川芎嗪對(duì)結(jié)扎犬LAD損傷冠脈內(nèi)皮及心肌的保護(hù)作用

1、川芎嗪對(duì)結(jié)扎犬LAD損傷冠脈內(nèi)皮及心肌的保護(hù)作用作者：何維來(lái)，陳如坤，周汝元 【關(guān)鍵詞】 心肌保護(hù)Protective effect of tetramethlpyrazine on coronary artery endothelium and cardiac muscle after LAD ligation 【Abstract】 AIM: To explore the protective effect of tetramethlpyrazine on the endothelium and cardiac muscle after acute infarction induced in

2、 dogs by ligating the left anterior descending coronary artery (LAD). METHODS: Fortyfive aged healthy crossbred dogs (157) kg were divided into 3 groups: tetramethlpyrazine (TMP) group, verapamil (Ver) group and control group. The operation was performed to ligate the near part of the LAD through le

3、ft minimal thoracic incision to block 75% of the blood flow respectively. The expression changes of endothelium derived factors NO, ET1, sPselectin and CTnT before ligation and at different time points after ligation were detected and Pselectin gene of cardiac muscle was determined by Western blotti

4、ng. RESULTS: The difference was significant among the 3 groups at different time points after ligating LAD (P0.01). The expression of Pselectin of cardiac muscle was highly upregulated after ligation in Ver group and control group. CONCLUSION: Tetramethlpyrazine can effectively restrain the injury o

5、f ischemia and reperfusion on endothelium of coronary artery and myocardial cells after ligating LAD and mitigate the stenosis of coronary artery and myocardial infarction, thus preventing the restenosis of coronary artery after coronary artery bypass graft. 【Keywords】 endothlial cells; myocardial p

6、rotection; ligustrazine; coronary stenosis 【摘要】 目的：探討川芎嗪對(duì)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）損傷冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮及心肌的保護(hù)作用. 方法：將45只犬分為川芎嗪（TMP），維拉帕米（Ver）和對(duì)照組（Control ）3組，結(jié)扎LAD阻斷血流75%，分別測(cè)定3組結(jié)扎前及結(jié)扎后不同時(shí)段的分泌型P選擇素（sPselectin）、內(nèi)皮素1（ET1）、一氧化氮（NO）及心肌肌鈣蛋白T（CTnT）的含量變化，Western blotting法檢測(cè)心肌組織Pselecntin基因表達(dá)情況. 結(jié)果：3組結(jié)扎后NO，ET1，sPselectin及CTnT的在不同時(shí)段

7、含量變化組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）， Pselectin基因表達(dá)TMP組較低，Ver組和Control組有顯著表達(dá). 結(jié)論：川芎嗪可有效抑制結(jié)扎LAD后缺血再灌注對(duì)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞及心肌的損傷，減輕冠狀動(dòng)脈狹窄和心肌梗死的程度. 【關(guān)鍵詞】 內(nèi)皮細(xì)胞； 心肌保護(hù)； 川芎嗪； 冠狀動(dòng)脈狹窄 0引言 內(nèi)皮細(xì)胞損傷是引起冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后（coronary artery bypass graft, CABG）血管橋再狹窄的關(guān)鍵原因，CABG術(shù)內(nèi)皮細(xì)胞和心肌保護(hù)一直沒(méi)有顯著突破1. 我們采用結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior decending coronary artery, LAD

8、)方法，造成典型的局部冠狀動(dòng)脈狹窄和心梗模型，應(yīng)用川芎嗪（ligustrazine or tetramethlpyrazine，TMP），與維拉帕米（Verapamil,Ver）及空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，分析TMP對(duì)在體復(fù)雜生理狀態(tài)下內(nèi)皮和心肌損傷的抑制作用，探討其對(duì)冠狀動(dòng)脈狹窄的可能防治作用. 1材料和方法 1.1材料 TMP純度：99%，無(wú)錫第七制藥有限公司；Ver，上海禾豐制藥有限公司. 放免法測(cè)定內(nèi)皮活性因子ET1試劑盒及硝酸還原酶法間接測(cè)定NO試劑盒由北京北免東雅生物技術(shù)研究所提供，分泌型P選擇素(sPselectin)檢測(cè)試劑盒及Western blotting試劑購(gòu)自于Sigma C

9、hemical Co.，快速一步法檢測(cè)肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,CTnT)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Boehringer Mannheim公司；Viridia M3多功能監(jiān)護(hù)儀（德國(guó)產(chǎn)）,CYAM32麻醉呼吸機(jī)，放免檢測(cè)儀，ACUSON128XP/10彩色多普勒電腦顯像儀（美國(guó)產(chǎn)，探頭頻率2.54.0 MHz）. 1.2方法 健康雜種犬45只，體質(zhì)量（14.86.7）kg, 雌雄不限,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分成3組，TMP組、Ver組和Control組（空白對(duì)照組），每組各15只. 首次用3 g/L戊巴比妥鈉30 mg/kg iv初步麻醉動(dòng)物后，氣管插管接CYAM32

10、麻醉呼吸機(jī)予機(jī)械通氣，給予室內(nèi)空氣混合氧及氟烷； Viridia M3多功能監(jiān)護(hù)儀連續(xù)監(jiān)測(cè)心電圖、直接動(dòng)脈壓、中心靜脈壓，左側(cè)第4肋間小切口進(jìn)胸，打開(kāi)心包，找到LAD，于LAD近端發(fā)出處約0.5 cm，用換瓣線帶針穿過(guò)前降支深面，備結(jié)扎阻斷；將ACUSON128XP/10彩色多普勒超聲的消毒探頭(2.54.0 MHz)直接置于備結(jié)扎處遠(yuǎn)斷冠狀動(dòng)脈外心表，測(cè)量動(dòng)脈的每分血流量2. 根據(jù)血流量測(cè)定阻斷75%并打結(jié)固定. 分別于阻斷前及阻斷后5, 15, 30, 45和60 min經(jīng)右心耳處抽血6 mL，備測(cè)NO, ET1水平，于阻斷前及阻斷后3和6 h分別自靜脈置管抽血2 mL備測(cè)CTnT含量，及

11、于阻斷前及阻斷后30 min，2，6，12和24 h備測(cè)Pselectin含量. 于結(jié)扎后2和12 h切取結(jié)扎后局部供血區(qū)心肌檢測(cè)心肌組織Pselectin基因表達(dá)，并于結(jié)扎前切取正常心肌作為對(duì)比. TPM組于結(jié)扎前20 min用10 mg/kg TMP注射液iv，手術(shù)后3 d連續(xù)注射TMP注射液10 mg/(kgd)；Ver組于結(jié)扎前5 min用0.5 mg/kg Ver加入生理鹽水溶液中iv，手術(shù)后3 d同樣連續(xù)注射Ver 0.5 mg/(kgd)；Control組采用0.9 g/L生理鹽水20 mL iv. 嚴(yán)格按各試劑盒說(shuō)明書處理保存的被測(cè)樣品，按要求采用放免法測(cè)定ET1含量，硝酸還原

12、酶法測(cè)定NO-2/NO-3水平，并計(jì)算出NO的含量，快速一步法檢測(cè)CTnT含量，雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA法）測(cè)定sPselectin含量. 低溫下提取心肌組織勻漿，緩沖劑(50 mmol/L Tris, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 g/L三硝基甲苯X100, 10 g/L苯基烷硫酰氟化物, 1 g/L亮肽素, 1 g/L抑肽酶)處理，孵育10 min， 組織勻漿離心(3000 r/min, 5 min, 4)，上清液于280貯存，樣品(每格100 mg蛋白，bihionic acid assay)， 加入十二烷基鈉硫酸聚丙

13、烯纖胺凝膠中電泳(50 g/L堆膠, 75 g/L分離膠)， 將印跡從明膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，封閉后, 印跡加兔多克隆抗體孵育2 h，(15000) 抗縮氨酸對(duì)應(yīng)于25羧基端，Pselectin氨基酸(31)， 羊抗兔抗體與辣根過(guò)氧化酶共扼，加二抗，最后沖洗印跡，用ECL 化學(xué)熒光底物浸染，Xray膠片放射自顯影觀察.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 計(jì)量資料均以xs表示，應(yīng)用SAS軟件，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，以分析組間和組內(nèi)差異顯著性.2結(jié)果 2.1內(nèi)皮活性因子含量的變化TPM組在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后血漿NO和ET1檢測(cè)含量變化與Ver及Control組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01

14、), 測(cè)量時(shí)段間及測(cè)量時(shí)段與組別間交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01，F(xiàn)ig 1, 2). 2.2心肌及血漿sPselectin變化結(jié)扎LAD后心肌Pselectin基因表達(dá)情況見(jiàn)Fig 3. TPM組在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后各時(shí)段血漿sPselectin含量變化與Ver及Control組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01), 測(cè)量時(shí)段間及測(cè)量時(shí)段與組別間交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01，F(xiàn)ig 4). 2.3CTnT檢測(cè)含量變化TPM組在結(jié)扎LAD后各時(shí)段檢測(cè)含量變化與Ver及Control組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01), 測(cè)量時(shí)段間及測(cè)量時(shí)段與組

15、別間交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01，F(xiàn)ig 5). 3討論 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TMP可顯著增加冠狀動(dòng)脈內(nèi)NO含量，抑制ET1生成，與Ver組及Control組間差異有顯著性，反映其對(duì)ET1表達(dá)具有有效的調(diào)控作用. TMP上調(diào)NO/ET1引起其他多種內(nèi)皮因子的表達(dá)變化和一系列連鎖改變， NO/ET1上調(diào)對(duì)減輕血管內(nèi)膜增生和心肌損傷有重要作用. NO增加激活GC使cGMP增加，或直接作用于K 通道，如大電導(dǎo)的鈣激的鉀通道（BKca）而發(fā)揮強(qiáng)大的血管擴(kuò)張作用3. ET1表達(dá)增加并與特異受體結(jié)合抑制冠狀動(dòng)脈收縮及減輕末端分支血管阻力， 并通過(guò)抑制ET1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中的cmyc等原癌基因激活作用及

16、對(duì)抑癌基因p53表達(dá)的抑制作用，而抑制平滑肌細(xì)胞增生和遷移，及成纖維細(xì)胞合成膠原，減輕內(nèi)膜增厚4.我們發(fā)現(xiàn)TMP可以顯著抑制血漿中sPselectin增加，顯著抑制心肌組織Pselectin基因表達(dá)，表明其對(duì)缺血再灌注損傷過(guò)程炎癥的強(qiáng)烈抑制作用. Pselectin表達(dá)和細(xì)胞間釋放對(duì)白細(xì)胞進(jìn)入損傷組織起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平反映炎癥激活程度5. 另外，TMP抑制血小板產(chǎn)生血小板源性Pselectin，可以減輕缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)和血栓形成，進(jìn)而抑制炎癥和細(xì)胞毒損傷對(duì)亞細(xì)胞致死性損傷連鎖反應(yīng)的放大作用，減少炎癥引起的心臟功能衰竭的發(fā)生6. 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后TPM組CTnT含量升高受到顯著

17、抑制，表明TMP可以減輕心肌梗死程度. 心肌中存在CTn，是高特異性和敏感性mAb檢測(cè)指標(biāo)，強(qiáng)調(diào)CTn作用及作為心肌缺血壞死指標(biāo)目前已被廣泛推崇7. CTn包括T,I,C，CTn聯(lián)結(jié)原肌球蛋白，共同構(gòu)成橫紋肌的主要收縮單位，結(jié)扎LAD后造成局部心肌缺血，TMP通過(guò)其內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用使冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、微循環(huán)速度和血管開(kāi)放數(shù)目增加，另外通過(guò)改變微血管內(nèi)的血液流變學(xué)狀態(tài)，而增加單位面積內(nèi)開(kāi)放的毛細(xì)血管數(shù)，以及抑制炎癥作用和抑制自由基介導(dǎo)的組織損害作用，而縮小心肌梗死范圍、減輕病變程度，具有顯著的心肌保護(hù)作用. 我們認(rèn)為TMP可以抑制結(jié)扎LAD導(dǎo)致的對(duì)局部動(dòng)脈內(nèi)皮及供血區(qū)心肌損傷，增加來(lái)自回旋支、對(duì)角支

18、動(dòng)脈以及右冠動(dòng)脈遠(yuǎn)段分支部分側(cè)枝循環(huán)擴(kuò)張對(duì)缺血部位的再灌注，并減輕再灌注損傷，對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮及心肌有顯著的保護(hù)作用. 通過(guò)其對(duì)內(nèi)皮表達(dá)功能的調(diào)控作用，TMP可有效防治冠狀動(dòng)脈狹窄及減輕心肌梗死程度，可能具有防治CABG術(shù)后血管橋再狹窄的作用. 【參考文獻(xiàn)】 1 Herlitz J. Secondary prevention after coronary artery bypass graftingwhat do we know?J. Scand Cardiovasc J, 2004； 38(2):69-74. 2 Krzanowski M, Bodzor W, Brzostek T, et a

19、l. Value of transthoracic echocardiography for the detection of highgrade coronary artery stenosis: Prospective evaluation in 50 consecutive patients scheduled for coronary angiographyJ. J Am Soc Echocardiogr, 2000； 13(12):1091-1099. 3 Chin AS, Goldman LE, Eisenberg MJ. Functional testing after coronary artery bypass graft surgery: A metaanalysisJ. Can J Cardiol, 2003；19(7):802-808. 4 Bousette N, Giaid A. Endothelin1 in atherosclerosis and other vasculopathiesJ. Ca