抗酸染色法：染液配制：石炭酸復紅染色液（第一液）：堿性復紅4g， 95酒精20ml，石炭酸8ml，蒸餾水100ml；10硫酸溶液（第二液）：純硫酸10ml，蒸餾水90ml（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中；20gL孔雀綠液（第三液）：20gL孔雀綠原液1ml，蒸餾水10ml.染色步驟：滴加第一液于糞膜上，1.510分鐘后水洗；滴加第二液，110分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置顯微鏡下觀察。經(jīng)染色后，卵囊為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，共4個。其他非特異顆粒則

5、染成藍黑色，容易與卵囊區(qū)分。不具備熒光鏡的實驗室，亦可用上述方法先后染色，然后在光鏡低、高倍下過篩檢查，發(fā)現(xiàn)小紅點再用油鏡觀察。效果好，可提高檢出速度和準確性。2.厚涂片透明法（改良加藤法）取約5mg（已用100目不銹鋼篩除去糞渣）糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開（20×25mm）。置于3036溫箱中約半小時或25約1小時。待糞膜稍干，即可鏡檢。玻璃紙準備：將玻璃紙剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油孔雀綠溶液（含純甘油100ml、水100ml和3孔雀綠1ml的水溶液）中，至少浸泡24小時，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。使用此法需掌握糞膜的合適厚

6、度和透明的時間。如糞膜厚，透明時間短，蟲卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時間過長，則蟲卵變形，也不易辨認。3.濃聚法沉淀法：原蟲包囊和蠕蟲卵的比重大可沉集于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲卵和某些原蟲包囊則效果較差。1）重力沉淀法：取糞便2030g、加水成混懸液，經(jīng)金屬篩（4060孔）或2、3層濕紗布過濾，再加清水沖洗殘渣；過濾糞液在容器中靜置25分鐘，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔1520分鐘換水一次（34次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。如檢查包囊，換水間隔時間宜延長至約6小時換一次（圖212）。圖212糞便沉淀及毛蚴孵化法2）離心沉淀法：將上述濾去粗渣的糞液離心（150

7、02000rpm/min）12分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復沉淀34次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。3）汞碘醛離心（MIFC）沉淀法：糞便1g，加適量（約10ml）汞碘醛液，充分調(diào)勻，用2層脫脂紗布過濾，再加入乙醚4ml，搖2分鐘，離心（2000rpm/min）12分鐘，即分成乙醚、糞渣、汞碘醛及沉淀物4層。吸棄上面3層，取沉渣鏡檢。汞碘醛配制：汞醛（MF）液：11000硫柳汞酊200ml，甲醛（40）25ml，甘油50ml，蒸餾水200ml.盧戈氏液：碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100ml.檢查時取汞醛液2.35ml及5盧戈氏液0.15ml混合備用。但混合液在

8、8小時后即變質(zhì)，不應再用；碘液亦不這且于1周后再用。4）醛醚沉淀法：置糞便12g于小容器內(nèi)，加水1020ml調(diào)勻，將糞便混懸液經(jīng)2層紗布（或100目金屬篩網(wǎng)）過濾，離心（2000rpm/min）2分鐘；倒去上層糞液，保留沉渣，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10甲醛7ml.5分鐘后加乙醚3ml，塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘，即可見管內(nèi)自下而上分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。如檢查原蟲包囊，可加盧戈氏液染色，加蓋片鏡檢。浮聚法：利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有兩種：1）飽和鹽水浮聚法：此法用以檢查鉤蟲卵效果最好。用竹簽取黃豆粒大小的糞

9、便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢（圖213）。圖213飽和鹽水浮聚法飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動，直至食鹽不再溶解為止。2）硫酸鋅離心浮聚法：此法可用于檢查原蟲包囊，球蟲卵囊和蠕蟲卵。取糞便約1g，加1015倍的水，充分攪碎，按離心沉淀法過濾，反復離心34次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33的溶液），調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)取表面的糞液

10、置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。3）蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲的卵囊。取糞便約5g，加水1520ml，以260目尼龍袋或4層紗布過濾。取濾液離心510分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸餾水320ml，石炭酸6.5ml）再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表液膜鏡檢（高倍或油鏡）。卵囊透明無色，囊壁光滑，內(nèi)有一小暗點和發(fā)出淡黃色的子孢子。隱孢子蟲的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，但1小時后卵囊脫水變形不易辨認，故應立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖溶液。常見蠕蟲卵、包囊的比重如表211。表211蠕蟲卵及包囊的比重蟲卵或包囊比重華支睪吸蟲卵1.

11、1701.190姜片吸蟲卵1.190肝片形吸蟲卵1.200日本血吸蟲卵1.200帶絳蟲卵1.140微小膜殼絳蟲卵1.050鉤蟲卵1.0551.080鞭蟲卵1.150蟯蟲卵1.1051.115受精蛔蟲卵1.1101.130未受精蛔蟲卵1.2101.230毛圓線蟲卵1.1151.130溶組織內(nèi)阿米巴包囊1.0601.070結腸內(nèi)阿米巴包囊1.070微小內(nèi)蜒阿米巴包囊1.0651.070藍氏賈第鞭毛蟲包囊1.0401.0604.毛蚴孵化法依據(jù)血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度的清水中，短時間內(nèi)可孵出的特性而設計的方法，適用于星期血吸蟲病患者的糞便檢查。取糞便約30g，先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，將糞便沉渣倒入三

12、角燒瓶內(nèi)，加清水（城市中需用去氯水）至瓶口，在2030的條件下經(jīng)46小時后肉眼或放大鏡觀察結果。如見水面下有白色點狀物作直線來往游動，即是毛蚴。必要時也可用吸管將毛蚴吸出鏡檢。如無毛蚴，每隔46小時（24小時內(nèi)）觀察一次。氣溫高時，毛蚴可在短時間內(nèi)孵出，因此在夏季要用1.2食鹽水或冰水沖洗糞便，最后一次才改用室溫清水（圖212）。毛蚴促孵法：將沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶內(nèi)，不加水，或?qū)⒓S渣置于吸水紙上，再放在2030溫箱中過液。檢查時，加清水，2小時后就可見到孵出的毛蚴。此法毛蚴孵出時間較一致，數(shù)量也較多。5.肛門拭子檢查法適用于在肛周產(chǎn)卵（蟯蟲），或常在肛門附近發(fā)現(xiàn)蟲卵（帶絳蟲）的蟲卵

13、檢查法。棉簽拭子法：先將棉簽浸泡在生理鹽水中，取出時擠去過多的鹽水，在肛門周圍擦拭，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動，迅速提起棉簽，在試管內(nèi)壁擠干鹽水后充去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一載玻片，務使其接觸液面，5分鐘后取載玻片鏡檢。也可將擦拭肛周的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，在試管內(nèi)壁擠去水分后棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后，倒去上液，取沉渣鏡檢。透明膠紙法：用長約6cm，寬約2cm的透明膠紙粘擦肛門周圍的皮膚，取下膠紙，將有膠面平貼玻片上，鏡檢。6.試管濾紙培養(yǎng)法也稱鉤蚴培養(yǎng)法。根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時間內(nèi)孵出幼蟲的原理設計的方法。如冷開水約1ml于潔凈試

14、管內(nèi)（1×10cm），將濾紙剪成與試管等寬但較試管稍長的T字型紙條，用鉛筆書寫受檢者姓名或編號于橫條部分。取糞便約0.20.4g，均勻地涂抹在緊豎條紙條的上部23處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，以糞便不接觸水面為度。在2030條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天沿管壁補充冷開水，以保持水面位置。3天后肉眼或放大鏡檢查試管底部。鉤蚴在水中常作蛇形游動，蟲體透明。如未發(fā)現(xiàn)鉤蚴，應繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5天。氣溫太低時可將培養(yǎng)管放入溫水（30左右）中數(shù)分鐘后，再行檢查（圖214）。圖214鉤蚴培養(yǎng)法此法亦可用于分離人體腸道內(nèi)各種阿米巴滋養(yǎng)體及人毛滴蟲滋養(yǎng)體，且能提高檢出率。但是，每管糞便量應為1.0g

15、；適宜溫度為2530；培養(yǎng)時間為24天。臨床上為了及時報告致病原蟲，可于培養(yǎng)48小時后鏡檢。檢查腸道各種原蟲，仍應結合碘液涂片法以檢出原蟲包囊。7.蟲卵計數(shù)法蟲卵計數(shù)用于估計人體內(nèi)寄生蟲的感染度，常用司徒爾（Stoll）氏法，即司氏稀釋蟲卵計數(shù)法（圖215）。圖215司氏蟲卵計數(shù)法圖216 定量板用特制的三角燒瓶（或普通三角燒瓶），容量為65ml左右，在燒瓶的頸部相當于56和60ml處有兩個刻度。先把0.1mol/l NaOH溶液倒入瓶內(nèi)至56ml處，再慢慢地加入糞便，到液面上升到60ml處，然后放進玻璃珠10余顆，用橡膠塞塞緊瓶口，充分搖動，使其成為十分均勻的混懸液。計數(shù)時充分搖勻，用有刻度

16、的小吸管取0.075或0.15ml糞液置于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下計算全片的蟲卵數(shù)。乘以200（吸0.075ml）或100（吸0.15ml）即得每克為糞便蟲卵數(shù)。由于糞便的性狀明顯地影響估算結果，因此不成形的糞便的蟲卵數(shù)應再乘糞便性狀系數(shù)，即半成形糞便×1.5，軟濕形糞便×2，粥狀糞便×3，水瀉形糞便×4。8.定量透明法適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲卵的檢查及計數(shù)。此法系應用改良聚苯乙烯作定量板（圖216），大小為40×30×1.37mm，模孔為一長圓孔，大小為8×4mm，兩端呈半圓形，所取的糞樣平均為41.7mg.操作時將大小約

17、4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋在糞便標本上，自篩網(wǎng)上用刮片刮取糞便，置定量板于載玻片上，用一手的兩指壓住定量板的兩端，將刮片上的糞便填滿?？?，刮去多余糞便。掀起定量板，載玻片上留下一個長形糞樣，然后在糞條上覆蓋含甘油孔雀綠溶液的大小約為5.02.6cm的玻璃紙條，展平后加壓，使玻璃紙下的糞便鋪成長橢圓形。經(jīng)12小時糞便透明后置鏡下計數(shù)。將所得蟲卵數(shù)×24，再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)（eggs pergram，EPG）。常見蠕蟲的每條雌蟲每天排卵數(shù)如表212.表212各種蠕蟲每條雌蟲每日排卵數(shù)蟲 名產(chǎn)卵數(shù)日條（平均數(shù)）華支睪吸蟲16004000（240

18、0）姜片蟲1500048000（25000）衛(wèi)氏并殖吸蟲1000020000日本血吸蟲10003500豬帶絳蟲3000050000孕節(jié)牛帶絳蟲97000124000孕節(jié)十二指腸鉤蟲1000030000（24000）美洲鉤蟲500010000（9000）蛔蟲234000245000（240000）鞭蟲10007000（2000）9.淘蟲檢查法為考核驅(qū)蟲療效，常需從糞便中淘取蠕蟲進行鑒定與計數(shù)。取患者服藥后2472小時的全部糞便，加水攪拌，用篩（40目）或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲體時，應在玻皿下襯以黑紙。10.帶絳蟲孕節(jié)檢查法絳蟲節(jié)片用清水洗凈，

19、置于兩載玻片之間，輕輕壓平，對光觀察內(nèi)部結構，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲種。也可用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭素墨汁或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計數(shù)。卡紅染液配制：鉀明礬飽和液100ml，卡紅3g，冰醛酸10ml.混合液置于37溫箱內(nèi)過夜，過濾后即可應用。（二）血液檢查血液檢查是診斷瘧疾、絲蟲病的基本方法。涂制血膜用的載玻片用前需經(jīng)洗滌液處理，自來水、蒸餾水沖洗，在95酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。洗滌液配制：常用玻璃器皿的洗滌液為鉻酸洗液，含工業(yè)濃硫酸100ml，重鉻酸鉀80g，水1000ml.先用冷水將重鉻酸鉀溶化，然后徐徐加入濃硫酸，同時用玻璃棒攪拌。1.檢查瘧原蟲取血與涂片：用

20、75酒精棉球消毒耳垂，待干后用左手拇指與食指捏著耳垂下方，并使耳垂下側方皮膚繃緊，右手持取血針、刺破皮膚，擠出血滴。薄、厚血膜可涂制在同一張玻片上（圖217）。圖217薄厚血膜制作步驟1）薄血膜制片：在載玻片13與23交界處蘸血一小滴，以一端緣光滑的載片為推片，將推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端緣擴散后，自右向左推成薄血膜。操作時兩載片間的角度為3045，推動速度適宜。理想的薄血膜，應是一層均勻分布的血細胞，血細胞間無空隙且涂血膜末端呈掃帚狀。2）厚血膜制片：載玻片的另一端（右）13處蘸血一小滴（約10mm3），以推片的一角，將血滴自內(nèi)向外作螺旋形攤開，使之成為直徑約0.81cm，厚薄均

21、勻的厚血膜。厚血膜為多層血細胞的重疊，約等于20倍薄血膜的厚度。固定與染色：血片必須充分晾干，否則染色時容易脫落。固定時用小玻棒蘸甲醇或無水酒精在薄血膜上輕輕抹過。如薄、厚血膜在同一玻片上，須注意切勿將固定液帶到厚血膜上，因厚血膜固定之前必須先進行溶血?？捎玫喂艿嗡诤裱ど希こ驶野咨珪r，將水倒去，晾干。在稀釋各種染液和沖洗血膜時，如用緩沖液則染色效果更佳。緩沖液的配制如下：磷酸氫二鈉液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）無水0.464g或Na2HPO4. 2H2O 11.867g或Na2HPO4 . 7H2O17.872g或Na2HPO4. 2H2O23.877g，蒸餾水1000ml.M15

22、磷酸二氫鉀液：磷酸二氫鉀（Na2HPO4）9.073g，蒸餾水1000ml.使用時將上述原液按下頁表配成不同的pH緩沖液：pHM15KH2PO4（ml）M15Na2HPO4（ml）蒸餾水（ml）6.84.95.1907.06.33.7907.27.32.790染色時臨時配成pH7.0或7.2的緩沖液。常用的染色劑有姬氏染劑（Giemsasstain）、瑞氏染劑（Wrights stain）。1）Giemsa染色法：此法染色效果良好，血膜褪色較慢，保存時間較久，但染色需時較長。染液配制：姬氏染劑粉1g，甲醇50ml，純甘油50ml.將姬氏染粉置于研缽中（最好用瑪瑙研缽），加小量甘油充分研磨，加甘

23、油再磨，直至50ml甘油加完為止，倒入棕色玻瓶中。然后分幾次用少量甲醇沖洗缽中的甘油染粉，倒入玻瓶，直至50ml甲醇用完為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置65溫箱內(nèi)24小時或室溫內(nèi)一周過濾。染色方法：用pH7.07.2的緩沖液，將姬氏液稀釋；比例約為1520份緩沖液加1份姬氏染液。用蠟筆劃出染色范圍，將稀釋的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小時（室溫），再用上述緩沖液沖洗。血片晾干后鏡檢。2）快速姬色染色法：姬氏染液1ml，加緩沖液5ml，如前法染色5分鐘后用緩沖液沖洗，晾干后鏡檢。3）Wright染色法：此法操作簡便，適用于臨床診斷，但甲醇蒸發(fā)甚快，掌握不當時易在血片上發(fā)生染液沉淀，并較易

24、褪色，保存時間不長。多用于臨時性檢驗。染液配制：瑞氏染劑粉0.10.5g，甲醇97ml，甘油3ml.將瑞氏染劑加入甘油中充分研磨，然后加入少量甲醇，研磨后倒入瓶內(nèi)，再分幾次用甲醇沖洗研缽中的甘油溶液，倒入瓶內(nèi)，直至用完為止，搖勻，24小時后過濾待用。一般1、2周后再過濾。染色方法：瑞氏染液含甲醇，薄血膜不需先固定；而厚血膜則需先經(jīng)溶血，待血膜干后才能染色。染色前先將溶過血的厚血膜和薄血膜一起用蠟筆劃好染色范圍，以防滴加染液時四溢。滴染液使覆蓋全部厚、薄血膜上，30秒至1分鐘后用滴管加等量的蒸餾水，輕輕搖動載玻片，使蒸餾水和染液混合均勻，此時出現(xiàn)一層燦銅色浮膜（染色），35分鐘后用水緩慢地從玻片

25、一端沖洗（注意勿先倒去染液或直對血膜沖洗），晾干后鏡檢。2.檢查微絲蚴新鮮血片檢查：晚間9時至次晨2時取血1滴滴于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蛇形游動的幼蟲后，仍須作染色檢查，以確定蟲種。厚血膜檢查：厚血膜的制作、溶血、固定與姬氏液染色同瘧原蟲。但需取血3滴，也可用Delafieid蘇木素染色法染色。該染液的配制方法如下：蘇木素1g溶于純酒精或95酒精10ml中，加飽和硫酸鋁銨（810）100ml，倒入棕色瓶中，瓶口用兩層紗布扎緊，在陽光下氧化24周，過濾，加甘油25ml和甲醇25ml，用時稀釋10倍左右。已溶血、固定的厚血膜在德氏蘇木素液內(nèi)染1015分鐘，在1酸酒精中分色12分鐘，

26、蒸餾水洗滌15分鐘，至血膜呈藍色，再用1伊紅染色0.51分鐘，以水洗滌25分鐘，晾干后鏡檢?；钗⒔z蚴濃集法：在離心管內(nèi)裝蒸餾水半管，加血液1012滴，再加生理鹽水混勻，離心沉淀3分鐘，取沉渣檢查?；蛉§o脈血1ml，置于盛有3.8枸櫞酸鈉0.1ml的試管中，搖勻，加水9ml，俟紅細胞溶化后，離心（3000rpm/min）2分鐘，倒去上液，加水再離心，取沉渣鏡檢。（三）排泄物與分泌物等的檢查1.痰液痰中可能查見肺吸蟲卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、棘球蚴的原頭蚴、糞類圓線蟲幼蟲、蛔蚴、鉤蚴、塵螨等；卡氏肺孢子蟲的包囊也可出現(xiàn)于痰中，但檢出率很低。肺吸蟲卵檢查：可先用直接涂片法檢查，如為陰性，改用濃集法集

27、卵，以提高檢出率。直接涂片法：在潔凈載玻片上先加12滴生理鹽水，挑取痰液少許，最好選帶鐵銹色的痰，涂成痰膜，加蓋片鏡檢。如未發(fā)現(xiàn)肺吸蟲卵，但見有夏科雷登晶體，提示可能是肺吸蟲患者，多次涂片檢查為陰性者，可改用濃集法。濃集法：收集24小時痰液，置于玻璃杯中，加入等量10NaOH溶液，用玻棒攪勻后，放入37溫箱內(nèi)，數(shù)后痰液消化成稀液狀。分裝于數(shù)個離心管內(nèi)，以1500rpm/min離心510分鐘，充去上清液，取沉渣滴涂片檢查。溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體檢查：取新鮮痰液作涂片。天冷時應注意鏡臺載玻片保溫。高倍鏡觀察。如為阿米巴滋養(yǎng)體，可見其伸出偽足并作定向運動。上述其他的蠕蟲幼蟲及螨類等宜用濃集法檢查。2

28、.十二指腸液和膽汁用十二指腸引流管抽取十二指腸液及膽汁，以直接涂片法鏡檢；也可經(jīng)離心濃集后，吸取沉渣鏡檢。可檢查藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲卵、肝片形吸血卵和布氏姜片蟲卵等；急性阿米巴肝膿腫患者偶在膽汁中發(fā)現(xiàn)大滋養(yǎng)體。檢查方法：可將各部分十二指腸引流液滴于載玻片上，加蓋片后直接鏡檢。為提高寄生蟲檢出率，常將各部分引流加生理鹽水稀釋攪抖后，分裝離心管，以2000rpm/min，離心510分鐘，吸取沉渣涂片鏡檢。如引流液過于粘稠，應先加10NaOH消化后再離心。引流中的賈第蟲滋養(yǎng)體常附著在粘液小塊上，或蟲體聚集成絮片狀物。肝片形吸蟲卵與姜片蟲卵不易鑒別，但前者可出現(xiàn)于膽汁；而后者只見于十二指腸

29、液中。3.尿一般先離心，后取沉渣鏡檢。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振蕩，使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪層，離心，取沉渣鏡檢。4.鞘膜積液主要檢查班氏微絲蚴。陰囊皮膚經(jīng)碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜積液作直接涂片檢查，也可加適量生理鹽水稀釋離心，取沉渣鏡檢。5.陰道分泌物檢查陰道毛滴蟲。直接涂片法：用消毒棉簽在受檢查者陰道后穹窿、子宮頸及陰道壁上取分泌物，然后在有12滴生理鹽水的載玻片上作涂片鏡檢，可發(fā)現(xiàn)活動的蟲體。天氣寒冷時，應注意保溫。懸滴法：取陰道分泌物置于周緣涂抹一薄層凡士林蓋片上的生理鹽水中，翻轉(zhuǎn)蓋片小心覆蓋在具凹孔的載玻片上，稍加壓使兩片粘合，液滴懸于蓋片下面，鏡檢。（四）其它器官組織檢

30、查1.骨髓穿刺主要檢查杜氏利什曼原蟲無鞭毛體。一般常作髂骨穿刺，患者側臥，露出髂骨部位。視年齡大小，選用1720號帶有針芯的干燥無菌穿刺針，從髂骨前上刺后約1cm處刺入皮下，當針尖觸及骨面時，再慢慢地鉆入骨內(nèi)約0.51.0cm，即可拔出針芯，接上2ml的干燥注射器，抽取骨髓液。取少許骨髓液作涂片；甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油鏡檢。2.淋巴結穿刺利什曼原蟲：檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡便、安全，且患者經(jīng)治療后，淋巴結內(nèi)原蟲消失較慢，故仍有一定價值。一般選腹股溝部，先將局部皮膚消毒，用左手拇指和食指捏住一個較大的淋結，右手取干燥無菌的6號針頭刺入淋巴結，此時淋巴結組織液自能進入針內(nèi)。稍待片刻，

31、拔出針頭，將針頭內(nèi)少量的淋巴結組織液注于載玻片上，作涂片染色檢查。也可用摘除的淋巴結的切面做涂片，染色后鏡檢。絲蟲成蟲：可用注射器從可疑的淋巴結節(jié)中抽取成蟲，或剖檢摘除的結節(jié)尋找成蟲，也可作病理組織切片檢查。3.肌肉活檢旋毛蟲幼蟲：用外科手術從患者的腓腸肌或肱或股二頭肌取米粒大小的肌肉一塊，置于載玻片上，加50甘油滴，蓋上另一載玻片，均勻用力壓緊，低倍鏡下觀察。取下肌肉須立即檢查，否則幼蟲變得模糊，不易檢查。豬囊尾蚴：摘取肌肉內(nèi)的結節(jié)，剝除外層纖維被膜，在2張載玻片間壓平、鏡檢。也可經(jīng)組織固定后作切片染色檢查。4.皮膚檢查疥螨，蠕形螨，利什曼原蟲等。疥螨：參看“疥螨和疥瘡”！一節(jié)。蠕形螨：參看

32、“蠕形螨和蠕形螨病”一節(jié)。利什曼原蟲：在皮膚上出現(xiàn)丘疹和結節(jié)等疑似皮膚型黑熱病患者，可選擇皮損較明顯之處，作局部消毒，用干燥滅菌的注射器，刺破皮損處，抽取組織液作涂片；或用消毒的鋒利小剪，從皮損表面剪取一小片皮膚組織，以切面作涂片；也可用無菌解剖刀切一小口，刮取皮膚組織作涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未見原蟲，可割取小丘疹或結節(jié)，固定后，作組織切片染色檢查。5.直腸粘膜用直腸鏡從直腸粘膜病變組織內(nèi)可查見日本血吸蟲卵及溶組織阿米巴滋養(yǎng)體。日本血吸蟲卵：用直腸鏡自直腸取米粒大小的粘膜一塊，經(jīng)水洗后，放在2載玻片間，輕輕壓平，鏡檢。蟲卵鑒別見表21.3.表213粘膜內(nèi)血吸蟲卵未染色之鑒

33、別活卵 近期變性卵 死卵（鈣化卵）顏色 淡黃至黃褐色 灰白至略黃色 灰褐色至棕紅卵殼 較薄 薄或不均勻 厚而不均勻胚膜 清楚 清楚 不清楚內(nèi)含物 卵黃細胞或胚團或毛蚴 淺灰色或黑色小點或折光均勻的顆?；蛭s的毛蚴 兩極可有密集的黑點含網(wǎng)狀結構或塊狀物溶組織阿米巴：用乙狀結腸鏡觀察潰瘍形狀，自潰瘍邊緣或深層刮取潰瘍組織，置于載玻片上，加少量生理鹽水，蓋上蓋片，輕輕壓平，立即鏡檢。也可取出一小塊病變的粘膜組織，固定切片，染色檢查。6.肺組織檢查卡氏肺孢子蟲包囊。取一小塊肺組織作涂片，自然干燥后甲醇固定，用改良銀染色法進行染色。改良銀染色法染色步驟：1.將肺涂片置于5鉻酸，氧化15分鐘，溫度為20。

34、氧化后的標本均從流水沖洗數(shù)秒。2.1亞硫酸氫鈉經(jīng)1分鐘，自來水沖洗后，蒸餾水洗滌34次。3.放入四胺銀工作液內(nèi)，并在60孵育約90分鐘，至標本轉(zhuǎn)至黃褐色為止。流水、蒸餾水各洗5分鐘。4.0.1氯化金25分鐘，蒸餾水洗45次。5.2硫代硫酸鈉5分鐘，流水至少洗10分鐘。6.亮緣復染45秒。7.95，99，100乙醇逐級脫水。8.二甲苯透明3次，樹膠封片。染色結果顯示，卡氏肺孢子蟲包囊呈圓形、卵圓形或不規(guī)則的多角形，囊壁為淡褐色或深褐色。紅細胞為淡黃色，其余背景呈淡綠色。（陳佩惠 姜洪杰）二、免疫論斷及新技術應用（一）皮內(nèi)試驗利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測皮丘及紅暈反應以判斷

35、有無特異抗體（IgE）的存在稱皮內(nèi)試驗（intradermal test，IDT）。皮內(nèi)試驗用于多種寄生蟲病的檢測，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于血吸蟲病的調(diào)查，操作簡單，并且可即時觀察結果，適宜現(xiàn)場應用。大多用粗制可溶性血吸蟲蟲卵抗原（稀釋度為1：4000）或成蟲冷浸抗原（稀釋度為1：8000）敏感性高，其陽性率在9397，但有部分假陽性反應（2.13.5），并且對其他寄生蟲病交叉反應較高。皮內(nèi)試驗可用作過篩方法，先作皮試，陽性者再作進一步追查；臨床輔助診斷；考核預防效果，用作檢查新感染的方法，特別對兒童。（二）染色試驗染色試驗（dyetest，DT）是比較獨特的免疫反應，是目前診斷弓形蟲

36、病較好的方法，已廣泛用于該病的臨床診斷和流行病學調(diào)查。新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清混合，在37作用1小時或室溫數(shù)小時后，大部分弓形蟲失去原來的新月形，而變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿性美藍染色時著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍染色時，著色很淺或不著色。其原因可能是由于弓形蟲受到特異體抗體和輔助因子協(xié)同作用后，蟲體細胞變性，結果蟲體對堿性美藍不易著色。材料和試劑以弓形蟲速殖子為抗原；采用正常人血清為致活因子。堿性美藍溶液，取美藍10g加入95酒精100ml，制成飽和酒精溶液，過濾后取3ml加pH11，要求臨用時新鮮配制。待檢血清經(jīng)5630分鐘滅活，冰箱保存?zhèn)溆?。方法?/p>

37、待檢血清用生理鹽水倍比稀釋，每孔0.1ml，加上述稀釋的弓形蟲速殖子0.1ml，置37水浴1小時，加堿性美藍溶液0.02ml孔，37水浴15分鐘，以每孔聚懸液1滴于載玻片上，加蓋玻片，高倍顯微鏡檢查，計數(shù)100個弓形蟲速殖子，統(tǒng)計著色和不著色速殖子比例數(shù)。結果判定以能使50弓形蟲不著色的血清最高稀釋度為該血清染色試驗陽性效價。陽性血清稀釋度1：8為隱性感染；1：256為活動性感染；1：1024為急性感染。（三）環(huán)卵沉淀試驗環(huán)卵沉淀試驗（circumovalprecipitintest，COPT）是以血吸蟲整卵為抗原的特異免疫血清學試驗，卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)

38、的特異抗體結合，可在蟲卵周圍形成特殊的復合物沉淀，在光鏡下判讀反應強度并計數(shù)反應卵的百分率稱環(huán)沉率。1.常規(guī)法用載玻片或凹玻片進行，加樣本血清后，挑取適量鮮卵或干卵（約100150個，從感染動物肝分離），覆蓋24×24mm蓋片，四周用石蠟密封，37保溫48小時后，低倍鏡觀察結果，必要時需觀察72小時的反應結果。典型的陽性反應為泡狀、指狀、片狀或細長卷曲狀的折光性沉淀物，邊緣整齊，與卵殼牢固粘連。陰性反應必須觀察全片；陽性者觀察100個成熟卵，計環(huán)沉率及反應強度比例。環(huán)沉率是指100個成熟蟲卵中出現(xiàn)沉淀物的蟲卵數(shù)。凡環(huán)沉率5者可報告為陽性，（在基本消滅和消滅血吸蟲病地區(qū)環(huán)沉率3者可判為

39、陽性），14者為弱陽性。環(huán)沉率在治療上具有參考意義。2.分級強度判定“”折光淡，與蟲卵似連非連：“影狀”物（外形不甚規(guī)則，低倍鏡下有折光，高倍鏡下為顆粒狀）及出現(xiàn)直徑小于10m的泡狀沉淀物者，皆為陰性?！啊毕x卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物（10m），累計面積小于蟲卵面積的12；或呈指狀的細長卷曲樣沉淀物，不超過蟲卵的長徑?！啊毕x卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物的面積大于蟲卵面積的12；或細長卷曲樣沉淀相當或超過蟲卵的長徑?！啊毕x卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物的面積大于蟲卵本身面積；或細長卷曲樣沉淀物相當或超過蟲卵長徑的2倍。3.近年來對COPT的方法作了一些改進如雙面膠紙條法：將雙面膠紙條制特定的式樣作COPT，可省略蠟封片

40、法的繁瑣步驟，具有操作簡易，方法規(guī)范，提高工效和避免空氣污染的優(yōu)點。雙面膠紙條法COPT（DGSCOPT）已在現(xiàn)場擴大應用，今后若能將該法配套干卵，則更能提高它的應用價值；血吸蟲干卵抗原片（或膜片）環(huán)卵沉淀試驗，利用環(huán)卵抗原活性物質(zhì)的耐熱特性，將分離的純卵超聲和熱處理，定量滴加，烤干固定于載玻片或預制的聚乙稀薄膜上。此種干卵膜片，保存時間較長（4半年），已有市售商品。試驗時只需加入血清試樣，濕盒孵育，判讀結果與常規(guī)法相同。干卵膜片法還具有簡化操作規(guī)程，提高卵抗原的規(guī)范要求，并可長期保存等優(yōu)點。COPT可作為診斷血吸蟲病的血清學方法之一，及臨床治療病人的依據(jù)；可用作考核治療和防治效果的方法；并且

41、用于血清流行病學調(diào)查及監(jiān)測疫情的方法。（四）間接血凝試驗間接血凝試驗（indirecthaemagglutinationtest，IHA）是以紅細胞作免疫配體的載體，并以紅細胞凝集讀數(shù)的血清學方法。最常用的紅細胞為綿羊或人（O型）紅細胞，來源方便。目前均用醛化紅細胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能。操作步驟如下：1.紅細胞鞣化和致敏取醛化紅細胞用0.15molL，pH7.2PBS離心洗滌2次，并用PBS配成2.5懸液；加等量1：2000鞣酸溶液（鞣酸不同批號，質(zhì)量相差較大必須預試測定適宜濃度）37孵育20分鐘，經(jīng)常搖動；離心去上清，PBS洗1次，再用0.15molL，pH6.4PBS配成10懸

42、液；每份懸液加等量適當稀釋的抗原液，置于37水浴箱中30分鐘（每5分鐘振動一次），離心去上清，pH7.2PBS洗2次，再用含1正常兔血清（NRS）10蔗糖緩沖液配成5細胞懸液。加1疊氮鈉防腐，存4或減壓凍干備用，每批致敏細胞均需用已知陽性和陰性血清滴定靈敏度或特異性。陽性滴度在1：640以上，陰性血清不出現(xiàn)反應者可用。2.微量血凝試驗在U型（或V型）微量血凝板上，將被試血清用1NRS或BSA生理鹽水作倍比系列稀釋，每孔含稀釋血清0.05ml.每孔加0.01ml致敏紅細胞懸液（可用標定過的OT針頭滴加），充分振蕩搖勻，加蓋于室溫靜置12小時讀取結果。3.根據(jù)紅細胞在孔底的沉積類型而定?！啊?，紅細

43、胞沉于管底，呈圓點形，外周光滑：“±”，紅細胞沉于管底，周圍不光滑或中心有白色小點：“”，紅細胞沉積范圍很小，呈較明顯的環(huán)形圈：“”，紅細胞沉積范圍較小，其中可出現(xiàn)淡淡的環(huán)形圈：“”，紅細胞布滿管底呈毛玻璃狀：“”，紅細胞呈片狀凝集或邊緣卷曲。呈明顯陽性反應（）的最高稀釋度為該血清的滴度或效價。目前對血吸蟲病應用純化蟲卵抗原間接血凝試驗。采用經(jīng)SephadexG100柱層析純化的血吸蟲卵抗原致敏紅細胞作IHA，提高了方法的敏感性，特異性和重現(xiàn)性，為在疫區(qū)擴大應用提供了條件。IHA操作簡便，敏感性高，適于現(xiàn)場使用，可作為輔助論斷病人，流行病學調(diào)查及綜合查病方法。先后在多種寄生蟲感染中應

44、用，如血吸蟲，瘧疾、豬囊蟲，旋毛蟲，肺吸蟲，阿米巴，弓形蟲，肝吸蟲等。有些已制成商品診斷藥盒。不足之處是不能提供檢測抗體的亞型類別，和容易發(fā)生異常的非特異凝集。另外抗原的標準化，操作方法規(guī)范化急待解決，以提高其診斷效果和可比性。（五）免疫熒光法免疫熒光法（immunofluorescentmethod，IF）是借抗原抗體反應進行特異熒光染色的診斷技術。最常用的熒光素為異硫氰基熒光素（fluorescein isothiocynate，F(xiàn)ITC）。常用于寄生蟲感染的熒光抗體染色有直接法與間接法。1.直接法用于檢測抗原，其缺點是每查一種抗原必須制備與其相應的熒光標記的抗體。目前很少應用。2.間接法

45、也稱間接熒光抗體法（indirectfluorescent antibody method，IFA）。將抗原與未標記的特異性抗體（如患者血清）結合，然后使之與熒光標記的抗免疫球蛋白抗體（抗抗體）結合，三者的復合物可發(fā)出熒光。本法的優(yōu)點是制備一種熒光標記的抗體，可以用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查，即可用以測定抗原，也可用來測定抗體。IFA的抗原可用蟲體或含蟲體的組織切片或涂片，經(jīng)充分干燥后低溫長期保存?zhèn)溆谩Ｒ粡堓d片可等距置放多個抗原位點用以同時檢測多個樣本或確定滴度。IFA的操作步驟如下：抗原標本：用記號筆或蠟筆將各個抗原位點圍圈隔離；在每個抗原位置滴加已稀釋的血清樣本或樣本稀釋系列，使樣本液充滿

46、圈內(nèi)，置濕匣37孵育30分鐘；用pH8.00.01molL PBS沖后再置同樣PBS液中浸泡5分鐘，不時搖動，如此2遍，然后取出吹干；在抗原位點滴加經(jīng)pH8.0PBS適當稀釋的羊抗人IgG熒光抗體（每批結合物的工作濃度需經(jīng)滴定），使完全覆蓋抗原膜，置濕盒37孵育30分鐘；經(jīng)洗滌（同）后用0.1伊文思藍液復染10分鐘，然后以PBS流水沖洗0.51分鐘，風干；用pH8.5或pH8.0碳酸（或磷酸）緩沖甘油封片，也可加一小滴PBS（pH8.0）覆以蓋片鏡檢。鏡檢應及時進行以免疫光衰變。可使用熒光光源或輕便熒光光源，配以適合的激發(fā)濾片和吸收濾片，在低倍或高倍鏡下檢查。以見有符合被檢物形態(tài)結構的黃綠色清

47、晰熒光發(fā)適合的激發(fā)濾片和吸收濾片，在低倍或高倍鏡下檢查。以見有符合被檢物形態(tài)結構的黃綠色清晰熒光發(fā)光體、而陰性對照不可見者為陽性反應。根據(jù)熒光亮度及被檢物形態(tài)輪廓的清晰度把反應強度按5級區(qū)別（，±，）。以上的熒光強度為陽性。該法具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性，應用抗原經(jīng)濟。國內(nèi)外廣泛應用于寄生蟲病的血清學診斷方法，血清流行病學調(diào)查和監(jiān)測疫情的方法，如主要用于診斷瘧疾、絲蟲病及血吸蟲病，也有用于肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病及弓形蟲病的血清學診斷。近10年來，國內(nèi)學者對IFA進行了很多改進。李允鶴等（1984，1988）通過深入研究，確定了感染鼠肝細胞內(nèi)蟲卵冰凍切片為IFA較為理想的

48、診斷抗原。該法需用熒光顯微鏡判斷結果，限制了它的應用范圍。但是應用該法時必須具備的熒光抗體，目前國內(nèi)已有商品供應，這為IFA的擴大應用，提供了條件。（六）對流免疫電泳試驗對流免疫電泳試驗（counter-immunaoelectrophoretic assay，CIE）以瓊脂或瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的一種快速，敏感的電泳技術。對流電泳較簡單的擴散法和常規(guī)免疫電泳法至少敏感1020倍，省時，省料，可用已知抗原檢測抗體或相反，反應結果特異，陽性反應的可信度高，適用范圍廣。近年來本法的改進已試用酶或放射標記的反應配體，如酶標記抗原對流免疫電泳（ELACIE）、放射對流免疫電泳自顯影術（RCIEA）等。以克

49、服電泳技術本身不夠靈敏的弱點，國內(nèi)在血吸蟲病、肺吸蟲病免疫診斷已獲良好結果。國外報道應用于阿米巴病、錐蟲病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸蟲病等血清學診斷。（七）酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbent assay.ELISA）簡稱酶聯(lián)試驗，已廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液（血清，腦脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測。根據(jù)檢測要求，試驗可分多種類型，常用者有：用于檢測抗體的間接法；檢測IgM的雙夾心法；檢測抗原的雙抗體夾心法；以固相抗體檢測抗原的競爭法以及競爭抑制法等（圖218）。圖218酶聯(lián)免疫吸附試驗常用方法示意圖酶

50、聯(lián)試驗的方法根據(jù)所用載體、酶底物系統(tǒng)、觀察反應結果等不同而有很大差別。目前最常用的固相載體為聚苯乙稀微量滴定板，具有需樣少，敏感，重演性好，使用方便等優(yōu)點。酶底物系統(tǒng)也有多種，常用的有辣根過氧化物酶鄰苯二胺（HRPOPD）、堿性磷酸酯酶硝酚磷酸鹽（AKPPNP）等，具有較好的生物放大效應。其中HRP由于價廉、易得而被廣泛應用。酶聯(lián)試驗的基本操作過程可分為：固相包被；溫育洗滌；加樣；酶結合物反應；底物顯色；終止反應讀取結果等若干步驟。溫育和洗滌需貫穿在每二步驟之間，用以去除多余的反應物。以下為臨床上最常用的間接法（檢測抗體）和雙抗體夾心法（檢測抗原）的操作程序：間接法：1）以包被液（碳酸鈉碳酸氫

51、鈉緩沖液0.05molL，pH9.6）稀釋抗原（常用510g/ml），每孔0.1（或0.2）ml包被反應板，37濕盒溫育23小時或4過夜；2）棄去包被液，反應板用去離子水或PBSTween液（0.005molL PBS含0.05Tween-20）沖洗3次，甩干；3）用樣本稀釋液（0.05molL PBS含0.05Tween-20）稀釋樣本（起始濃度1001），用樣本稀釋液（每孔0.1（或0.2）ml，溫育1小時；4）棄去樣液，如上沖洗，甩干加稀釋結合物（市售品常稀釋至1001，用樣本稀釋液），每孔0.1（或0.2）ml，溫育12小時；5）如上沖洗甩干后即刻加入新鮮配制的底物系統(tǒng)，每孔0.1（或

52、0.2）ml，置暗盒室溫15分鐘；6）終止反應：HRPOPD系統(tǒng)每孔加1molLH2SO450l；7）目測或用分光光度計在400m波段測定吸收值來判斷。雙抗體夾心法：1）以包被液稀釋抗體（如兔抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的抗體，抗SEAIgG）包被反應板（11000g/ml），方法同間接法包被抗原；2）沖洗，甩干，加樣溫育同前（起始濃度51）；3）加結合物（例如抗SEAIgGHRP），適宜工作濃度需先經(jīng)方陣滴定確定；4）以下各步同間接法。若包被抗體與第二抗體來自不同種的供體則可應用市售抗免疫球蛋白結合物。例如包被抗體為羊抗SEA，二抗用兔抗SEA則在未標記的二抗溫育洗滌后加羊抗兔IgG結合物（GAP

53、HRP）。附酶標記物制備：應用抗原或抗體與酶分子的交聯(lián)技術，交聯(lián)物亦稱酶結合物（conjugate）。根據(jù)酶與抗體（抗原）的激活順序，交聯(lián)反應可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的過碘酸鈉法多用，戊二醛一步法反應率較低，較適用于交聯(lián)AKP.免疫球蛋白標記辣根過氧化物酶（過碘酸鈉法）與免疫球蛋白標記堿性磷酸脂酶（戊二醛一步法），按常規(guī)方法制備?？笽gG型抗體酶結合物也可用金黃色葡萄球菌A蛋白酶結合物替代，稱A蛋白酶聯(lián)試驗（SPAELISA）。A蛋白辣根過氧化物酶結合物（PAHRP）已有市售標準品，其敏感度稍遜于抗體酶結合物。底物配制：不同的酶要求選擇相應底物，以下為分別適用于比色和肉眼

54、讀取結果的兩種HRP常用底物配制。鄰苯二胺（OPD）：經(jīng)HRP催化后生成橘紅色產(chǎn)物。40mgOPD溶于檸檬酸磷酸緩沖液（pH5.0）100ml（含24.3ml 0.1molL檸檬酸，25.7ml0.02molL Na2HPO4加水50ml），臨用前加30H2O20.15ml，溫育15分鐘后用2moll H2SO4終止反應，492nm讀數(shù)。本底物具高度敏感性，顯色梯度良好，生成可溶性產(chǎn)物，有利于比色讀數(shù)，但為光敏感，反應時應置暗盒內(nèi)；也具致突變作用。5氨基水楊酸（5AS）：經(jīng)HRP催化生成棕色產(chǎn)物。8mg5AS溶于10ml50溫熱蒸餾水中，置4暗處不超過3天，臨用前以1n NaOH調(diào)pH至6.0

55、，加0.05H2O2 1ml.37經(jīng)3060分鐘溫浴后用1n NaOH終止反應，肉眼或449nm比色。本底物無致突變作用，生成棕褐色不全溶解的產(chǎn)物有利于肉眼判讀結果。酶聯(lián)試驗為高靈敏檢測技術，結果可定量表示，可檢測抗體、抗原或特異性免疫復合物，微量滴定板法消耗樣本試劑少，能供全自動操作，適用批量樣本檢測，因此在寄生蟲感染的研究和診斷領域乃至血清流行病學均被廣泛應用。國內(nèi)外有多種寄生蟲感染的酶聯(lián)藥籍出售，包括有血吸蟲病、弓形蟲病、阿米巴病、絲蟲病、蛔蟲病、旋毛蟲病和犬蛔蟲病等，ELISA可用作輔助診斷病人，血清流行病學調(diào)查和監(jiān)測疫情的方法。酶聯(lián)試驗操作程序的簡單快速不如IHA，但方法具有很大所改

56、良潛力和適應范圍。判斷結果需用分光光度計，限制了擴大應用；另外，應用抗原及酶結合物尚需進一步標準化，操作方法也應規(guī)范化。近年來已有多種改進的酶聯(lián)免疫吸附試驗如快速ELISA：改進特點為用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反應板作載體；將1可溶性血吸蟲卵抗原與尿素溶解性血吸蟲卵抗原等量相混合預吸附于薄膜上；用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制備酶結合物；用底物TMB代替OPD.該法主要以目視法判斷結果，整個操作流程僅需20min左右。硫酸銨沉淀抗原ELISA：可溶性血吸蟲卵抗原經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后用作ELISA診斷抗原；在系列實驗基礎上，使操作方法達到規(guī)范化；用質(zhì)量控制圖控制檢測差異，并以標準曲線單位判