細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、計數(shù)

1、一、細(xì)胞冷凍保存1. 材料:生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、 DMSO(Sigma D-2650、 無菌塑料冷凍保存管 (Nalgene5000-0020 、 0.4%(w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061、血球計數(shù)盤與蓋玻片、等 速降溫機 (KRYO10SeriesII2、冷凍保存方法:(1傳統(tǒng)方法 : 冷存管置于 4 10分鐘 ->-20 30分鐘 ->-80 1618小時 (或隔夜 ->液氮槽 vaporphase 長期儲 存。-20不可超過 1小時, 以防止胞內(nèi)冰晶過大, 造成細(xì)胞大量 死亡, 亦可跳過此步驟直接放入 -80冰箱中, 惟存

2、活率稍微 降低一些。(2程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機以 -1-3 /分鐘之速度由室溫降至(-80以下 -120,再放在液氮槽 vaporphase 長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與 hybridoma 之保 存。3、步驟:(1 冷凍前 24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基, 使細(xì)胞處于 指數(shù)生長期。(2配制冷凍保存溶液 (使用前配制 :另取一離心管,加入 培養(yǎng)基、血清,逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO 至 20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。(3離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞,用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞, 取少量細(xì)胞懸浮液 (約 0.1ml 計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。 (4取與細(xì)胞懸液等量的凍

3、存液,緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液, 并晃動試管,制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO 最后濃度為 5 10% ,使細(xì)胞濃度為 15×106cells/ml,混合均勻,分裝于 已標(biāo)示完全之冷凍保存管中, 12ml/vial,并取少量細(xì)胞懸 浮液作污染檢測。 嚴(yán)密封口后, 注明細(xì)胞名稱、 代數(shù)、 日期。 然后進行凍存。4、注意事項:(1欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好 (logphase且存活率高 之狀態(tài), 約為 8090%致密度。 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有 其特有性質(zhì),例如 hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試 是否有抗體之產(chǎn)生。(2細(xì)胞在液氮中可長期凍存無限時間,而不會影響細(xì)胞 活力;在 -7

4、0度可保存數(shù)月。(3注意冷凍保護劑之品質(zhì)。 DMSO 應(yīng)為試劑級等級,無 菌且無色 (以 0.22micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買 無菌產(chǎn)品,如 Sigma D-2650,以 510ml 小體積分裝, 4 避光保存,勿作多次解凍。 Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級,以 高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲 存后對細(xì)胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO 直接加入時釋放的熱量對細(xì)胞的損傷。 緩慢逐滴加入 細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲,可降低細(xì)胞受損。 DMSO 可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化,可換用 10%甘油凍存。 (4冷凍保存之細(xì)胞濃度

5、: normal human fibroblast:13×106cells/ml hybridoma:13×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些 hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍 24小時后死去。 adherent tumor lines:57×106, 依 細(xì) 胞 種 類 而 異 。 Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,而 HeLa 只需 1 3×106cells/ml other suspensions:510×106cells/ml, human lymphocyte須 至少 5×106cel

6、ls/ml。(5冷凍保護劑濃度為 5或 10%DMSO ,若是不確定細(xì)胞 之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應(yīng)作一個 backup culture ,以防止冷凍失敗。(6 凍存可用 10%90%的血清, 一般高濃度血清有助于維 護細(xì)胞活力,此處介紹 20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積 (4度時 , 復(fù)蘇存活率在 80%90%以上, 對原代培養(yǎng)細(xì)胞, 以 90%血清凍存更為有效。二、冷凍細(xì)胞活化1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶 而對細(xì)胞造成傷害,導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。2、細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長 或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常 (例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白 質(zhì) 。

7、3、材料37恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管 /離心管 /培養(yǎng)瓶、液 氮或干冰容器4、步驟:(1操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂 之傷害。(2自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊, 由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。(3將新鮮培養(yǎng)基置于 37水槽中回溫,回溫后噴以 70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。(4取出冷凍管,立即放入 37水槽中快速解凍,輕搖冷 凍管使其在 1分鐘內(nèi)全部融化, 以 70%酒精擦拭保存管外部, 移入無菌操作臺內(nèi)。(5取出解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容 器內(nèi) (稀釋比例為 1:101:15,混合均勻,放入 CO2培養(yǎng)箱 培養(yǎng)。取 0.1m

8、l 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。(6解凍后是否立即去除冷凍保護劑 (例如 DMSO 或 glycerol ,依細(xì)胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去 除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍之細(xì)胞懸浮液加 入含有 5-10ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心 1000rpm , 5分鐘, 移去上清液, 加入新鮮培養(yǎng)基, 混合均勻, 放入 CO2培養(yǎng)箱 培養(yǎng)。(7若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更 換培養(yǎng)基。三、細(xì)胞計數(shù)與存活測試 1、原理： （1）計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是 Coultercounter 粒子 計數(shù)器自動計數(shù)。 （2）血球計數(shù)盤一般有二個 chambers，每個 cham

9、ber 中細(xì) 刻 9 個 1mm2 大正方形，其中 4 個角落之正方形再細(xì)刻 16 個小格，深度均為 0.1mm。當(dāng) chamber 上方蓋上蓋玻片后， 每個大正方形之體積為 1mm2× 0.1mm=1.0x10-4ml。使用時， 計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以 104，即為每 ml 中之細(xì)胞數(shù)目。 （3）存活測試之步驟為 dyeexclusion，利用染料會滲入死細(xì) 胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會 呈色。一般使用藍色之 trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收 trypan blue，則用紅色之 Erythrosin bluish。計

10、算細(xì)胞活率： 活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）× 100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭 染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細(xì)胞也開始攝取 染料；因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的 稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準(zhǔn)確。 2、材料： 0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061；Erythosin bluish stain；取 0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259及 0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647 溶 于 100mlCa+/Mg+freesaline ；

11、血 球 計 數(shù) 盤 及 蓋 玻 片 (Hemocytometerandcoverslip；計數(shù)器(counter；低倍倒立顯 微鏡； 粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics。 白細(xì)胞 稀釋液（4%乙酸溶液） 。 3、步驟： （1） 取 50l 細(xì)胞懸浮液與 50l trypan blue(orErythrosinbluish 等體積混合均勻于 1.5ml 小離心管中。 （2） 取少許混合液(約 15l自血球計數(shù)盤 chamber 上方凹槽 加入，蓋上蓋玻片，于 100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不 染色，死細(xì)胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bl

12、uish。 （3） 計數(shù)四個大方格之細(xì)胞總數(shù)， 再除 4， 乘以稀釋倍數(shù)(至 少乘以 2，因與 trypanblue 等體積混合，最后乘以 104，即 為每 ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計上 線與右線之細(xì)胞(或計下線與左線之細(xì)胞。 注：4 大格細(xì)胞總數(shù)× 稀釋倍數(shù)× 104/4=細(xì)胞數(shù)/ml；每一大格 的體積=0.1cm× 0.1cm× 0.01cm=10-4ml 計數(shù)板計數(shù)時， 最適濃度為 510× 105 細(xì)胞/ml， 此范圍外計 數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀 釋后計數(shù)。 5、范例： T75 monolayer culture 制成 10ml 細(xì)胞懸浮液，取 0.1ml 溶液 與 0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入 血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。 活細(xì)