時間分辨熒光技術(shù)TRFIA技術(shù)培訓(xùn)資料

1、時間分辨熒光技術(shù)TRFIA技術(shù)培訓(xùn)資料標記免疫技術(shù)的檢測水平標記免疫技術(shù)的檢測水平 放射免疫放射免疫（精度：（精度：10-12mol/L ） 酶聯(lián)免疫酶聯(lián)免疫（精度：（精度：10-9 mol/L ） 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光（精度：（精度：10-15mol/L ） 電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光（精度：（精度：10-17mol/L ） 時間分辨熒光（精度：時間分辨熒光（精度：10-18mol/L ）放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（RIARIA） 放免自放免自60年代問世以年代問世以來對臨床診斷起了革來對臨床診斷起了革命性的貢獻，是一項命性的貢獻，是一項較為成熟的診斷技術(shù)。較為成熟的診斷技術(shù)。 夾心法、競爭法

2、的標夾心法、競爭法的標記原理為以后的檢測記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。礎(chǔ)。 放射性（放射性（125 I），對環(huán)），對環(huán)境的污染及對身體的境的污染及對身體的危害危害125125 I 的半衰期短而導(dǎo)的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短致其試劑有效期短 被標記物的穩(wěn)定性差被標記物的穩(wěn)定性差 操作繁瑣，費時操作繁瑣，費時 無法保存?zhèn)溆脽o法保存?zhèn)溆妹该庖叻治龇ǎ该庖叻治龇ǎ‥LISAELISA） 酶免的最大優(yōu)勢在于避酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害免了對環(huán)境和人體危害 試劑有效期較長試劑有效期較長 曾經(jīng)一度被認為是取代曾經(jīng)一度被認為是取代放免的檢測手段放免的檢測手段 靈敏

3、度、重復(fù)性不及放靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽免，易造成漏檢和假陽性性 因酶的純度和反應(yīng)過程因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不好導(dǎo)致穩(wěn)定性不好化學(xué)發(fā)光免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassaychemiluminescent immunoassay）單個樣本檢測速度快，適合做單個樣本檢測速度快，適合做急診急診靈敏度較高靈敏度較高自動化程度高自動化程度高分類：分類： 以丫啶酯直接標記以丫啶酯直接標記 以以HRP標記，魯米諾為發(fā)標記，魯米諾為發(fā)光底物光底物Amerlite系統(tǒng)系統(tǒng) 以以AP(堿性磷酸酶堿性磷

4、酸酶 )為標記為標記物，物，AMPPD為發(fā)光底物為發(fā)光底物 樣品不能重復(fù)檢測樣品不能重復(fù)檢測 本底較高本底較高 儀器故障率較高儀器故障率較高 試劑穩(wěn)定性較差試劑穩(wěn)定性較差 檢測精度不高，在超微檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面量分析及早期診斷方面能力不足能力不足 非開放性試劑；試劑價非開放性試劑；試劑價格高格高電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECLECL） 80年代末期問世的新型年代末期問世的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法化學(xué)發(fā)光免疫分析方法 基本原理：根據(jù)三聯(lián)吡基本原理：根據(jù)三聯(lián)吡啶釕啶釕Ru(bpy)3和三丙胺和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的化學(xué)

5、發(fā)光反應(yīng) 本底較小、靈敏度較高、本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬線性范圍較寬 以羅氏為代表以羅氏為代表 非開放性試劑系統(tǒng)、不非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研能做科研 試劑價格過高試劑價格過高二、時間分辨熒光技術(shù)二、時間分辨熒光技術(shù) （Time-Resolved Fluorescence）時間分辨熒光發(fā)展史時間分辨熒光發(fā)展史 1979 1979年，年，提出提出“時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析”理論，理論，19891989年該技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎提名。年該技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎提名。 9090年代以來，時間分辨熒光分析技術(shù)因其靈年代以來，時間分辨熒光分析技術(shù)因其靈敏度高，操作簡便，標準曲線范圍寬

6、，不受樣敏度高，操作簡便，標準曲線范圍寬，不受樣品自然熒光干擾，無放射性污染等特點，其方品自然熒光干擾，無放射性污染等特點，其方法學(xué)研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展十分迅速。法學(xué)研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展十分迅速。 時間分辨熒光分析技術(shù)正在成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研時間分辨熒光分析技術(shù)正在成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中最有發(fā)展前景的分析手段究中最有發(fā)展前景的分析手段時間分辨免疫熒光技術(shù)的定義時間分辨免疫熒光技術(shù)的定義 用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，標用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，標記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì) 當反應(yīng)體系發(fā)生后，如抗原抗體免疫反應(yīng)、當反應(yīng)體系發(fā)生后，如抗原抗體免疫反應(yīng)

7、、核酸探針雜交等反應(yīng)，經(jīng)解離核酸探針雜交等反應(yīng)，經(jīng)解離增強作用，增強作用，用時間分辨熒光儀，測定最后產(chǎn)物的熒光強用時間分辨熒光儀，測定最后產(chǎn)物的熒光強度度 根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達到定量分析的目應(yīng)體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的的TRFTRF分析原理圖（分析原理圖（1 1）Eu標記物輕鏈輕鏈螯合劑螯合劑Eu重鏈重鏈儀器檢測儀器檢測標記物為稀土金屬標記物為稀土金屬-鑭系元素鑭系元素 銪銪(Eu)(Eu)、釤（、釤（Sm)Sm)、鏑、鏑(Dy)(Dy)、锝、锝(Tb)(Tb)鑭系元素?zé)晒馓攸c：鑭系元素?zé)晒馓攸c： 1

8、1、熒光壽命極長、熒光壽命極長鑭系元素螯合物（鑭系元素螯合物（6060900 us) 900 us) 714us普通熒光免疫中熒光團：普通熒光免疫中熒光團：1 1100us100us樣本中蛋白質(zhì)熒光：樣本中蛋白質(zhì)熒光：1 110us10us，易猝滅，易猝滅利用鑭系元素?zé)晒馕锢描|系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后理特性，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特在固定時間段檢測特異性熒光而在此時間異性熒光而在此時間之前，非特異性熒光之前，非特異性熒光已完全衰減為已完全衰減為0 0TRF分析原理圖（分析原理圖（2）標記物為稀土金屬標記物為稀土金屬-鑭系元素鑭系元素2 2、StokesStokes位移大位移大（大約

9、（大約290nm290nm） 銪：激發(fā)光銪：激發(fā)光340nm340nm、發(fā)射光、發(fā)射光613nm613nm 熒光素的熒光素的StokesStokes位移為位移為280nm280nm3 3、熒光特異性強、熒光特異性強（發(fā)射光譜帶很窄：（發(fā)射光譜帶很窄：615615 5nm5nm）4 4、解離、解離- -增強技術(shù)增強技術(shù)可使其熒光性提高可使其熒光性提高100100萬萬倍倍巨大巨大StokesStokes位移位移發(fā)射光譜與激發(fā)發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨光譜間存在的巨大大StokesStokes位移。位移。可以通過干涉濾可以通過干涉濾光片將發(fā)射光譜光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全與激發(fā)光譜完全分離分離T

10、RFIATRFIA為臨床檢測帶來的先進性為臨床檢測帶來的先進性技術(shù)技術(shù)特點特點檢驗先進性檢驗先進性時間分辨時間分辨光譜分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒特異性熒光與非特異性熒光分離光分離發(fā)射熒光與激發(fā)光分離發(fā)射熒光與激發(fā)光分離零背景、高特異性零背景、高特異性高靈敏度高靈敏度解離解離-增強增強 熒光性大大提高熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍寬線性范圍寬高靈敏度高靈敏度原子標記原子標記 標記位點多，可達標記位點多，可達20個個 對標記物結(jié)構(gòu)及活性影對標記物結(jié)構(gòu)及活性影響小響小 無衰變無衰變 受環(huán)境影響小受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度高穩(wěn)定性，高精確度試劑保質(zhì)期至少一年試劑保質(zhì)

11、期至少一年標準曲線保留時間長標準曲線保留時間長同一批次可兩點定標同一批次可兩點定標多標記多標記單，雙，三，四標記單，雙，三，四標記同一試劑盒可同時測同一試劑盒可同時測多個項目多個項目靈敏度更高，檢測范圍更廣靈敏度更高，檢測范圍更廣 以下數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書以下數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書 試劑試劑 DELFIA（WALLC） Immulite（DPC化學(xué)發(fā)光）化學(xué)發(fā)光） ACS-180(拜爾）拜爾） AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/m

12、l HCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml FSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog0.08-120nmol/L 無無 0.1-40ng/ml Prolactin0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩(wěn)定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3

13、DELFIA hFSHN=6標準曲線穩(wěn)定，試劑保質(zhì)期時間長標準曲線穩(wěn)定，試劑保質(zhì)期時間長時間分辨熒光與化學(xué)發(fā)光方法學(xué)比較時間分辨熒光與化學(xué)發(fā)光方法學(xué)比較 發(fā)光效率發(fā)光效率 95%1% 重復(fù)檢測重復(fù)檢測 可無數(shù)次可無數(shù)次 不可重復(fù)不可重復(fù)本底噪聲本底噪聲 零本底零本底 干擾大干擾大靈敏級數(shù)靈敏級數(shù) 10-18 10-15標記物標記物 原子原子 大分子化合物大分子化合物標記位點標記位點 可達可達20個個/抗體抗體 1個個/抗體抗體標準曲線標準曲線 穩(wěn)定達一年以上穩(wěn)定達一年以上 穩(wěn)定穩(wěn)定 2 到到 4周周多標記多標記 有，最多可達四標記有，最多可達四標記 無無科研開發(fā)科研開發(fā) 有有 無無時間分辨熒光

14、和電化學(xué)發(fā)光的比較時間分辨熒光和電化學(xué)發(fā)光的比較 標記物標記物四種原子四種原子: Eu, Sm, Tb, Dy一種原子一種原子: 釕釕多標記技術(shù)多標記技術(shù) 有有 無無做科研做科研能能(1000多種科研項目多種科研項目) 無無 試劑種類試劑種類58種臨床種臨床,24種科研種科研, 28種臨床種臨床, 無科研試劑無科研試劑 共共82種種試劑價格試劑價格 低低 高高時間分辨熒光免疫時間分辨熒光免疫-突出優(yōu)點突出優(yōu)點 零本底、靈敏度高零本底、靈敏度高 線性范圍寬線性范圍寬 試劑有效期長試劑有效期長 標準曲線穩(wěn)定性好標準曲線穩(wěn)定性好 易于自動化易于自動化 對環(huán)境及人體沒有任何影響對環(huán)境及人體沒有任何影響

15、TRFIA作為一項具有廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物作為一項具有廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物學(xué)技術(shù)，將會給標記免疫學(xué)帶來一場革命。學(xué)技術(shù)，將會給標記免疫學(xué)帶來一場革命。三、時間分辨熒光免疫技術(shù)三、時間分辨熒光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用 (臨床檢測試劑盒簡介臨床檢測試劑盒簡介) 內(nèi)分泌科檢查 1 、甲狀腺功能系列、甲狀腺功能系列 T3 三碘甲狀原氨酸三碘甲狀原氨酸T4 甲狀腺素甲狀腺素FT3 游離三碘甲狀原氨酸游離三碘甲狀原氨酸FT4 游離甲狀腺素游離甲狀腺素TSH-U 促甲狀腺素促甲狀腺素(超敏感超敏感)TBG Ab 甲狀腺結(jié)合球蛋白甲狀腺結(jié)合球蛋白TPO Ab 甲狀腺過氧化物酶甲狀腺過氧化物酶時間分辨熒

16、光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹臨床意義概述：臨床意義概述： 甲狀腺是人體一個重要的內(nèi)分泌腺，也是最大的內(nèi)甲狀腺是人體一個重要的內(nèi)分泌腺，也是最大的內(nèi)分泌腺體，甲狀腺疾病也是目前最常見最多發(fā)一種分泌腺體，甲狀腺疾病也是目前最常見最多發(fā)一種內(nèi)分泌疾病，對人體的正常功能可產(chǎn)生明顯影響，內(nèi)分泌疾病，對人體的正常功能可產(chǎn)生明顯影響，甚至危及生命。甚至危及生命。 以上各項目的聯(lián)合檢測，為臨床醫(yī)生對病患者甲狀以上各項目的聯(lián)合檢測，為臨床醫(yī)生對病患者甲狀腺功能的評價提供更基礎(chǔ)、全面的依據(jù)。腺功能的評價提供更基礎(chǔ)、全面的依據(jù)。時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介

17、紹2 、糖尿病系列、糖尿病系列 InS 胰島素胰島素 CP C肽肽 臨床意義概述：臨床意義概述： 了解殘留胰島了解殘留胰島細胞的功能，特別是用于區(qū)分胰細胞的功能，特別是用于區(qū)分胰島素依賴型糖尿病島素依賴型糖尿病(IDDM)(IDDM)和非胰島素依賴型糖尿和非胰島素依賴型糖尿病病(NIDDM);(NIDDM); 用于胰島素瘤的診斷等。用于胰島素瘤的診斷等。時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹 時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹3 、生長激素、生長激素 hGH 生長激素生長激素 臨床意義概述：臨床意義概述： 對診斷肢端肥大癥是一項特異的方法

18、；對診斷肢端肥大癥是一項特異的方法； hGH低下還見于侏儒癥和垂體前葉功能減退癥如低下還見于侏儒癥和垂體前葉功能減退癥如席漢綜合征等。席漢綜合征等。 婦產(chǎn)科檢查（性激素） hCG 絨毛膜促性腺激素絨毛膜促性腺激素 LH-Spec 黃體生成素黃體生成素(特異性特異性) FSH 促卵泡激素促卵泡激素 PRL 催乳素催乳素 E2 雌二醇雌二醇 Testo 睪酮睪酮 Prog 孕酮孕酮 SHBG 性激素結(jié)合球蛋白性激素結(jié)合球蛋白時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹臨床意義概述臨床意義概述 性激素是由性器官或腎上

19、腺皮質(zhì)分泌的，維持和調(diào)性激素是由性器官或腎上腺皮質(zhì)分泌的，維持和調(diào)節(jié)機體內(nèi)正常生命，生理活動和生殖功能的一類甾節(jié)機體內(nèi)正常生命，生理活動和生殖功能的一類甾體激素。體激素。 檢測這些激素的含量對于生殖生理的研究、疾病的檢測這些激素的含量對于生殖生理的研究、疾病的診斷、治療、隨訪及計劃生育工作的開展具有重要診斷、治療、隨訪及計劃生育工作的開展具有重要的意義。的意義。 腫瘤科檢查 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 PSA 前列腺特異抗原前列腺特異抗原 B2-M Beta 2微球蛋白微球蛋白 NSE 神經(jīng)元烯醇化酶神經(jīng)元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原癌胚抗原 PSA Fr

20、ee / total 前列腺特異抗原前列腺特異抗原/總量總量時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹臨床意義概述：臨床意義概述： 腫瘤標志物（腫瘤標志物（Tumor Markers,TM)是指示體內(nèi)腫瘤存是指示體內(nèi)腫瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物質(zhì)。通過測定其在并反映其一定的生物特性的生化物質(zhì)。通過測定其存在或含量，對于腫瘤可輔助診斷，分析病情，指導(dǎo)存在或含量，對于腫瘤可輔助診斷，分析病情，指導(dǎo)治療，監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后等。對現(xiàn)有治療，監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后等。對現(xiàn)有TM項目項目進行綜合分析、多元分析，篩選出有價值的進行綜合分析、多元分析，篩選出有價值的TM

21、，確定，確定一個最佳組合方式具有極大的臨床意義。一個最佳組合方式具有極大的臨床意義。時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹 遺傳科檢查1 、產(chǎn)前篩查產(chǎn)前篩查 PAPP-A 妊娠相關(guān)血漿蛋妊娠相關(guān)血漿蛋 Free hCGBeta 游離絨毛膜促性腺激素游離絨毛膜促性腺激素 亞單位亞單位 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 E3 游離雌三醇游離雌三醇h AFP/Free hCG 甲胎蛋白甲胎蛋白/游離絨毛膜促性腺激素游離絨毛膜促性腺激素 亞單位亞單位 臨床意義概述：臨床意義概述： 是預(yù)防患有嚴重遺傳性疾病和先天畸形胎兒出生的一項是預(yù)防患有嚴重遺傳性疾病和先天畸形胎兒出生的一項有效措施

22、。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷完善，產(chǎn)前診斷不有效措施。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷完善，產(chǎn)前診斷不僅為患兒的出生提供了客觀依據(jù)，也使醫(yī)師能在分娩過僅為患兒的出生提供了客觀依據(jù)，也使醫(yī)師能在分娩過程中和分娩后給予合適的處理。程中和分娩后給予合適的處理。時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹2 、新生兒篩查、新生兒篩查 Neoneotal hTSH 新生兒篩查促甲狀腺素新生兒篩查促甲狀腺素 Neoneotal T4 新生兒篩查甲狀腺素新生兒篩查甲狀腺素 Neoneotal 17 -OH-Prog 17-羥基酮羥基酮 N

23、eoneotal PKU 新生兒篩查苯丙氨酸新生兒篩查苯丙氨酸臨床意義概述：臨床意義概述： 通過先進的實驗室檢測及早發(fā)現(xiàn)某些危害嚴重的先通過先進的實驗室檢測及早發(fā)現(xiàn)某些危害嚴重的先天性遺傳代謝性疾病，從而早期診斷、早期治療，天性遺傳代謝性疾病，從而早期診斷、早期治療，避免寶寶因腦、肝、腎等損害導(dǎo)致智力、體力發(fā)育避免寶寶因腦、肝、腎等損害導(dǎo)致智力、體力發(fā)育障礙甚至死亡。障礙甚至死亡。 血液科檢查1 、貧血檢查貧血檢查 Ferritin 鐵蛋白鐵蛋白 Vit B12 維生素維生素B12 folate 葉酸葉酸2 、白血病分型、免疫細胞分型、細胞毒試、白血病分型、免疫細胞分型、細胞毒試驗等驗等 其它

24、科研時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹時間分辨熒光分析儀器測定項目介紹 傳染科檢查 乙肝系列乙肝系列 HBsAg 表面抗原表面抗原 HBsAb 表面抗體表面抗體 HBeAg e抗原抗原 HBeAb e抗體抗體 HBcAb 核心抗體核心抗體 開發(fā)中：抗開發(fā)中：抗HBcIgM 臨床意義概述：臨床意義概述： 為乙型肝炎臨床早期診斷和治療提供病原學(xué)依據(jù)。為乙型肝炎臨床早期診斷和治療提供病原學(xué)依據(jù)。能動態(tài)觀察療效和監(jiān)測病情，對乙肝疫苗免疫力的能動態(tài)觀察療效和監(jiān)測病情，對乙肝疫苗免疫力的評價和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義。評價和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義。泰萊泰萊-I-I型時間分辨系型時間分辨系統(tǒng)統(tǒng)泰萊泰萊-型時間分辨系統(tǒng)型時間分辨系統(tǒng)使用使用TRFIATRFIA的理由的理由 一、專為中國醫(yī)院量身定制一、專為中國醫(yī)院量身定制 儀器、試劑的國產(chǎn)化，更適應(yīng)我國國情，為各儀器、試劑的國產(chǎn)化，更適應(yīng)我國國情，為各級醫(yī)院開展高靈敏度的特種檢驗提供可行、低級醫(yī)院開展高靈敏度的特種檢驗提供可行、低成本的方案。成本的方案。