乳酸中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定

1、 分類號(hào)：2011屆本科生畢業(yè)論文題目：乳酸中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定Title：Lacticacid streptococcus thermophilus cultured in the separation and identification系 別：化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院專 業(yè)：07級(jí)生物技術(shù)學(xué)生姓名：邵志國(guó)學(xué) 號(hào)：2007090223指導(dǎo)老師：郭志華職稱：講師2011年4月17號(hào)摘 要目的從乳酸中將嗜熱鏈球菌分離出并進(jìn)行鑒定。方法 利用MRS培養(yǎng)基將乳酸中的菌種培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色、鏡檢分離出嗜熱鏈球菌，最后選出7株，對(duì)它進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察。最后對(duì)其進(jìn)行各種理化鑒定。結(jié)果鏡檢結(jié)果該菌為革蘭氏

2、陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)生化鑒定該菌為嗜熱鏈球菌。關(guān)鍵詞：乳酸；嗜熱鏈球菌；分離；鑒定。ABSTRACTobjective the streptococcus thermophilus cultured from lactic acid will isolate and evaluations. method Use the media will lactic acid bacteria MRS cultivation, and after gram's staining, isolated anti-bma streptococcus thermophilus cultured, finally

3、chosen for it, seven strains colony morphology observation. Finally the various physical and chemical identification. result microscopy results this for gram-positive bacteria, after biochemical identified the bacteria for streptococcus thermophilus cultured. Keywords: lactic acid; Streptococcus the

4、rmophilus cultured; Depart; appraisal 目錄緒論51試驗(yàn)材料與方法61.1試驗(yàn)材料61.2 實(shí)驗(yàn)試劑61.3實(shí)驗(yàn)方法6乳酸菌的篩選61.3.2 乳酸菌的分離純化61.4 理化性質(zhì)的測(cè)定72結(jié)果與討論82.1菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)82.2生化試驗(yàn)結(jié)果113小結(jié)12參考文獻(xiàn)13致 謝14緒論乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵的糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。這類細(xì)菌廣泛分布在土壤、植物根莖、湖泊及動(dòng)物的體內(nèi)。酸菌從形態(tài)上可以分為球菌和桿菌，并且均為革蘭氏染色陽(yáng)性、在缺少氧氣的環(huán)境中生長(zhǎng)良好的兼性厭氧性或厭氧性細(xì)菌。目前，對(duì)乳酸菌的應(yīng)用研究，著重于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵食品和醫(yī)藥工業(yè)等人類

5、生活密切相關(guān)的領(lǐng)域。乳酸是以新鮮牛乳經(jīng)有效殺菌，用不同乳酸菌發(fā)酵劑制成的乳制品。由于該產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，并能改善腸道正常微生物區(qū)系的穩(wěn)定，因此它已成為深受消費(fèi)者青睞的營(yíng)養(yǎng)保健食品。在我國(guó)市場(chǎng)上，生產(chǎn)銷售的各種乳酸制品中，作為發(fā)酵劑使用的乳酸菌，通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。乳酸的生產(chǎn)是利用原始菌種進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)方式進(jìn)行，即活化復(fù)壯再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至乳酸菌的活力都達(dá)到可用程度后，投入生產(chǎn)進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵劑的活化過(guò)程中，工序多，技術(shù)要求嚴(yán)格，稍有不甚就會(huì)污染雜菌，通過(guò)對(duì)乳酸發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌的分離和鑒定能及時(shí)掌握研究進(jìn)程和生產(chǎn)控制。1 實(shí)驗(yàn)材料和方法1.1材料和儀器乳酸：采購(gòu)于超市 伊利；化學(xué)試

6、劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。超凈工作臺(tái)、酒精燈、接種環(huán)、滅菌鍋等。1.2實(shí)驗(yàn)試劑MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，肉膏10 g，酵母提取物5 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，KHPO42 g，MnSO4.4H2O 0.25 g，MgSO4.7H2O 0.58g， 葡萄糖20g，吐溫80 1ml，瓊脂25g，水1000ml。調(diào)PH6.26.4，121滅菌15min。PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，鹽溶液4.0 g，蒸餾水100ml。調(diào)PH值6.0左右，113滅菌20min。蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5g，Nacl2.5 g，蒸餾水500ml。調(diào)ph值7.0左右，121滅菌20mi

7、n。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，KHPO4 2g，蒸餾水1000ml，調(diào)PH值7.07.2，過(guò)濾，121滅菌30min。明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母提取物1.0 g，葡萄糖0.1g，明膠12.0g，鹽溶液4.0ml，蒸餾水100ml，ph值7.0,113115滅菌1520min。 可溶性淀粉培養(yǎng)基：向PY培養(yǎng)基中加入0.5%可溶性淀粉。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 乳酸菌的篩選 將乳酸均勻涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，37靜置培養(yǎng)48h。1.3.2 乳酸菌的分離純化 挑取培養(yǎng)基上的菌落，劃線分離純化23次，最后選擇單菌落，經(jīng)過(guò)鏡檢確認(rèn)為純種，得到7株菌株，4斜面保存。將菌落

8、平板和細(xì)胞形態(tài)在顯微鏡下用照相機(jī)照出。1.4理化性質(zhì)的測(cè)定1.4.1 KOH試驗(yàn)用滅菌的接種環(huán)加12環(huán)5%的KOH溶液于干凈的載玻片上，調(diào)菌于溶液中，用環(huán)將其混合攪勻，短時(shí)間內(nèi)KOH試劑陽(yáng)性菌會(huì)越攪越稠，抬起接種環(huán)會(huì)產(chǎn)生拉絲現(xiàn)象，而KOH陰性菌則無(wú)拉絲現(xiàn)象。1.4.2 過(guò)氧化氫酶測(cè)定用滅菌的接種環(huán)加12環(huán)10%過(guò)氧化氫溶液于干凈的載玻片上，挑菌于溶液中，攪拌均勻。觀察產(chǎn)氣泡情況，有氣泡產(chǎn)生，則判斷為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)。1.4.3 需氧試驗(yàn)將分離純化后的各菌株分別接種于高層MRS液體培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng)2d后，觀察生長(zhǎng)情況。1.4.4 淀粉水解試驗(yàn)將各菌株分別接種到可溶性淀粉培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)

9、12天。然后向培養(yǎng)液中加入34滴盧戈氏碘液，如不顯色表示淀粉水解陽(yáng)性反應(yīng)，顯藍(lán)黑色或藍(lán)紫色時(shí)，表示淀粉水解或水解不完全，為陰性反應(yīng)。1.4.5 明膠液化試驗(yàn)菌株接種后適溫培養(yǎng)，觀察結(jié)果時(shí)需經(jīng)低溫處理。如對(duì)照管（未接種）凝固而接種管液化則為陽(yáng)性反應(yīng)，同時(shí)凝固或者液化為陰性反應(yīng)。1.4.6 吲哚試驗(yàn)向培養(yǎng)2d后的含菌蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加34滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1min3min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚試劑，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。1.4.7 V-P試驗(yàn)將各菌株接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)2d后，向培養(yǎng)物內(nèi)加入510滴40%的KOH，然后加

10、入等量的5% -萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫15min30min，以加快反應(yīng)速度。若培養(yǎng)物成紅色，則為V-P反應(yīng)陽(yáng)性。1.4.8 產(chǎn)葡聚糖測(cè)試將菌株接種于加有10%蔗糖的MRS斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)24d，如斜面培養(yǎng)物形成粘稠狀菌苔，表明產(chǎn)生葡聚糖，為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。1.4.9 碳水化合物產(chǎn)酸試驗(yàn)采用PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其中加入碳水化合物，終濃度達(dá)到1%，管內(nèi)培養(yǎng)基高度約45cm。滅菌后接入菌株各1環(huán)，37培養(yǎng)2d。取未加入碳水化合物的培養(yǎng)基作為對(duì)照，結(jié)晶紫試劑比較顏色的變化記錄產(chǎn)酸的強(qiáng)弱。2 結(jié)果與討論2.1 菌落形態(tài)和細(xì)胞分離到的7株菌，菌落乳白色、灰色或略顯黃色；大而

11、平坦或小而厚，菌落濕潤(rùn)且大及邊緣整齊。鏡檢細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式及革蘭氏鑒定結(jié)果見表一表一 7株菌的形態(tài)特征及大小Table 1 7 strains bacteria the morphological characteristics and size編號(hào)染色大小/um形態(tài)排列方式1G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個(gè)或呈短鏈2G+1.0*(1.0-1.3)橢球單個(gè)或成對(duì)或呈短鏈3G+1.0*(1.0-1.4)橢球單個(gè)或呈短鏈4G+1.0*(1.0-1.3)橢球單個(gè)或呈短鏈5G+1.0*(1.0-1.4)橢球單個(gè)或呈短鏈6G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個(gè)或呈短鏈7G+1.0*(1.0

12、-1.5)橢球單個(gè)或成對(duì)或呈短鏈從表一看出，從酸奶中分離出的7株 為嗜熱鏈球菌 符合乳酸菌的特性。下面附平板和細(xì)胞的照片嗜熱鏈球菌的細(xì)胞形態(tài)Streptococcus thermophilus cultured cell type嗜熱鏈球菌的菌落形態(tài)Streptococcus thermophilus cultured colony morphology2.2 生化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果對(duì)篩選的7株菌進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)鑒定結(jié)果見表2、表3。從表2、表3可見，所有7株菌種都能水解淀粉，KOH試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陰性，但對(duì)于多種糖的利用情況不同。表2 7株菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果 Table

13、 2 7 strains isolated biochemical test result項(xiàng)目1 234567KOH試驗(yàn)-淀粉水解+接觸酶試驗(yàn)-需氧試驗(yàn)好氧好氧兼性厭氧微好氧微好氧微好氧微好氧明膠試驗(yàn)-吲哚試驗(yàn)-V-P試驗(yàn)-+-產(chǎn)葡聚糖-+注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)：“-”表示陰性反應(yīng)。表3 7株菌的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果Table 3 7 strains bacteria carbohydrates ferment produce acid test results碳水化合物1 234567葡萄糖+麥芽糖+乳糖+-+-蔗糖+注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)：“-”表示陰性反應(yīng)小結(jié)市售的乳酸中的乳酸菌多

14、為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌其中球菌較少。采用常規(guī)的革蘭氏染色、形態(tài)觀察的方法對(duì)分離到的菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單鑒定,該方法操作簡(jiǎn)單、快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。分離到的嗜熱乳酸鏈球菌菌株經(jīng)活化后可以應(yīng)用到生產(chǎn)中。參考文獻(xiàn)1陳曉平,劉華英,魏曉川.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究J.食品科學(xué).2006(2):91-93.2楊曉暉,籍保平,李博,等.泡菜中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能的研究J.食品科學(xué).2005(5):130-133.3黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.北京:高等教育出版社,1999:58-594鄧放明,李羅明,尹華.碎鮮辣椒發(fā)酵制品發(fā)酵用乳酸菌的選育與接種發(fā)酵試驗(yàn)J.食品科學(xué).2005(3):106-108.5黃君紅,成潔珊,陳青荷.乳酸菌生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基的篩選J,中國(guó)釀造.2001(2):9-11.致謝在本論文完成之際，