加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究

1、加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究 作者：鄭旭銳，孫守才，李長秦 【摘要】 目的：觀察加味四逆散不同劑量與療效的關(guān)系，探討該方抗肝纖維化的合適用量。方法：采用二甲基亞硝胺腹腔注射制備大鼠肝纖維化模型，加味四逆散大、中、小不同劑量灌胃給藥，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)分析各組大鼠肝組織型膠原的含量。結(jié)果：加味四逆散中劑量影響效果優(yōu)于小劑量和大劑量，3組之間的療效呈中劑量小劑量大劑量的關(guān)系，中劑量與小、大劑量比較有顯著性差異(P0.05)，而小劑量與大劑量比較無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：加味四逆散對(duì)肝纖維化有肯定的治療作用，而且中劑量療效較好。 【關(guān)鍵詞】 四逆散/治療應(yīng)用；肝硬化/病理學(xué)；大鼠

2、 1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠66只，體重(18020)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1.2 藥物及試劑 加味四逆散由柴胡、枳殼、白芍、甘草、黃芪、丹參、桃仁等藥組成(購自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)本院藥物鑒定教研室鑒定，均為真品)。藥物加水浸泡常規(guī)煎煮，過濾，水浴蒸發(fā)至每1 mL含生藥3.75 g，置于4冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ锼蓧A(云南醫(yī)藥集團(tuán)云南藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，二甲基亞硝胺(DMN，美國Sigma公司生產(chǎn))，型膠原抗體(0.1 mL兔抗鼠濃縮型，武漢博士德生物制品公司生產(chǎn))，免疫組化試劑盒(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫組化室提供)。 2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 動(dòng)物模型制備 大鼠在

3、適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選取8只作為空白對(duì)照組(A組)，其余58只均用DMN(用生理鹽水稀釋至5 mg/mL)以10 mL/kg體重腹腔注射，每日1次，每周連續(xù)3 d，連續(xù)4周。 2.2 分組 4周造模結(jié)束后，58只大鼠共死亡8只，死亡率為13.7%，將剩余50只造模大鼠隨機(jī)分為：B組(病理模型組)10只；C組(秋水仙堿組)10只；D組(中藥大劑量組)10只；E組(中藥中劑量組)10只；F組(中藥小劑量組)10只。 2.3 給藥 A、B組：以生理鹽水4 mL/只灌胃；C組：以秋水仙堿0.01 mg/kg體重灌胃；D組：以加味四逆散煎劑20 mL/kg體重灌胃；E組：以加味四逆散煎劑10 mL/kg

4、體重灌胃；F組：以加味四逆散煎劑5 mL/kg體重灌胃。以上各組用藥均1次/d，連續(xù)用藥30 d后結(jié)束。 2.4 標(biāo)本采集與制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將大鼠斷頭處死取新鮮肝組織左葉，10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5 m。 2.5 觀測(cè)方法 將各組石蠟切片均行常規(guī)HE染色及膠原纖維染色，光鏡下觀察。病理組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為2：“-”級(jí)，正常肝臟或無明顯膠原纖維增生；“”級(jí)，膠原纖維增生，中央靜脈和匯管區(qū)有少量纖維索放散延伸，但無間隔形成；“+”級(jí)，膠原纖維增生，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)締組織變厚，由此向四周伸出纖維索，形成不完全間隔；“”級(jí)，膠原纖維大量增生，有個(gè)別菲薄的完全間隔形成(假小葉)；“”級(jí)，完全

5、間隔較厚，假小葉大量形成。 2.6 加味四逆散大、中、小劑量組中型膠原免疫組化觀察石蠟切片，免疫組化染色按試劑盒說明進(jìn)行，SP染色法，DAB法顯色。 型膠原含量以半定量的分級(jí)方式，根據(jù)顯色深淺，分布范圍及密度，分別劃為4個(gè)等級(jí)2。0級(jí)：陰性；1級(jí)：較少，著色淺，高倍鏡下明確陽性；2級(jí)：少量，著色中等，低倍鏡下明確陽性；3級(jí)：大量，條索狀或小片狀分布，著色深。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 加味四逆散大、中、小劑量對(duì)大鼠癥狀表現(xiàn)的影響 實(shí)驗(yàn)期間空白組大鼠一直精神狀態(tài)佳，皮毛光滑密澤，緊貼身體，大便正常，進(jìn)食無異常。所有造模組大鼠，則出現(xiàn)不同程度的精神不振，反應(yīng)遲鈍，飲食攝水明顯減少，糞便稀薄，皮毛凌亂，

6、缺乏光澤；治療組于治療3周后，大便逐漸干燥，進(jìn)食、攝水增加，精神狀態(tài)亦隨之好轉(zhuǎn)。其中中藥中劑量組和秋水仙堿組恢復(fù)較快，中藥大劑量組和小劑量組恢復(fù)較慢。 3.2 加味四逆散大、中、小劑量對(duì)肝纖維化組織病理學(xué)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，光鏡下觀察可見，空白對(duì)照組：HE染色見肝組織結(jié)構(gòu)清晰，膠原纖維染色僅于匯管區(qū)和中央靜脈有少許膠原纖維存在。模型組：HE染色見肝組織結(jié)構(gòu)欠清晰，匯管區(qū)及小葉內(nèi)中度炎性細(xì)胞浸潤；膠原纖維染色顯示匯管區(qū)大量膠原沉積，呈較寬的條索狀纖維深入肝小葉。各治療組大鼠僅見輕度匯管區(qū)炎癥，膠原纖維染色顯示纖維結(jié)締組織增生程度減輕，以中藥中劑量組和秋水仙堿組作用明顯，與模型組比較有顯著性差異(

7、P0.05)，中劑量組與大、小劑量組比較有顯著性差異(P0.05)，而小劑量組與大劑量組比較無顯著性差異(P0.05)，見表1。表1 肝纖維化各組大鼠肝臟病理組織學(xué)變化注：#與B組比較P0.05，與D、F組比較P0.05，與D組比較P0.05。 3.3 加味四逆散大、中、小劑量對(duì)肝纖維化大鼠型膠原的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后免疫組化結(jié)果顯示，中藥中劑量組肝臟型膠原沉積較大劑量及小劑量組為少，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P0.05)；而小劑量組稍優(yōu)于大劑量組，但二者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P0.05)，見表2。表2 大、中、小劑量組大鼠中型膠原的等級(jí)分布注：#與D、F組比較P0.05，與D組比較P0.05

8、。 4 小結(jié) 肝纖維化是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，目前，大量的文獻(xiàn)表明肝纖維化是可逆的病理過程37，因此阻斷延緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是治療肝硬化的關(guān)鍵。減少膠原在細(xì)胞內(nèi)的沉積可有效的阻止肝纖維化。加味四逆散已經(jīng)證明可有效地減少膠原在細(xì)胞內(nèi)的沉積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后動(dòng)物一般癥狀表現(xiàn)顯示，加味四逆散中劑量組大鼠活動(dòng)度較好，皮毛較密集光澤，飲水、進(jìn)食情況良好，糞便較干燥，而小劑量組及大劑量組較中劑量為差。免疫組化結(jié)果亦顯示加味四逆散中劑量組對(duì)型膠原的降解作用最強(qiáng)，與大、小劑量組相比有顯著性差異(P0.05)，提示該方用量并非越大越好，存在有效劑量范圍，其量效機(jī)制尚待進(jìn)一步探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1孫守才,劉光煒.加味四逆散治療慢性乙型肝炎肝纖維化的初步研究J.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,24(1):4647.2施光峰,翁心華,徐肇癑,等.秋水仙堿對(duì)血吸蟲病肝纖維化小鼠肝臟、型膠原蛋白表達(dá)的影響J.中華傳染病雜志,2000,18(3):180182.3李益忠,劉旭東,黃 彬,等.行氣活血飲治療慢性乙型肝炎肝纖維化42例J.吉林中醫(yī)藥,2005,25(7):28.4栗廣輝.軟肝消痞口服液抗肝纖維化的臨床研究J.吉林中醫(yī)藥,2003,23(7):911.5王勁松.肝纖溶顆粒治療肝纖維化30例J.長春中醫(yī)藥