儀器分析課件——4、高效液相色譜法

1、高效液相色譜法高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 1 概述概述2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀3 HPLC的分類及其分離原理的分類及其分離原理4 高效液相色譜分離的選擇高效液相色譜分離的選擇液相色譜儀液相色譜儀1 1 概述概述一、一、HPLC與與GC差別差別相同：相同：兼具分離和分析功能，基本概念理論一致兼具分離和分析功能，基本概念理論一致主要差別：主要差別：分析對象、流動相及操作條件的差別分析對象、流動相及操作條件的差別1分析對象分析對象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、分子量較小的樣品能氣化、熱穩(wěn)定性好、分子量較小的樣品，僅

2、能分析有機物的僅能分析有機物的20%20%。 HPLC：高沸點、難氣化、分子量大、熱穩(wěn)定性差高沸點、難氣化、分子量大、熱穩(wěn)定性差及具有生理活性和離子型的樣品及具有生理活性和離子型的樣品均可檢測，用途廣均可檢測，用途廣泛，占有機物的泛，占有機物的80%80%。2流動相差別流動相差別vGC：流動相為惰性氣體流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用 vHPLC：流動相為液體流動相為液體流動相與組分間有親合力，為提高柱的選擇性、流動相與組分間有親合力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了控制因素，改善分離度增加了控制因素，對分離起很大作用對分離起很

3、大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性、組成和流動相極性、組成和pHpH值的選擇也對分離起到重值的選擇也對分離起到重要作用要作用 3操作條件差別操作條件差別 GC：加溫操作加溫操作; ; HPLC：多室溫；高壓多室溫；高壓二、影響分離的因素與提高柱效的途徑二、影響分離的因素與提高柱效的途徑 在在HPLC中中, , 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項較小，可以忽略。一，則速率方程中的分子擴散項較小，可以忽略。 H = A + C uH = A + C u 故液相色譜故液相色譜H-uH-u曲線與氣相色譜的形狀不同，

4、如曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。圖所示。l 由速率方程，由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效降低固定相粒度可提高柱效。l 液體的粘度比氣體大一百倍，密度為氣體的一液體的粘度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。液。液相色譜中一般不通過增加柱溫來改善傳質(zhì)（溫度相色譜中一般不通過增加柱溫來改善傳質(zhì)（溫度影響不顯著）。影響不顯著）。恒溫恒溫l 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。因素。三、三、HPLCHPLC的特點：的特點：(1)(1)高壓：高壓：液體流過色譜柱時，所遇到的阻

5、力很大液體流過色譜柱時，所遇到的阻力很大（液體粘度大）（液體粘度大），為了使載液迅速通過色譜柱，為了使載液迅速通過色譜柱，必 須 對 載 液 施 加 高 壓 。必 須 對 載 液 施 加 高 壓 。 H P L CH P L C 工 作 壓 力 高 達(dá)工 作 壓 力 高 達(dá)20MPa30MPa20MPa30MPa。(2)(2)高速：高速：HPLCHPLC的分析時間較經(jīng)典的液相色譜所需的分析時間較經(jīng)典的液相色譜所需的時間要少得多，分離一個樣品只需幾分鐘至幾的時間要少得多，分離一個樣品只需幾分鐘至幾十分鐘，僅為經(jīng)典液相色譜的幾十分之一。十分鐘，僅為經(jīng)典液相色譜的幾十分之一。(3)(3)高效：高效：

6、一般一般GC的色譜柱是數(shù)千塔板米，的色譜柱是數(shù)千塔板米，HPLC的塔板數(shù)可達(dá)約的塔板數(shù)可達(dá)約3萬塔板萬塔板/米，使分離效率大米，使分離效率大大提高。大提高。(4)(4)高靈敏度：高靈敏度：紫外光度檢測器的檢測限可達(dá)紫外光度檢測器的檢測限可達(dá)10-9g，熒光檢測器可達(dá)熒光檢測器可達(dá)1011g 。 HPLCHPLC已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 HPL

7、CHPLC的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點。凡是能用點。凡是能用GCGC分析的樣品一般不用分析的樣品一般不用HPLCHPLC。五個部分：五個部分：高壓輸高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測系統(tǒng)、色譜柱、檢測系統(tǒng)、記錄儀。記錄儀。2 2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀一、高壓輸液系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng) 高壓輸液系統(tǒng)由貯液器、高壓泵、梯度洗提裝高壓輸液系統(tǒng)由貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置組成，核心部分是高壓泵。置組成，核心部分是高壓泵。1 1、貯液器及流動相、貯液器及流動相 高效液相色譜的流動相應(yīng)滿足如下要求：高效液相色譜的流動

8、相應(yīng)滿足如下要求： (1)(1)應(yīng)具有足夠的純度，一般選用色譜純試劑。應(yīng)具有足夠的純度，一般選用色譜純試劑。 (2)(2)流動相與固定液應(yīng)互不相溶。流動相與固定液應(yīng)互不相溶。 (3)(3)流動相對試樣各組分應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜芙舛?。流動相對試樣各組分應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜芙舛取?(4)(4)粘度小。粘度小。 (5)(5)檢測器對流動相不產(chǎn)生響應(yīng)檢測器對流動相不產(chǎn)生響應(yīng)。溶劑使用前要脫氣溶劑使用前要脫氣 因為色譜柱是帶壓操作的，而檢測器是在常因為色譜柱是帶壓操作的，而檢測器是在常壓下工作。若流動相中含有的空氣不除去，則流動壓下工作。若流動相中含有的空氣不除去，則流動相通過柱子時其中的氣泡受到壓力而壓縮，流出柱相通

9、過柱子時其中的氣泡受到壓力而壓縮，流出柱子后到檢測器時因常壓而將氣泡釋放出來，造成檢子后到檢測器時因常壓而將氣泡釋放出來，造成檢測器噪聲大，使基線不穩(wěn)，儀器不能正常工作。測器噪聲大，使基線不穩(wěn)，儀器不能正常工作。常用的脫氣方法有常用的脫氣方法有l(wèi)低壓脫氣法（電磁攪拌，水泵抽空，可同低壓脫氣法（電磁攪拌，水泵抽空，可同時加熱或向溶劑吹時加熱或向溶劑吹N N2 2）；）；l吹氦氣脫氣法（好）；吹氦氣脫氣法（好）；l超聲波脫氣法（不完全）；超聲波脫氣法（不完全）；l真空脫氣法（可能會改變流動相組成）。真空脫氣法（可能會改變流動相組成）。2、梯度洗提裝置、梯度洗提裝置 應(yīng)用梯度洗提，可以提高分離效果。

10、應(yīng)用梯度洗提，可以提高分離效果。 梯度洗提法：梯度洗提法：在分離的過程中，按一定的程序在分離的過程中，按一定的程序改變兩種或兩種以上不同極性的溶劑之間的比例，改變兩種或兩種以上不同極性的溶劑之間的比例，使流動相的成分和極性產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而改使流動相的成分和極性產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而改變復(fù)雜物質(zhì)中不同極性的組分的相對保留值，提變復(fù)雜物質(zhì)中不同極性的組分的相對保留值，提高分離效果，加快分析速度。高分離效果，加快分析速度。3 3、高壓泵、高壓泵 高效液相色譜儀的重要組成部分，應(yīng)具備如下性能高效液相色譜儀的重要組成部分，應(yīng)具備如下性能（1 1）有足夠的輸出壓力，使）有足夠的輸出壓力，使流動相能順利地

11、通過流動相能順利地通過顆粒很細(xì)的色譜柱，通常在顆粒很細(xì)的色譜柱，通常在14.7MPa14.7MPa44MPa44MPa之間；之間；（2 2）輸出流量恒定無脈動，其流量精度在）輸出流量恒定無脈動，其流量精度在1%1%2%2%之間；之間；（3 3）輸出流動相的流量范圍廣且流速可調(diào)，對分）輸出流動相的流量范圍廣且流速可調(diào)，對分析儀器，一般為析儀器，一般為3mL/min3mL/min；制備儀器為；制備儀器為101020mL/min20mL/min。（4 4）壓力平穩(wěn)，脈動小。）壓力平穩(wěn)，脈動小。 二、進(jìn)樣裝置二、進(jìn)樣裝置注射器進(jìn)樣注射器進(jìn)樣優(yōu)點：優(yōu)點：可任意改變進(jìn)樣體積，可任意改變進(jìn)樣體積，快速，不易

12、造成峰擴張快速，不易造成峰擴張缺點：缺點：重現(xiàn)性較差，試液容易滲漏重現(xiàn)性較差，試液容易滲漏閥進(jìn)樣閥進(jìn)樣( (六通閥六通閥) )由閥芯、閥體、定量管組成。由閥芯、閥體、定量管組成。優(yōu)點：優(yōu)點：耐高壓，重復(fù)性好、易于自動化耐高壓，重復(fù)性好、易于自動化缺點：缺點：易造成峰擴張易造成峰擴張自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器三、色譜柱三、色譜柱標(biāo)準(zhǔn)柱型：內(nèi)徑為標(biāo)準(zhǔn)柱型：內(nèi)徑為4.6mm或或3.9mm，長為，長為15cm30cm的的直形不銹鋼柱直形不銹鋼柱。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。四、檢測器四、檢測器 應(yīng)具有：應(yīng)具有：靈敏度高、噪音低、響應(yīng)快、線性范靈敏度高、噪音

13、低、響應(yīng)快、線性范圍寬、定量準(zhǔn)確、適應(yīng)范圍廣等特點，同時還應(yīng)圍寬、定量準(zhǔn)確、適應(yīng)范圍廣等特點，同時還應(yīng)該對溫度和載液流速的變化不敏感。該對溫度和載液流速的變化不敏感。v可用的檢測器有：紫外、折光、電導(dǎo)、熒光等可用的檢測器有：紫外、折光、電導(dǎo)、熒光等v常用的檢測器有：紫外常用的檢測器有：紫外-可見光度檢測器和差示可見光度檢測器和差示折光檢測器折光檢測器缺點：缺點：不能用于對紫不能用于對紫外外-可見光完全不吸收可見光完全不吸收的試樣的檢測，也不的試樣的檢測，也不能使用對紫外光不透能使用對紫外光不透過的溶劑。過的溶劑。1、紫外、紫外-可見光度檢測器可見光度檢測器l一種小型的裝有流動池的雙光束光度計一

14、種小型的裝有流動池的雙光束光度計l靈敏度很高，檢測限可達(dá)靈敏度很高，檢測限可達(dá)10-9gmL-1優(yōu)點：優(yōu)點：對溫度和流速不敏感，適宜于梯度洗提。對溫度和流速不敏感，適宜于梯度洗提。2 2、差示折光檢測器、差示折光檢測器 通過連續(xù)測定參比池和樣品池中流動相之間的通過連續(xù)測定參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比優(yōu)點：優(yōu)點：凡與流動相折射率不同的組分，都可以用凡與流動相折射率不同的組分，都可以用差示折光檢測器來檢測，所以差示折光檢測器是差示折光檢測器來檢測，所以差示折光檢測器是一種一種通用型檢測器通用型檢測器。差示折光檢測器的靈敏度可。差示折光檢測

15、器的靈敏度可達(dá)達(dá)1010-7-7g gmLmL-1-1。缺點：缺點：對溫度和流速的波動很敏感；不能用于梯對溫度和流速的波動很敏感；不能用于梯度洗提。度洗提。3、熒光檢測器、熒光檢測器l高靈敏度、高選擇性；高靈敏度、高選擇性；l對多環(huán)芳烴，維生素對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。響應(yīng)。4、光電二極管陣列檢測器、光電二極管陣列檢測器l紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展；l1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示

16、。機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。五、記錄儀五、記錄儀 計算機，峰面積的積分、分析結(jié)果的計算、計算機，峰面積的積分、分析結(jié)果的計算、誤差的分析或色譜圖的輸出記錄的信號進(jìn)行程序誤差的分析或色譜圖的輸出記錄的信號進(jìn)行程序化、自動化處理?；?、自動化處理。q液液- -固色譜法固色譜法q液液- -液色譜法液色譜法q離子交換色譜法離子交換色譜法q凝膠色譜法凝膠色譜法3 HPLC3 HPLC的分類及其分離原理的分類及其分離原理一、液一、液-固色譜法（液固色譜法（液-固吸附色譜法）固吸附色譜法） 固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質(zhì)在固定相固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。

17、上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。1、液、液-固色譜法的吸附劑和流動相固色譜法的吸附劑和流動相 常用吸附劑：常用吸附劑：薄膜型硅膠、薄膜型硅膠、全多孔型硅膠全多孔型硅膠、薄、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。等。 一般規(guī)律：一般規(guī)律：對于固定相而言，非極性分子與極對于固定相而言，非極性分子與極性吸附劑性吸附劑(如硅膠、氧化鋁如硅膠、氧化鋁)之間的作用力很弱，分之間的作用力很弱，分配比較小，保留時間較短；但極性分子與極性吸配比較小，保留時間較短；但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強，分配比大，保留時間長。附劑之間的作用力很強，分配比大，保留時

18、間長。 常用的流動相：常用的流動相：甲醇、乙酸乙酯、乙醚、苯、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、苯、正己烷等。正己烷等。 在液在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是：固色譜中，選擇流動相的基本原則是： 極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。則用低極性流動相。2 2、液、液- -固色譜法的應(yīng)用固色譜法的應(yīng)用 常用于分離極性不同的化合物、含有不同官能常用于分離極性不同的化合物、含有不同官能團的化合物以及異構(gòu)體。團的化合物以及異構(gòu)體。 不宜用于分離同系物不宜用于分離同系物（因為液（因為液- -固色譜對不同固色譜對不同相對分子質(zhì)量的同系物選擇性不高）；相

19、對分子質(zhì)量的同系物選擇性不高）；峰易拖尾峰易拖尾二、液二、液- -液色譜法（液液色譜法（液- -液分配色譜法）液分配色譜法） 將固定液涂漬在擔(dān)體上作為固定相。將固定液涂漬在擔(dān)體上作為固定相。1 1、液、液- -液色譜法的作用機制液色譜法的作用機制 溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時，在固定液中溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時，在固定液中溶解度溶解度較小的組分較難進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷較小的組分較難進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較快；反之，在色譜柱中向前遷移速度較移速度較快；反之，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。慢，從而達(dá)到分離的目的。2 2、正相色譜和反相色譜、正相色譜和反相色譜正相分配色

20、譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑正相分配色譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑( (如苯、正己烷等如苯、正己烷等) )作流動相作流動相反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑( (如水、甲醇、乙腈等如水、甲醇、乙腈等) )作流動相作流動相一般地，一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動相的正相色譜是固定液的極性大于流動相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，性。正相色譜適宜于分離極性化合物，極性強的組極性強的組分，保留值分，保留值？反相色譜則適宜于分離非極性或弱極反相色譜

21、則適宜于分離非極性或弱極性化合物，性化合物，極性弱的組分，保留值極性弱的組分，保留值？l常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)3 3、液、液- -液色譜法的固定相液色譜法的固定相 常用的固定液：常用的固定液：如極性的如極性的，氧二丙腈氧二丙腈（ODPNODPN），非極性的十八烷（），非極性的十八烷

22、（ODSODS）和異二十烷）和異二十烷（SQSQ）等。）等。 缺點：缺點：涂漬的固定液易被流動相沖掉。采用涂漬的固定液易被流動相沖掉。采用化化學(xué)鍵合固定相學(xué)鍵合固定相則可以避免上述缺點。使固定液與則可以避免上述缺點。使固定液與擔(dān)體之間形成化學(xué)鍵，例如在硅膠表面利用硅烷擔(dān)體之間形成化學(xué)鍵，例如在硅膠表面利用硅烷化反應(yīng)：化反應(yīng)：形成形成SiSiO OSiSiC C型鍵，把固定液的分子結(jié)合到型鍵，把固定液的分子結(jié)合到擔(dān)體表面上擔(dān)體表面上有機氯硅烷有機氯硅烷優(yōu)點：優(yōu)點：v化學(xué)鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質(zhì)速度快，化學(xué)鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質(zhì)速度快，無固定液的流失，壽命長。無固定液的流失，壽命長。

23、v固定液上可以結(jié)合不同的官能團，選擇性好。固定液上可以結(jié)合不同的官能團，選擇性好。v固定液不會溶于流動相，有利于梯度洗提。固定液不會溶于流動相，有利于梯度洗提。4 4、液、液- -液色譜法的應(yīng)用液色譜法的應(yīng)用 液液- -液色譜法既能分離極性化合物，又能分離非極液色譜法既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物性化合物，如烷烴、烯烴、芳烴、稠環(huán)、染料、甾，如烷烴、烯烴、芳烴、稠環(huán)、染料、甾族等化合物?；衔镏腥〈臄?shù)目或性質(zhì)不同，族等化合物?；衔镏腥〈臄?shù)目或性質(zhì)不同，或化合物的相對分子質(zhì)量不同，均可以用液或化合物的相對分子質(zhì)量不同，均可以用液- -液色譜液色譜進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。適合同系物

24、的分離，如氨基酸。適合同系物的分離，如氨基酸。三、離子交換色譜法三、離子交換色譜法原理：原理：離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可離離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進(jìn)行解的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進(jìn)行可逆交換，由于可逆交換，由于被測離子在交換劑上具有不同的親被測離子在交換劑上具有不同的親和力而被分離和力而被分離。1 1、離子交換色譜法的作用機制、離子交換色譜法的作用機制聚合物分子骨架上連接著活性基團，如聚合物分子骨架上連接著活性基團，如SOSO3 3，N(CHN(CH3 3) )3 3+ +等。等。為保持樹脂的電中性，活性基團上帶有電荷

25、數(shù)為保持樹脂的電中性，活性基團上帶有電荷數(shù)相同但正、負(fù)號相反的離子相同但正、負(fù)號相反的離子X X，稱為反離子。，稱為反離子。 活性基團上的反離子可以與流動相中具有相同活性基團上的反離子可以與流動相中具有相同電荷的被測離子發(fā)生交換：電荷的被測離子發(fā)生交換：33RSO XMRSO MX 2 2、固定相、固定相 兩種類型：多孔性樹脂與薄殼型樹脂兩種類型：多孔性樹脂與薄殼型樹脂多孔性樹脂：多孔性樹脂：極小的球型離子交換樹脂，能分離極小的球型離子交換樹脂，能分離復(fù)雜樣品，進(jìn)樣量較大；缺點是機械強度不高，復(fù)雜樣品，進(jìn)樣量較大；缺點是機械強度不高，不能耐受壓力。不能耐受壓力。薄殼型樹脂：薄殼型樹脂：在玻璃微

26、球上涂以薄層的離子交換在玻璃微球上涂以薄層的離子交換樹脂，這種樹脂柱效高，當(dāng)流動相成分發(fā)生變化樹脂，這種樹脂柱效高，當(dāng)流動相成分發(fā)生變化時，不會膨脹或壓縮；缺點是柱子容量小，進(jìn)樣時，不會膨脹或壓縮；缺點是柱子容量小，進(jìn)樣量不宜太多。量不宜太多。 一般采用水的緩沖液作流動相。一般采用水的緩沖液作流動相。3 3、離子交換色譜法的應(yīng)用、離子交換色譜法的應(yīng)用 主要用來分離離子或可離解的化合物主要用來分離離子或可離解的化合物，凡是，凡是在流動相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換在流動相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離。廣泛地應(yīng)用于：無機離子、色譜法進(jìn)行分離。廣泛地應(yīng)用于：無機離子、有機化合物

27、和生物物質(zhì)有機化合物和生物物質(zhì)( (如氨基酸、核酸、蛋白如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等質(zhì)等) )的分離。的分離。四、凝膠色譜法（空間排阻色譜法）四、凝膠色譜法（空間排阻色譜法） 凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔隙，能被流動相浸潤，吸附性很小。隙，能被流動相浸潤，吸附性很小。凝膠色譜法的凝膠色譜法的分離機制是根據(jù)分子的體積大小和形狀不同而達(dá)到分離機制是根據(jù)分子的體積大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。分離目的。1 1、凝膠色譜法的作用機制、凝膠色譜法的作用機制體積大于凝膠孔隙的分子，體積大于凝膠孔隙的分子，由于不由于不能進(jìn)入孔隙而被排阻，直接從表面流能進(jìn)入

28、孔隙而被排阻，直接從表面流過，過，先流出色譜柱先流出色譜柱；小分子小分子可滲入凝膠孔隙中而完全不可滲入凝膠孔隙中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來隨載液受排阻，然后又從孔隙中出來隨載液流動，流動，后流出色譜柱后流出色譜柱；中等體積的分子可滲入較大的孔隙中等體積的分子可滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介于上中，但受到較小孔隙的排阻，介于上述兩種情況之間。述兩種情況之間。 凝膠色譜法是凝膠色譜法是一種按分子尺寸一種按分子尺寸大小的順序進(jìn)行大小的順序進(jìn)行分離的一種色譜分離的一種色譜分析方法。分析方法。2 2、凝膠色譜法的固定相、流動相、凝膠色譜法的固定相、流動相 軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝

29、膠三種。軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝膠三種。 流動相為水或有機溶劑。流動相為水或有機溶劑。3 3、凝膠色譜法的應(yīng)用特點、凝膠色譜法的應(yīng)用特點 保留時間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分子質(zhì)保留時間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分子質(zhì)量大的化合物，相對分子質(zhì)量在量大的化合物，相對分子質(zhì)量在4004008 810105 5的任何類型的任何類型的化合物的化合物保留時間短，色譜峰窄，容易檢測保留時間短，色譜峰窄，容易檢測固定相與溶質(zhì)分子間的作用力極弱，趁于零，柱的壽命固定相與溶質(zhì)分子間的作用力極弱，趁于零，柱的壽命長長不能分辨分子大小相近的化合物不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在，分子量相

30、差需在10%10%以上時才能得到分離以上時才能得到分離 離子對色譜離子對色譜 （ion pair chromatography）原理原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子 或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水 性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；陰離子分離陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十 六烷基三甲銨作為對離子；六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離陽離子分離

31、：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜反相離子對色譜：非極性的疏水固定相：非極性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有對離子，含有對離子 Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作為流動相，試樣離水作為流動相，試樣離 子子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+X - 后；在兩相間分配。后；在兩相間分配。4 4 高效液相色譜分離方法的選擇高效液相色譜分離方法的選擇一、一、HPLCHPLC的應(yīng)用范圍的應(yīng)用范圍高沸點、熱穩(wěn)定性差的有機物以及相對分子質(zhì)量大（大高沸點、熱穩(wěn)定性差的有機物以及相對分子質(zhì)量大（大于于40

32、0400）的有機物。）的有機物。HPLCHPLC在常溫下進(jìn)行分離與分析，不會導(dǎo)致被測物的熱分在常溫下進(jìn)行分離與分析，不會導(dǎo)致被測物的熱分解，其流動相是液體，所以只要試樣能制備成溶液，原則解，其流動相是液體，所以只要試樣能制備成溶液，原則上都可以用上都可以用HPLCHPLC分離與分析，如離子型化合物、不穩(wěn)定天分離與分析，如離子型化合物、不穩(wěn)定天然產(chǎn)物以及氨基酸、蛋白質(zhì)等高分子化合物均可用然產(chǎn)物以及氨基酸、蛋白質(zhì)等高分子化合物均可用HPLCHPLC獲獲得較好的分離效果。得較好的分離效果。 HPLC的應(yīng)用的應(yīng)用1. 環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠固定相：薄殼型硅膠(37 50 m) 流動相：正己烷流