河北省玉米小斑病菌優(yōu)勢生理小種鑒定及ITS序列分析

1、河北省玉米小斑病菌優(yōu)勢生理小種鑒定及ITS序列分析李聰聰#，王亞嬌#，栗秋生，紀(jì)莉景，王連生，孔令曉* （河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000）摘要：2007-2016年在河北各地采集玉米小斑病標(biāo)樣，對分離出的356株玉米小斑病菌菌株進(jìn)行生理小種鑒定，結(jié)果表明：在鑒定的年度范圍內(nèi)，玉米小斑病菌T小種、C小種、S生理型、O小種的分離頻率在年度間存有差異，O小種的平均分離頻率94.94%，是河北省玉米小斑病菌的優(yōu)勢小種。同時O小種對主栽品種鄭單958和自交系C103的致病力呈下降趨勢，但在C103上

2、致病力下降幅度小于鄭單958。同時對河北省石家莊、保定、衡水、滄州邯鄲、邢臺采集的45株菌株進(jìn)行ITS序列分析構(gòu)建UPGMA進(jìn)化樹，分析結(jié)果表明河北省內(nèi)玉米小斑病菌株的遺傳進(jìn)化與地域有一定的關(guān)系，但差異不明顯。關(guān)鍵詞：玉米小斑病菌；生理小種；致病性；ITS序列分析Identification and ITS Sequence Analysis of Dominant Physiological Races of Bipolaris maydis in Hebei ProvinceLI Congcong#, WANG Yajiao#, LI Qiusheng, JI Lijing, WANG L

3、iansheng, KONG Lingxiao*(Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture /IPM Center of Hebei Province/ Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Baoding 071000, China)Abstract: The physiologic

4、al races of 356 strains of Bipolaris maydis were identified, which were collected from Hebei province from 2007 to 2016. Results showed that isolation frequencie of Race T, Race C, Type S and Race O is different from year to year. Race O is the dominant race of of B.maydis in Hebei province with 94.

5、94% everage isolation frequence. Meanwhile, the pathogenicity of race O to hybrid Zhengdan 958 and inbred line C103 was declining. However, the pathogenicity of Bipolaris maydis to C103 decreased less than that to zhengdan 958. ITS sequence of 45 strains collected from Shijiazhuang, Baoding, Hengshu

6、i, Cangzhou, Handan，Xingtai Hebei Province were analyzed and UPGMA evolutionary tree was construction .The result indicated that the genetic evolution of Bipolaris maydis was weakly geographically related.Keywords: Bipolaris maydis; physiological races; pathogenicity; ITS sequence analysis玉米小斑病又名南方葉

7、枯病，是廣泛發(fā)生于玉米產(chǎn)區(qū)的一種為害嚴(yán)重的葉部病害，在世界各國均有發(fā)生，是玉米主要病害之一，每年都會造成一定的產(chǎn)量損失。一般減產(chǎn)可達(dá)基金項(xiàng)目：糧食豐產(chǎn)增效科技創(chuàng)新：（2016YFD0300705）河北省財(cái)政基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2018120301）#作者簡介：李聰聰，女，河北保定，實(shí)習(xí)研究員，在讀碩士研究生E-mail：licongcong2017；王亞嬌，女，河北保定，助理研究員，碩士，E-mail：yajiaowang515；*通信作者：孔令曉，女，河北保定，研究員，碩士，E-mail：konglingxiao16315%-20%，嚴(yán)重的減產(chǎn)達(dá)到50%，甚至無收1。玉米小斑病菌有明顯的生理分化

8、現(xiàn)象，1970年，Smith2和Hooker3提出玉米小斑病菌存在T小種和O小種。1981年羅畔池等提出將中國的玉米小斑病菌劃分為16個生理小種，后續(xù)研究中把玉米小斑病菌分為T、C、S、O等4個小種4。2005年孔令曉等對河北省玉米小斑病菌生理小種進(jìn)行了鑒定，研究表明玉米小斑病菌存在T、C、O 3個生理小種和S型菌株，其中O小種為優(yōu)勢小種5。ITS區(qū)域?yàn)楹颂求wrDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，該區(qū)域的DNA序列在不同種間存有大量的變異，為研究真菌屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供了大量遺傳信息，目前被廣泛應(yīng)用于種內(nèi)單元分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究6。賀字典等采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類和ITS序列比對的方法,研究蔬菜保護(hù)地土壤中木霉

9、菌種群分布和遺傳多樣性7。王巖等運(yùn)用ITS對河南周口地區(qū)月季白粉菌進(jìn)行了鑒定與進(jìn)化分析，結(jié)果表明周口地區(qū)月季白粉菌與來自比利時、日本、法國、阿曼、匈牙利和英國等不同國家的月季白粉菌聚為同一進(jìn)化枝，而與來自同屬的覆盆子白粉菌、醋栗白粉菌和夾竹桃白粉菌的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)8。至今國內(nèi)尚未見關(guān)于玉米小斑病菌遺傳進(jìn)化分析的相關(guān)報道。 目前玉米小斑病的防治方法主要為化學(xué)防治和選育抗性品種9?；瘜W(xué)防治雖然防效高但是由于成株期植株高大、田間郁閉，操作難度大、噴霧效果低，利用本地區(qū)優(yōu)勢生理小種和強(qiáng)致病力菌株選育高抗、高產(chǎn)玉米雜交種具有對環(huán)境危害小、防效高、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。因此，有必要對玉米小斑病菌進(jìn)行生理小種監(jiān)

10、測、致病性測定及遺傳進(jìn)化分析。以期為抗病品種選育和有效防治提供基礎(chǔ)。 1材料與方法1.1病原菌的采集與分離2007-2016年分別在河北冀中（衡水、滄州、保定），冀南（邯鄲、邢臺、石家莊）等地夏玉米種植區(qū)采集具有典型小斑病癥狀的病葉標(biāo)樣，采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離并單孢分離保存，分離得到356株玉米小斑病菌菌株。1.2供試玉米材料采用本單位保存擴(kuò)繁的C103為核背景的具有T、C、S不同細(xì)胞質(zhì)以及正常細(xì)胞質(zhì)N的玉米自交系作為小斑病生理小種鑒別寄主，菌株致病力測定采用雜交種鄭單958和自交系C103。1.3接種方法將從各地采集分離的玉米小斑病菌菌株接種在PDA平面培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)

11、5-7 d，接種前用加有少量吐溫20的滅菌水將病原菌的分生孢子洗下制成孢子濃度為1×104個/mL的菌懸液。將具有T、C、S、N不同細(xì)胞質(zhì)的鑒別寄主分別播種于直徑12 cm的花盆內(nèi)，每盆10粒種子，保苗8株。待玉米長到4-5葉期，葉面噴霧接種已經(jīng)配制好的菌懸液，20ml/盆，接種后于溫度28-30，相對濕度90%以上保濕培養(yǎng)24 h，7 d后調(diào)查發(fā)病程度，測量病斑大小，記載病斑類型，確定生理小種類型。1.4調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)玉米小斑病菌生理小種鑒定標(biāo)準(zhǔn)參見孔令曉等的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)5。 玉米小斑病菌優(yōu)勢小種致病力強(qiáng)度測定調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)0級：全株葉片無病斑；1級：全株葉片有少量病斑，占葉面積的5%以下；3級：

12、全株葉片有中量病斑，占葉面積的6%-10%；5級：全株葉片有多量病斑，占葉面積的11%-25%；7級：全株葉片有大量病斑，占葉面積的26%-50%；9級：全株葉片病斑面積占葉面積的50%以上。1.5 ITS 序列分析提取不同地區(qū)43個玉米小斑病菌的基因組DNA，菌株信息見表1，利用ITS特異性引物（F: 5-TGCAAAATATGTGCTGCGCT-3;R:5- CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3）擴(kuò)增目的基因。PCR的反應(yīng)體系為50 µL，其中模板DNA 2 µL，上下游引物各2 µL，PCR Master Mix 25 µL以及無菌水19

13、µL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94預(yù)變性3 min；94變性30 s，58退火30 s，72延伸45 s，35個循環(huán)；最后72延伸10 min。PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源性比較，利用MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）軟件構(gòu)建UPGMA樹（unweighted pair-group method with arithmetic means）分析進(jìn)化關(guān)系。表1.供試玉米小斑病菌株信息Tab.1 The strain messages of B. maydis采樣地點(diǎn)Sa

14、mpling Location簡稱 Abbreviation菌株號Number of strains河北石家莊SJZ4141、4085、4103、4047、4099、4098、4142、4045、4086、3086、4057、4083、4084河北滄州CZ4147、4148、4149、4150、4151、4138、4139、4140河北衡水HS4153、4154、4155、4156、4157、4158河北保定BD4143、4144、4145、4146河北邯鄲HD4067、4066、4032、3046、4104、3045、4106、4110河北邢臺XT4113、4112、4111、4116、41

15、15、41142 結(jié)果分析2.1 河北省玉米小斑病菌生理小種鑒定對2007-2016年從不同地區(qū)采集的356株玉米小斑病菌菌株進(jìn)行了生理小種鑒定，由（表2）可見從2007年到2016年玉米小斑病菌有T、C、O等3個生理小種和S型菌株出現(xiàn)，其中O小種的平均分離頻率為94.94%，是河北省玉米小斑病菌的優(yōu)勢小種，T小種、C小種、S型菌株分離頻率均為1.69%，與O小種的分離頻率存在顯著差異。此外，2007-2010年小斑病菌O小種的分離頻率為86.67%-93.88%，2011-2016年O小種的分離頻率為97.3%-100%，呈上升趨勢。表2 2007-2016年河北省玉米小斑病菌生理小種鑒定T

16、ab.2 Identification of the physiological races of B.maydis during 2007-2016年度Year菌株數(shù)No.ofstrainsT小種分離頻率（%）Isolation frequency of race TC小種分離頻率（%）Isolation frequency of race CS菌株分離頻率（%）Isolation frequency of type SO小種分離頻率（%）Isolation frequency of race O2007533.771.895.5688.682008185.560.005.5688.8920

17、09492.044.080.0093.882010454.444.434.4486.672011240.000.000.00100.02012370.002.700.0097.302013500.000.000.00100.002014190.000.000.00100.002015400.000.000.00100.002016210.000.000.00100.00合計(jì)/平均Total/Everage 3561.691.691.6994.942.2玉米小斑病菌優(yōu)勢小種致病力分析在主栽品種鄭單958和自交系C103上接種測定玉米小斑病菌優(yōu)勢小種致病力強(qiáng)度，由（表3）可以看出從2012-201

18、6年，O小種在鄭單958上平均病級由3.22級降低到1.19級，平均病指由35.81降低到13.10；在自交系C103上平均病級由3.33級降低到2.62級，平均病指由37.01降低到28.88。同時致病力測定結(jié)果還表明，各年度小斑病菌O小種對自交系C103的致病力比雜交種鄭單958強(qiáng)。雖然，O小種對鄭單958和C103均表現(xiàn)為致病力逐年降低，但在自交系C103上致病力下降幅度小于鄭單958，2016年O小種在鄭單958上的平均病級和病指較2012年均降低了60.04%和63.42%；在C103上降低了21.32%和21.44%。表3 玉米小斑病菌O小種的致病力變異Tab.3 The path

19、ogenicity differentiation of Race O of Bipolaris maydis年度Year菌株數(shù)No.ofstrain鄭單958C103平均病級Average of disease level病情指數(shù)Disease index平均病級Average of disease level病情指數(shù)Disease index2012363.22 35.81 a3.33 37.01 a 2014191.95 21.69 b 2.79 29.74 b 2015401.85 20.55 b 2.70 29.23 b 2016211.19 13.10 c 2.62 28.88 b

20、 降低百分率Decreace percentage %63.0463.4221.3221.972.3 ITS序列分析 選取河北省6個地區(qū)共計(jì)45株玉米小斑病菌菌株，提取菌株的基因組DNA，用ITS特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約為392 bp大小的條帶，將條帶回收并進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過MEGA5.0軟件建立UPGMA樹。500 bp250 bp1000 bp100 bp750 bpM 1 2 3 4 5 6 7 8圖1 玉米小斑病菌ITS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；17：玉米小斑病菌菌株ITS基因；8：陰性對照Fig. Electrophorogram of PCR products

21、 of the gene from B.maydisM：DNA marker；17：gene ITS of B.maydis；8：negative control從構(gòu)建的UPGMA樹可以看出45株小斑病菌株主要形成了兩個大支，第一支的8個菌株均采自石家莊地區(qū)；第二支的37個菌株又分為4個小支，其中1個小支主要以冀中地區(qū)菌株為主5個采自滄州、2個采自保定、1個采自衡水，其余3個小支均為各個地區(qū)混合的菌株。結(jié)果分析表明河北省玉米小斑病病菌存在一定的地域分化。圖2 UPGMA進(jìn)化樹Fig. 2 The Neighbor-joining tree by UPGMA3. 結(jié)論與討論本研究對河北省2007

22、-2016年玉米小斑病菌生理小種進(jìn)行分析，結(jié)果表明河北省小斑病的生理小種主要有T、C、O 3種和一種生理型S型，其中O小種的分離頻率高達(dá)94.94%，為河北省玉米小斑病菌的優(yōu)勢小種。這一結(jié)論與孔令曉等人的研究結(jié)論一致5。但早期1987-2003年研究中河北省優(yōu)勢小種O小種的分離頻率為79.7%，T小種、C小種和S型菌株平均分離頻率分別為10%、5.1%、5.3%，本研究中O小種分離頻率為94.94%，較之前分離頻率提高了15.2%，T小種、C小種和S型菌株平均分離頻率為1.69%，較之前分別下降了8.31%、3.41%、3.61%。與之前結(jié)果相比，近十年O小種仍為河北省的優(yōu)勢小種，但分離頻率增

23、高。分析這種現(xiàn)象的原因可能為：一方面與各地種植玉米的品種差異有關(guān)，由于某細(xì)胞質(zhì)類型的玉米種質(zhì)在長期種植，可能會導(dǎo)致玉米小斑病菌對某一種細(xì)胞質(zhì)有?；缘纳硇》N出現(xiàn)頻率上升10-12；另一方面可能與各地的氣候條件有關(guān)系，不同的氣候條件對玉米小斑病菌寄生適合度有影響，某個小種對當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境條件適合度較高，其出現(xiàn)頻率就可能高，對當(dāng)?shù)貧夂驐l件適合度較低的生理小種，其出現(xiàn)頻率就可能降低12。本研究測定了O小種對主栽品種鄭單958及自交系C103的致病力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病力強(qiáng)度均呈下降趨勢。出現(xiàn)這方面的原因可能為大面積主推玉米品種本身對小斑病抗病性較高，田間病害發(fā)生較輕，小斑病菌強(qiáng)致病力菌株分離頻率降低，弱致病

24、菌株分離頻率升高。而且病原菌致病力會隨著氣候、種植結(jié)構(gòu)、栽培制度、品種抗性等原因都有可能引起病原菌致病力變化，為了避免玉米小斑病再度發(fā)生流行的潛在危險，仍需要加強(qiáng)對玉米小斑病生理小種及其致病力的監(jiān)測，更不能忽視玉米小斑病的防治和抗病育種研究13。 本研究對河北省不同地區(qū)的45株玉米小斑病菌進(jìn)行了ITS基因遺傳進(jìn)化分析，45個菌株共分為兩大支。第一大支的8個菌株均采自石家莊，占石家莊總菌株的72.7%。第二大支其中的1個小支以冀中地區(qū)菌株為主，其他支為多地混合菌株，可見玉米小斑病菌的遺傳進(jìn)化與地域也是有一定關(guān)系的。但分析的45個菌株進(jìn)化差異并不大，這可能與我們采集地域范圍相對較集中有關(guān)。所以在今后工作中應(yīng)該加大菌株的采集范圍并對其進(jìn)行分析，同時同一地區(qū)不同年度小斑病菌是否存在遺傳變異以及變異速度如何，也需要長期監(jiān)測。參考文獻(xiàn)：1張立新, 董猛, 楊麗敏,等. 安徽省玉米小斑病菌生理小種鑒定及對烯唑醇的敏感性J. 植物病理學(xué)報, 2011, 41(4):441-444.2Smith D R, Hooker A L, Lim S M. Physiologic races of Helminthosporium maydis.J. Plant Disease Reporter, 1970:819-822.3Hooker A L, Smith D R, Lim S M,