重組腺病毒載體介導(dǎo)人DeltaNpα轉(zhuǎn)染對(duì)樹突狀細(xì)胞凋亡的抑制作用

1、 重組腺病毒載體介導(dǎo)人DeltaNp73轉(zhuǎn)染對(duì)樹突狀細(xì)胞凋亡的抑制作用 作者：胡義杰 范士志 蔣耀光 李志平 陳建明 何勇 【摘要】 目的： 研究人DeltaNp73基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染人臍血來(lái)源樹突狀細(xì)胞對(duì)其成熟狀態(tài)及其凋亡水平的影響. 方法： 用Adeasy系統(tǒng)構(gòu)建人DeltaNp73基因重組腺病毒；并通過(guò)增強(qiáng)離心法將其轉(zhuǎn)染至人臍血來(lái)源DC；流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后DC的成熟狀態(tài)以及DC的凋亡水平. 結(jié)果： 成功構(gòu)建了人DeltaNp73基因重組腺病毒并高效轉(zhuǎn)染DC；人DeltaNp73基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染提高了DCCD83，HLADR的表達(dá)，并能顯著抑制其凋亡水平. 結(jié)論： 人DeltaNp73

2、基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC，促進(jìn)DC的成熟并抑制其凋亡，將有效地提高DC疫苗的抗原呈遞能力. 【關(guān)鍵詞】 DeltaNp73 重組 遺傳 腺病毒科 樹突細(xì)胞 樹突細(xì)胞疫苗 0引言 免疫治療是腫瘤目前極有前景的治療手段之一. 激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)腫瘤主動(dòng)免疫治療的關(guān)鍵. 樹突狀細(xì)胞能攝取特異性相關(guān)抗原、高水平的表達(dá)與抗原遞呈有關(guān)的MHCI，MHC分子、多種共刺激分子及黏附分子，從而激活初始T淋巴細(xì)胞. 腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌一些免疫抑制因子來(lái)抑制DC的成熟及其功能，甚至通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)DC細(xì)胞的凋亡1. 具有抑制細(xì)胞作用的DeltaNp73屬于p53基因家族，其在肺癌組織中表達(dá)量和陽(yáng)性表

3、達(dá)率明顯升高，是肺癌免疫治療中較好的靶點(diǎn). 我們擬通過(guò)構(gòu)建DeltaNp73的重組腺病毒并轉(zhuǎn)染人DC，使DeltaNp73在DC內(nèi)穩(wěn)定高表達(dá)、呈遞，并探討DeltaNp73高表達(dá)對(duì)DC活化狀態(tài)及凋亡水平的影響. 1材料和方法 材料真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3DeltaNp73HA由意大利羅馬大學(xué)Gerry Melino教授和Vincenzo De laurenzi博士惠贈(zèng)，含DeltaNp73基因cDNA全長(zhǎng)約1700 bp. PAdTrackCMV，293T細(xì)胞，E. coli BJ5183，DH5大腸桿菌由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所提供. KpnI， XbaI， PmeI， PacI限制性

4、內(nèi)切酶以及T4DNA連接酶；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒；大小量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNA PCR Kit；人淋巴細(xì)胞分離液；人白細(xì)胞介素IL4，人粒單核集落刺激因子GMCSF，腫瘤壞死因子TNF；AntiHA Tag Mouse monoclonal Antibody；Tripure Reagent；MCCelLytics Mammalian Cell Protein Extraction Reagent，BCA蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒；goat antimouse IgG/HRP二抗；PEantiCD1a,PEantiCD83,PEantiHLADR及

5、其同型對(duì)照；PEAnnexin V凋亡試劑盒. 根據(jù)GenBank中DeltaNp73 cDNA的序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)針對(duì)其的特異引物并由Invitrogen公司合成. 方法 復(fù)制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73的構(gòu)建復(fù)制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73含全長(zhǎng)人DeltaNp73 cDNA，由我科通過(guò)AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建. 50%組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)染劑量法測(cè)得病毒的滴度為1011pfu/L. 人臍帶血來(lái)源DC的分離培養(yǎng)經(jīng)產(chǎn)婦同意后，取剖腹產(chǎn)時(shí)新生兒臍帶血，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法2分離出單個(gè)核細(xì)胞，37, 50 mL/L CO2孵箱孵育. 2 h后轉(zhuǎn)移未貼壁細(xì)胞至另一離心管供

6、分離T細(xì)胞，貼壁細(xì)胞更換含有細(xì)胞因子IL4，GMCSF的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng). 間隔1 d半量更換培養(yǎng)基，補(bǔ)充細(xì)胞因子IL4, GMCSF. 第6日收獲未成熟DC；或者第5日換液時(shí)加入TNF，刺激48 h后即第7日收獲成熟DC. 重組腺病毒增強(qiáng)離心法轉(zhuǎn)染DC參照文獻(xiàn)3，采用離心法增強(qiáng)腺病毒轉(zhuǎn)染DC. 轉(zhuǎn)染后DC中DeltaNp73的表達(dá)收集DC,腺病毒轉(zhuǎn)染48 h的DC/AdDeltaNp73以及對(duì)照組的DC/Adctrl. RTPCR分析DeltaNp73 mRNA水平； Western Blot分析DeltaNp73蛋白表達(dá)水平. 轉(zhuǎn)染前后DC表面標(biāo)志物的變化收集DC，PBS洗滌細(xì)胞后，分別加入

7、待檢測(cè)的CD1a，CD83及HLADR抗體及其同型對(duì)照；4避光孵育30 min后，PBS液洗滌2次后上機(jī)檢測(cè). 凋亡水平的變化轉(zhuǎn)染7 d收集DeltaNp73腺病毒感染的DC；將細(xì)胞懸浮在1結(jié)合緩沖液中，調(diào)整密度為108/L；將細(xì)胞懸液和PE標(biāo)記Annexin V混合，室溫孵育10 min；離心，PBS洗滌細(xì)胞；使用1結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；PI染色細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 用 軟件分析數(shù)據(jù)；P 2結(jié)果 的分離在誘導(dǎo)培養(yǎng)DC過(guò)程中，第5日在光鏡下即可見細(xì)胞呈半懸浮生長(zhǎng)，胞膜向外延伸出樹枝狀突起，CD1a+細(xì)胞約占29%. 加入TNF刺激48 h后其突起明顯增多. 培養(yǎng)7 d時(shí)表型檢測(cè)C

8、D83細(xì)胞約占91%，HLADR表達(dá)約占92%，均較各自未成熟組明顯增多. 掃描電鏡觀察，胞質(zhì)突起形成典型的樹枝狀，并可見DC的粗糙表面. 重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC以及DeltaNp73的表達(dá)采用200 重組DeltaNp73腺病毒有效轉(zhuǎn)染iDC. 絕大部分細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光的表達(dá)；最佳根據(jù)轉(zhuǎn)染過(guò)后的效率以及對(duì)DC的細(xì)胞毒性綜合優(yōu)化為200. RTPCR及Western Blot結(jié)果證實(shí)通過(guò)200 重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC后，可以觀察到DeltaNp73 mRNA及其蛋白在DC中的表達(dá). 標(biāo)志物的變化轉(zhuǎn)染后的DC表面分子CD83，HLADR均較iDC表達(dá)水平增加，接近mDC水平. CD83，HLADR表達(dá)

9、的上調(diào)在AdDeltaNp73和Adctrl組間沒有差異，提示DeltaNp73對(duì)DC表面分子的表達(dá)沒有明顯作用. 凋亡水平的改變重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC 7 d后， DeltaNp73組DC存活率顯著高于另外兩組；而正常培養(yǎng)DC以及空腺病毒載體轉(zhuǎn)染組之間沒有顯著差異. 同時(shí)，DeltaNp73組DCs的存活率達(dá)%，顯著高于另兩組；而正常培養(yǎng)DC以及空腺病毒載體轉(zhuǎn)染組之間沒有顯著差異%，%). 3討論 DC是啟動(dòng)免疫反應(yīng)最關(guān)鍵的抗原呈遞細(xì)胞，但由于DC具有高度不均質(zhì)性，其分化以及功能很容易受外界因素的影響；且惡性腫瘤可以通過(guò)分泌一系列的免疫抑制因子，致使DC功能失調(diào)，從而系統(tǒng)的影響免疫抗瘤效應(yīng). 我

10、們采用在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，經(jīng)含全長(zhǎng)DeltaNp73基因重組腺病毒修飾，探討DC功能變化及進(jìn)一步用于抗瘤的可行性. 首先，腫瘤可以干預(yù)DC的成熟狀態(tài)；而重組腺病毒轉(zhuǎn)染可促進(jìn)DC的活化. 從多種腫瘤患者腫瘤中分離的DC，其共刺激分子CD80，CD86等均低表達(dá)，即表型主要為未成熟表型，其T細(xì)胞刺激能力明顯減弱，體外誘導(dǎo)同源CD4+ T細(xì)胞無(wú)力；是否誘導(dǎo)T細(xì)胞的死亡4. 未成熟DC對(duì)成熟刺激因子GMCSF，TNF或CD40L均呈低反應(yīng)性，提示并非缺乏成熟刺激因子，可能是腫瘤相關(guān)產(chǎn)物抑制了其成熟. 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DeltaNp73對(duì)DC的成熟并沒有直接的影響，但重組腺病毒的轉(zhuǎn)染，可以顯著提高相關(guān)

11、共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)DC的成熟；而DeltaNp73的表達(dá)，卻顯著地誘導(dǎo)了HLADR的表達(dá)，提示DC高效表達(dá)MHC I類和MHC II類分子，為下一步的有效抗原呈遞提供了基礎(chǔ). 其次，腫瘤患者體內(nèi)易發(fā)生DC的自發(fā)性凋亡以及T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的DC凋亡5；而DeltaNp73重組腺病毒轉(zhuǎn)染可抑制DC的凋亡，提高其生存率. 相比于iDC，mDC更容易發(fā)生自發(fā)性凋亡6. DC與CD4+ 12下一頁(yè) T細(xì)胞發(fā)生抗原特異性作用后，DC立即進(jìn)入凋亡過(guò)程；該過(guò)程部分受CD95CD95L信號(hào)通路的調(diào)節(jié). 已經(jīng)證實(shí)DC的生存期顯著影響著在體DC誘導(dǎo)T細(xì)胞聚集增殖能力以及維持有效抑瘤免疫學(xué)效應(yīng)的能力7. 通過(guò)

12、TNF受體修飾DC，可以顯著抑制DC的自發(fā)性凋亡，使其生存期長(zhǎng)于正常對(duì)照DC以及空病毒載體轉(zhuǎn)染的DC8. 瘤內(nèi)注射表達(dá)抗凋亡分子BCLXL的DC疫苗可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗瘤效應(yīng)；并證實(shí)與DC生存期延長(zhǎng)相關(guān)9. 本研究DC的生存率明顯高于正常對(duì)照DC以及含EGFP病毒轉(zhuǎn)染的DC，亦即DeltaNp73可以抑制DC細(xì)胞的自發(fā)性或誘導(dǎo)性凋亡，這將提高DeltaNp73修飾DC的T細(xì)胞聚集增殖能力以及有效抑瘤免疫反應(yīng)能力. 【參考文獻(xiàn)】 1 Uramoto H, Sugio K, Oyama T, et al. Expression of the p53 family in lung cancer J. A

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