熒光PCR原理參考模板

1、熒光PCR原理1熒光染料熒光基團(tuán)通常各自擁有單一的光吸收峰。在光的刺激下，熒光基團(tuán)吸收光的能量后通常以三種方式釋放出能量：1) 光能 許多熒光基團(tuán)吸收光能后仍舊以光能形式釋放能量，并且發(fā)射光的峰值大于吸收峰。比如熒光染料Fam的光吸收峰為490nm，而發(fā)射峰為530nm。 2) 熱能 某些熒光基團(tuán)吸收光能后，能量轉(zhuǎn)換為熱量擴(kuò)散到環(huán)境中，如Dabcyl。 3) 轉(zhuǎn)移給臨近的分子 當(dāng)臨近的分子滿足發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的要求時(shí)，能量從熒光基團(tuán)傳遞到臨近的分子。 2熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET） 

2、;當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過(guò)程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實(shí)際相當(dāng)于將短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。 3熒光PCR 熒光PCR不同于其他PCR的地方在于PCR過(guò)程中利用熒光染料在光刺激下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，并通過(guò)足夠靈敏的自動(dòng)化儀器實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量定量的目的。主要有以下幾類(lèi)： 1) 熒光染料直接結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物 如SYBB Green I,類(lèi)似

3、于EB,能特異性地區(qū)分單雙鏈DNA,只與雙鏈DNA結(jié)合.2) 熒光標(biāo)記引物 對(duì)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.3) 熒光標(biāo)記探針 常規(guī)引物以外，引入熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針，探針可與模板發(fā)生一對(duì)一結(jié)合關(guān)系。 a) Taqman雙標(biāo)記探針（TaqmanTM 5-nuclease assay） b) 分子信標(biāo)探針（Molecular beacon TM） c) LightCycler TM雜交雙探針 熒光標(biāo)記探針的最大優(yōu)點(diǎn)在于其特異性非常強(qiáng)，避免了非特異性擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性信號(hào)。 匹基生物開(kāi)發(fā)的熒光PCR檢測(cè)試劑盒主要基于Taqman

4、技術(shù) (TaqmanTM 5-nuclease assay)：除常規(guī)的一對(duì)引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個(gè)能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的5端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3標(biāo)記另一個(gè)熒光基團(tuán)。此時(shí)5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生FRET），因此正常情況下檢測(cè)不到該探針5端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào).但當(dāng)溶液中有模板時(shí)，模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換: Taq酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光，切割

5、的熒光基團(tuán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量 4熒光定量PCR（Fluorenscent Quantitative PCR,FQ-PCR） 1) Threshold：PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的最下限，通常設(shè)定在S型擴(kuò)增曲線的增長(zhǎng)拐點(diǎn)處附近。 2) Threshold Cycle (TC or CT) OR Cross Point(CP)：PCR增長(zhǎng)信號(hào)與Threshold發(fā)生交匯的循環(huán)數(shù)，也是FQ-PCR判斷陰陽(yáng)性和進(jìn)行定量分析的依據(jù)。 3) Standard Curve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)：CT/TC/CP與起始模板量的對(duì)數(shù)呈反比關(guān)系：Y=-aX+b 其中X=Log Concentration Y=CT/TC/CP PCR擴(kuò)增過(guò)程中，引入一系列已知起始濃度的模板與未知樣品同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，利用該系列模板的CT/TC/CP值與已知濃度對(duì)數(shù)做直線回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出未知樣品的起始模板濃度。2 / 3 5熒光PCR的優(yōu)點(diǎn) 熒光PCR區(qū)別于其他PCR方法主要有以下優(yōu)點(diǎn)： 1) 全封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR后處理 2) 特異性強(qiáng)，靈敏度高 3) 采用對(duì)數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確 4) 定量范圍寬，