蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法匯總情況

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案實(shí)驗(yàn)七 蛋白質(zhì)含量測(cè)定測(cè)定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮月尿 (Biuret)法，酚試劑法 (Lowry)法及紫外吸收法。 目的要求1 .掌握測(cè)定蛋白質(zhì)的含量基本方法。2 . 了解染料法、雙縮月尿法、Lowry法和紫外吸收法測(cè)定原理。、染料法實(shí)驗(yàn)原理在酸性溶液中染料考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，此時(shí)考馬斯亮藍(lán)G-250顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，吸收高峰從 460nm移至595nmi利用這個(gè)原理可以測(cè)定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法趨勢(shì)，因?yàn)樗僮骱唵?，反?yīng)時(shí)間短，染料-蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強(qiáng)。本法的缺點(diǎn)是：對(duì)于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白氨基酸組成有較

2、大差 異的蛋白質(zhì)，有一定誤差，因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)與染料的結(jié)合是不同的，故該法適合測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相近的蛋白質(zhì)。器材吸量管； 試管；721型分光光度計(jì)試劑1 .標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。2 .待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。3 .染料溶液：稱取考馬斯亮藍(lán) G-250 0.1g溶于95%勺酒精50ml,再加入85%勺濃磷酸100ml,用水稀釋至1000ml,混勻備用。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:試齊IJ管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595nm按上表分別向各支試管內(nèi)加入各

3、種試劑，充分混勻，5min后在595nm波長處以0號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(A)。以吸光度彳1為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品測(cè)定：取1ml樣品溶液（約含25250微克蛋白質(zhì)），加入染料溶液5ml混勻，5min后測(cè)定其595nm吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。、雙縮月尿（Biuret）法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)原理在堿性溶液中，雙縮月尿（H2N-CO-NH-CO-NH與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮月尿反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基（一CO-NH）,或與此相似的基團(tuán)如-CH2-NH2, -CS-NH, C（NH）NH的任何化合物，無論這類基團(tuán)直接相

4、連還是通過一個(gè)碳或 氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵（一CO-NH-）,可發(fā)生雙縮月尿反應(yīng)，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測(cè)定蛋白含量。測(cè)定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸俊、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。 主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮月尿法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。試劑1 .雙縮月尿試劑： 取CuSO- 5H20（c.P.）1.5g 和酒石酸鉀鈉（c.P.）6.0g 以少量蒸儲(chǔ)水 溶解，再加2.5mol/L NaOH300

5、ml, KI 1.0g ,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保 存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。2 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用 BSA濃度1g/L的Aw為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用 0.05mol/LNaOH!已制。器材1 .試管：15 x 150mm試管7只；2 . 1ml, 5ml 移液管；3 .坐標(biāo)紙； 4. 721分光光度計(jì)。 操作步驟

6、 取試管7支，編號(hào)，按下表操作：試齊IJ管號(hào)空白管12345測(cè)定管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（10g/L ）-0.10.20.30.40.5-生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測(cè)樣品-0.1雙縮月尿試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L ）01020304050混勻，37c水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計(jì)波長540nm處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。15為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測(cè)得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測(cè)定管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項(xiàng)1 .雙縮月尿試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止

7、CuSO-5H0不穩(wěn)定形成Cu（OH）2沉淀。酒石酸鉀鈉與 CuSO-5屋0之比不低于3 ： 1 ,加入KI作為抗氧化 試齊I。2 .雙縮月尿試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3 .本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。4 .黃疸血清、嚴(yán)重溶血對(duì)本法有明顯干擾。思考題1 .雙縮月尿法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么？其它還有什么方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量？2 .請(qǐng)用雙縮月尿法，設(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的定量方法（除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外）。三、酚試劑法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量（改良Lowry法） 實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡(luò)合生成復(fù)合物產(chǎn)生紫紅色化合物（雙

8、縮月尿反應(yīng)），同時(shí)使肽鏈展開，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸和組氨酸均能使鴇酸、鋁酸同 時(shí)失去1個(gè)，2個(gè)或者3個(gè)氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)顏色（最 大吸收峰波長為745750nm，反應(yīng)式一）其藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成正比，由 此可測(cè)出樣品中蛋白質(zhì)的含量。同時(shí)蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯醇化反應(yīng)（反應(yīng)式二）能使鋁離子在pH10時(shí)螯合在肽結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸的顯色劑上，大大增加了 酚試劑對(duì)蛋白質(zhì)的敏感性。反應(yīng)式一3H20PQ?13W5MoO?10H2。3H0F2Q?14W0?4Mo0? 10HzO反應(yīng)式二3H2OBQ?13W(2?5MoO?10H2O3H

9、2OP2Q?14WO?4MoO? 10H2O烯醇化反應(yīng)烯醇化反應(yīng)后，可與 Cu2+絡(luò)合，絡(luò)合后，易于使肽釋放電子，使酚試劑還原。 試劑器材1 .堿性銅試劑：甲液：稱取無水碳酸鈉2.0g ,溶于0.1mol/LNaOH§?夜100ml中。乙液：取硫酸銅(CuSO ?5H2O ) 0.5g ,溶于1刷石酸鉀溶液100ml中。 臨用前取甲液50ml,乙液1ml混合，即為堿性銅試劑。此液需現(xiàn)用現(xiàn)配。2 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(250 Mg/ml ):精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白25mg,溶于0.9%NaCl溶液中，以容量瓶定容至 100ml。3 .樣品：取血清0.1ml ,置于50ml容量瓶中，用0.

10、9%NaCl溶液稀釋至刻度處， 混勻， 為待測(cè)血清樣品。4 .酚試劑：取鴇酸鈉(NaWO?2H2O) 100g和鋁酸鈉(NaMoO?2H2。25g,溶于700ml蒸 儲(chǔ)水中，再加入85%磷酸50ml和濃硫酸100ml充分混勻，置于1500ml圓底燒瓶中溫和地回 流10小時(shí)，冷卻，取下冷凝裝置，再加入硫酸鋰( Li 2SQ?2H2Q 150g,水50ml,澳34滴， 開口繼續(xù)沸騰15分鐘，驅(qū)除過量的澳，冷卻后稀釋至1000ml，過濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色(如帶綠色不能使用，應(yīng)繼續(xù)加澳煮沸)，置于棕色瓶中保存。 使用前，以酚血:為指示劑，用0.1mol/LNaOH溶液滴定，求出酚試劑的摩爾濃度。然

11、后根據(jù)此濃度，將酚試劑用蒸儲(chǔ)水 稀釋至最后酸度為1mol/L。(滴定時(shí)可將酚試劑稀釋，以免顏色影響)。試劑放置過久，變成綠色時(shí)，可再加澳數(shù)滴煮15分鐘，如能恢復(fù)原有的金黃色仍可使用。5 . 721分光光度計(jì)；旋渦混合器；秒表；試管。 操作步驟取試管7支，編號(hào)，按下表操作:試劑(ml) 管 號(hào)O12345測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(250g/ml )一0.20.40.60.81.0一稀釋血清一一一一一1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.2一一堿性銅試劑5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5混勻，室溫放置 30min

12、后，以0管調(diào)零點(diǎn)，在波長 650nm比色，分別讀取各管吸光 度值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測(cè)定管吸光度值，查 標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白質(zhì)含量。臨床意義1 .血清總蛋白濃度增高：(1)血清中水分減少，而使蛋白濃度相對(duì)增高。如急性失水時(shí)(嘔吐、腹瀉、高熱)； 休克時(shí)，由于毛細(xì)管通透性的變化，血漿也發(fā)生濃縮等。(2)蛋白合成增加，大多數(shù)發(fā)生多發(fā)性骨髓瘤患者中，主要是血清球蛋白增加。2 .血清蛋白合成降低：(1)合成障礙，主要為肝功能障礙，肝臟是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，肝功嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，蛋 白質(zhì)的合成減少，以白蛋白最為顯著。(2)蛋白質(zhì)丟失，如嚴(yán)重灼傷時(shí)，大量血漿滲出；腎病綜合癥時(shí)

13、，尿液中長期丟失蛋 白質(zhì)等。(3)營養(yǎng)不良或長期消耗性疾病，如嚴(yán)重結(jié)核或長期消耗性疾病。(4)血液中水分增加，血漿被稀釋，因各種原因引起的水鈉潴留或輸注過多低滲溶液。 注意事項(xiàng)1 .酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)相互作用，所 以當(dāng)加入酚試劑后，應(yīng)迅速搖勻(加一管搖一管)，使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鋁酸-磷鴇酸試劑被破壞之前。2 .堿性銅試劑必須臨用前配制。3 .磷鋁酸、磷鴇酸的顯色反應(yīng)是由于和還原物質(zhì)的還原反應(yīng)而引起的，因此本法可受很多還原性物質(zhì)的干擾，如帶有 -SH的化合物，糖類、酚類等甚至有些緩沖劑(如 Tris )也能 干擾測(cè)定。但如控制在低濃度范圍內(nèi)，則不影響測(cè)定

14、，Lowry法很靈敏，可以對(duì) 5100 dg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行很好的顯色反應(yīng)，而如此低的蛋白質(zhì)濃度常常已把干擾物質(zhì)的濃度稀釋到一個(gè)不起作用的水平。4 .所有器材必須清洗干凈，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5 .血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，若超過此范圍需要將血清酌情稀釋。6 .本法操作簡便、靈敏度高，缺點(diǎn)是試劑只與蛋白質(zhì)中半胱氨酸、色氨酸等起反應(yīng)， 因此可因各種蛋白質(zhì)中含這幾種氨基酸的量不同使顯色強(qiáng)度稍有不同。思考題1 .用酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量有哪些優(yōu)點(diǎn)？2 .用酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量有哪些干擾作用？應(yīng)如何注意？四、紫外吸收法實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軻雙

15、鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。 此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的 （NH） 2SQ等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異

16、大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有喋吟、喀咤及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)， 會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。 核酸的干擾可以通過查校正表， 再進(jìn)行計(jì)算的方 法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 pH相一致。試劑器材1 .蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）:準(zhǔn)確稱量經(jīng)微量凱氏定氮法校正的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制。2 .紫外分光光度計(jì)。操作步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8支試管

17、，按下表編號(hào)并加入試劑：ml)01234567蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）蒸儲(chǔ)水04.00.53.51.03.01.52.52.02.02.51.53.01.04.00混勻。在280nm處測(cè)定各管溶液的吸光度值。以0號(hào)管調(diào)零，以蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .蛋白質(zhì)樣品溶液，在 280nm處測(cè)得吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。 注意事項(xiàng)1 .蛋白質(zhì)的最高吸收峰可因 pH的改變而發(fā)生變化，因此要注意保持待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的 pH值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液一致。2 .測(cè)定液必須澄清，以免造成結(jié)果誤差。3 .本法需用石英比色杯。思考題1 .為什么紫外吸收法可作為蛋白質(zhì)定量

18、測(cè)定方法？其理論依據(jù)是什么？2.此法測(cè)定蛋白質(zhì)具有什么特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)二十一紫外光吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度目的和要求了解紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理。熟悉紫外分光光度計(jì)的使用。原理蛋白質(zhì)組成中長含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內(nèi)其濃度與吸光度成正比，故可用 紫外分光光度計(jì)通過比色來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。由于核酸在280nm波長處也有光吸收，對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定有一定的干擾作用，但核酸的最大吸收峰在 260nm處。如同時(shí)測(cè)定260nm的光吸收，通過計(jì)算可以消除其對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響。因此如溶中存在核酸時(shí)必須同時(shí)測(cè)定280nm及260nm的吸光度，方可通過計(jì)算測(cè)得溶液

19、中的蛋白質(zhì)濃度。操作步驟一.直接測(cè)定法在紫外分光光度計(jì)上，將未知的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以 生理鹽水為對(duì)照，測(cè)得 280nm和260nm兩種波長的吸光度（A280nm及 A260nm）。將A280nm及A260nm波長處測(cè)得的吸光度按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。C = 1.45A280nm 0.74A260nm式中C:蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ml）;A280nm：蛋白質(zhì)溶液在280nm處測(cè)得的吸光度；A260nm：蛋白質(zhì)溶液在260nm處測(cè)得的吸光本法對(duì)微量蛋白質(zhì)的測(cè)定既快又方便，它還適用于硫酸鏤或其他鹽類混 雜的情況，這時(shí)用其他方法測(cè)定往往較困難。為方便起見對(duì)于混合蛋白質(zhì)溶液， 可用A280nm乘以0.75來代表其中蛋 白質(zhì)的大致含量（mg/ml）。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取8支干